CN104450927A - 定量检测csrp2基因表达的引物和探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了定量检测CSRP2基因表达的引物和探针及其应用。本发明提供了一种试剂盒，包括DNA分子甲，所述DNA分子甲由引物对甲和探针甲组成；所述引物对甲由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；所述探针甲为序列表中序列3所示的单链DNA分子。本发明提供的引物对和探针，可以用于定量检测CSRP2基因表达水平，从而用于肿瘤细胞系的辅助鉴定或肿瘤患者的辅助诊断，将在医学检测领域发挥重要的作用。

Description

定量检测CSRP2基因表达的引物和探针及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种定量检测CSRP2基因表达的引物和探针及其应用。
背景技术
CSRP2是CSRP基因家族(该家族其他基因包括CSRP1和CSRP3)的一个成员，CSRP基因家族编码的蛋白是一组LIM结构域蛋白，可能参与调节器官发育和细胞分化。
CSRP2蛋白包括两个富含半胱氨酸的氨基酸序列单元(即LIM结构域)，每个LIM结构域后跟着一个由12个氨基酸残基组成的氨基酸丰富的重复序列，两个LIM结构域之间还有一个核定位信号。CSRP2蛋白既存在于细胞核中，也存在于细胞质基于actin的细胞骨架中。CSRP2一方面在细胞核可以促进平滑肌细胞的分化，在血管平滑肌的表型转化以及气道平滑肌的发育中具有重要作用，另一方面在细胞浆参与细胞骨架重构。因此检测CSRP2蛋白的变化对于心脑血管和呼吸系统疾病具有重要意义。另外有研究表明CSRP2蛋白特异地表达于肝星状细胞并与其激活有关，随着肝星状细胞的激活CSRP2基因也同时转录激活，而在肝星状细胞其后的转分化为肌纤维母细胞的过程中，CSRP2又被抑制了。在平滑肌细胞和肝星状细胞中CSRP2基因的转录和蛋白的表达受到TGF-β的正向调节。
人CSRP2基因定位于12q21.这一区域以及在12q的邻近区域在一些肿瘤中容易受到影响。染色体12q可能含有1个或多个肿瘤抑制基因，而CSRP2基因所在的染色体区域是在多个实体肿瘤和血液肿瘤中观察到缺失或破坏的区域。实体肿瘤包括恶性和良性的间质肿瘤和性腺基质细胞肿瘤。鉴于CSRP2基因表达的抑制与纤维母细胞转化之间的显著关系，以及CSRP基因家族成员在细胞生长和分化中的作用，人CSRP2基因可能是一个在肿瘤中缺失或改变的基因。
目前无CSRP2在肿瘤、血液恶性疾病的相关研究。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括DNA分子甲，所述DNA分子甲由引物对甲和探针甲组成；
所述引物对甲由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；
所述探针甲为序列表中序列3所示的单链DNA分子。
上述试剂盒的功能为如下1)-3)中任一种：
1)辅助诊断肿瘤患者；
2)辅助鉴定肿瘤细胞系；
3)定量检测CSRP2基因的表达量。
上述试剂盒中，所述试剂盒还包括含有CSRP2基因或其片段的阳性对照质粒。
上述试剂盒中，所述阳性对照质粒为含有序列表中序列7所示的CSRP2基因片段的重组质粒。
上述试剂盒中，所述阳性对照质粒为将pMD18-T载体与序列表中序列7所示的CSRP2基因片段连接得到的重组质粒。
上述试剂盒中，所述DNA分子甲中，所述序列表中序列1所示的单链DNA分子、所述序列表中序列2所示的单链DNA分子、所述探针甲的摩尔比为40:40:25。
上述试剂盒中，所述肿瘤为淋巴肿瘤或血液肿瘤；
所述血液肿瘤患者具体为急性淋巴白血病患者，为急性淋巴白血病初诊患者或难治复发患者；
所述淋巴肿瘤为淋巴癌，具体为套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤或组织细胞性淋巴瘤；套细胞淋巴瘤细胞系为Maver、多发性骨髓瘤细胞系为IM9、组织细胞性淋巴瘤细胞系为U937；
所述血液肿瘤为急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病急变或急性早幼粒细胞白血病；急性淋巴细胞白血病细胞系为SUP-B15、Molt4、Jurkat、6T-CEM；慢性粒细胞白血病急变为MEG-01或K562；急性早幼粒细胞白血病为HL60。
上述试剂盒还包括DNA分子乙，所述DNA分子乙由引物对乙和探针乙组成，
所述引物对乙由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成；
所述探针乙为序列表中序列6所示的单链DNA分子。
上述试剂盒还包括内参对照质粒，所述内参对照质粒为含有序列表中序列8所示的ABL1基因片段的重组质粒。
上述试剂盒中，所述阳性对照质粒为将pMD18-T载体与序列表中序列8所示的ABL1基因片段连接得到的重组质粒。
上述试剂盒中，所述DNA分子乙中，所述序列表中序列4所示的单链DNA分子、所述序列表中序列5所示的单链DNA分子、所述探针乙的摩尔比为40:40:25。
上述DNA分子甲在制备试剂盒中的应用也是本发明保护的范围。
上述DNA分子甲和上述阳性对照质粒在制备试剂盒中的应用也是本发明保护的范围。
上述试剂盒的功能为如下1)-3)中任一种：
1)辅助诊断肿瘤患者；
2)辅助鉴定肿瘤细胞系；
3)定量检测CSRP2基因的表达量；
所述肿瘤为淋巴肿瘤或血液肿瘤；
所述血液肿瘤患者具体为急性淋巴白血病患者，为急性淋巴白血病初诊患者或难治复发患者；
所述淋巴肿瘤为淋巴癌，具体为套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤或组织细胞性淋巴瘤；套细胞淋巴瘤细胞系为Maver、多发性骨髓瘤细胞系为IM9、组织细胞性淋巴瘤细胞系为U937；
所述血液肿瘤为急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病急变或急性早幼粒细胞白血病；急性淋巴细胞白血病细胞系为SUP-B15、Molt4、Jurkat、6T-CEM；慢性粒细胞白血病急变为MEG-01或K562；急性早幼粒细胞白血病为HL60或NB4。
本发明提供的引物对和探针，可以用于定量检测CSRP2基因表达水平，从而用于肿瘤细胞系的辅助鉴定或肿瘤患者的辅助诊断，将在医学检测领域发挥重要的作用。
附图说明
图1为阳性对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线
图2为引物和探针检测细胞系的结果
图3为引物和探针检测急性淋巴血病患者的结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、检测CSRP2表达的特异引物和探针设计
针对CSRP2基因(NCBI基因库序列号：NM_001321.1，提交时间是2013.4.17，序列7)的设计特异性引物对甲(由上游引物CSRP2-FP和下游引物CSRP2-RP组成，扩增产物为76bp)和探针甲(探针CSRP2-probe)：
上游引物CSRP2-FP(序列1):5’-GTGATGGCAGGAGCTTCCA-3’；
下游引物CSRP2-RP(序列2):5’-GCCACTGTTGTGCTATCTAAATTTTT-3’；
探针CSRP2-probe:FAM-CGCTGCTGCTTTCTCTGCATGGTTT-BHQ(序列3)。
针对ABL1基因(内参基因；NCBI基因库序列号：NM_005157)设计的特异性引物对乙(由上游引物ABL1-F和下游引物ABL1-R组成，扩增产物为124bp)和探针乙(探针ABL1-T-probe)：
上游引物ABL1-F(序列表的序列4)：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’；
下游引物ABL1-R(序列表的序列5)：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’；
探针ABL1-T-probe(5’→3’):
FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT–TAMRA(核苷酸序列为序列表的序列6)。
分别合成特异性引物对甲、探针甲、特异性引物对乙和探针乙。
实施例2、引物检测阳性对照质粒的灵敏度检测
一、相关质粒的制备
1、阳性对照质粒(含有CSRP2基因片段的质粒)的制备
阳性对照质粒为将序列表中序列7所示的CSRP2基因插入pMD18-T质粒的ECORV酶切位点间得到的载体。
2、内参对照质粒(含有ABL基因片段的质粒)的制备
内参对照质粒为将序列8所示的ABL基因插入pMD18-T质粒的ECORV酶切位点间得到的载体。
3、阴性对照质粒
pMD18-T质粒。
二、检测阳性对照质粒的灵敏度检测
将上述一得到的阳性对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释得到各个稀释液(每微升分别含有106、105、104、103、102、101、100个拷贝的CSRP2基因片段)；将上述一得到的内参对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释得到各个稀释液(每微升分别含有106、105、104、103、102、101、100个拷贝的ABL基因片段)；通过测定吸光度值计算CSRP2基因片段或ABL基因片段的拷贝数)。
将各个阳性对照质粒稀释液采用实施例1得到的特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。将各个内参对照质粒采用实施例1得到的特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。
PCR反应体系(10μl)：上游引物0.4μM，下游引物0.4μM，探针0.25μM，2×TaqMan通用PCR公共体系5μl(ABI公司,美国)，质粒1μl；其余为去离子水。
PCR反应条件：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃1min，50个循环。
内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线(阈值为0.082)函数为log10ABL1＝(Ct-38.47)/-3.22，相关系数均达到0.99以上，检测内参基因的灵敏度达10个拷贝。
阳性对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线见图1(阈值为0.082),函数为log10CSRP2＝(Ct-36.985)/-3.418，相关系数均达到0.99以上，检测CSRP2基因片段的灵敏度至少为10个拷贝。
实施例3、检测细胞系及白血病患者
一、试剂盒的组装
试剂盒由如下组件组成：实施例1制备的针对CSRP2基因的特异性引物对甲和探针甲、针对ABL1基因的特异性引物对乙和探针乙；实施例2制备的阳性对照质粒和内参对照质粒。
二、应用步骤一的试剂盒检测细胞系
分别检测各个细胞系中的CSRP2基因的表达水平。每个细胞系样本皆重复检测3次。步骤如下：
1、提取各个细胞的总RNA，反转录为cDNA。
2、以cDNA为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR；以cDNA为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为阈值为0.082。
PCR反应体系和PCR反应条件同实施例2。
分别用阳性对照质粒和内参对照质粒制作标准曲线。对照标准曲线得到各细胞系中CSRP2基因和ABL1基因的拷贝数。以CSRP2基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示CSRP2基因的相对表达水平(％)。结果见表1和图2，CSRP2在健康人基因表达水平为0，在除伯基特淋巴瘤Raji细胞和急性早幼粒细胞白血病NB4细胞系外的其他淋巴肿瘤细胞和血液肿瘤细胞系中均表达或高表达。
表1血液肿瘤细胞系中CSRP2基因的表达水平
三、应用步骤一的试剂盒检测白急性淋巴血病患者
分别对若干急性淋巴白血病患者(志愿者，包括106例B-ALL初诊者、73例缓解者、26例难治复发者)及其他志愿者(35例健康人，正常组)进行检测。步骤如下：
1、用TRIzol试剂盒(购自美国Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取各个志愿者的骨髓标本的RNA(或外周血标本的RNA也可)，反转录为cDNA。
2、以cDNA为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR；以cDNA为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为阈值为0.082。
PCR反应体系和PCR反应条件同实施例2。
分别用阳性对照质粒和内参对照质粒制作标准曲线。对照标准曲线得到各患者中CSRP2基因和ABL1基因的拷贝数。以CSRP2基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示CSRP2基因的相对表达水平(％)。
结果见图3所示，可以看出，在35例健康人组成的正常组中CSRP2低表达，中位值0.04％(范围0-1.6％)；106例B-ALL初诊者组成的小组中CSRP2中位值为61.5％(范围0-740.5％)；73例缓解者组成的小组中CSRP2中位值0.3％(范围0-34.1％)，26例难治复发组组成的小组CSRP2中位值58.3％(范围0.6％-232.0％)。统计结果显示，初诊组及难治复发组的CSRP2水平与正常组相比显著升高(p<0.01)，治疗后达血液学缓解的标本CSRP2水平与初诊组、难治复发组相比显著下降(p<0.01)。提示CSRP2的水平可能用于预测疾病的发生和病程进展。
因此，可以确定，该引物对和探针可以用来辅助鉴定待测患者是否患有急性淋巴白血病或待测癌细胞是否为淋巴肿瘤细胞或血液肿瘤细胞。

Claims (10)

1.一种试剂盒，包括DNA分子甲，所述DNA分子甲由引物对甲和探针甲组成；
所述引物对甲由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；
所述探针甲为序列表中序列3所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的功能为如下1)-3)中任一种：
1)辅助诊断肿瘤患者；
2)辅助鉴定肿瘤细胞系；
3)定量检测CSRP2基因的表达量。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括含有CSRP2基因或其片段的阳性对照质粒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照质粒为含有序列表中序列7所示的CSRP2基因片段的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照质粒为将pMD18-T载体与序列表中序列7所示的CSRP2基因片段连接得到的重组质粒。
6.根据权利要求1-5所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA分子甲中，所述序列表中序列1所示的单链DNA分子、所述序列表中序列2所示的单链DNA分子、所述探针甲的摩尔比为40:40:25。
7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述肿瘤为淋巴肿瘤或血液肿瘤。
8.权利要求1-7中任一所述DNA分子甲在制备试剂盒中的应用。
9.权利要求1-7中任一所述DNA分子甲和权利要求3-7中任一所述阳性对照质粒在制备试剂盒中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述试剂盒的功能为如下1)-3)中任一种：
1)辅助诊断肿瘤患者；
2)辅助鉴定肿瘤细胞系；
3)定量检测CSRP2基因的表达量；
所述肿瘤为淋巴肿瘤或血液肿瘤。
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