CN104447913A - 功能化淫羊藿苷衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物,为丁二酸化淫羊藿苷和马来酸化淫羊藿苷,丁二酸化淫羊藿苷的结构式:马来酸化淫羊藿苷的结构式:
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料领域,涉及淫羊藿苷衍生物及其制备方法,以及淫羊藿苷衍生物在组织工程中的应用。
背景技术
组织工程是目前最具前景的缺损组织修复与功能重建技术,人工组织或前组织由以生物材料制备的支架和种子细胞构成,前者为后者提供粘附、增殖、分化和组织化的支撑环境,最终共同形成具有一定形状和功能的人工组织或前组织。但仅将种子细胞和支架复合,细胞生长缺乏有效调控,最终很难形成需要的目标组织,其主要原因在于支架材料本身对细胞分化和合成代谢的促进作用有限,而组织的形成需要有大量细胞因子参与。为此,有较多研究尝试将相关生长因子载入支架,通过其释放来调节种子细胞的分化和细胞外基质代谢,以期获得需要的组织。然而,载入生长因子虽可促进细胞增殖和分化,但组织形成的不同阶段所需生长因子的种类和浓度有所不同,同时,外源性生长因子存在价格昂贵、易降解失活、可能具有免疫原性,以及可能引入意想不到的外源性基因等诸多问题。
淫羊藿苷(icariin,简称Ica)是从药用植物淫羊藿(Herb Epimedii,简称HEP)中分离的一种性质较为稳定的黄酮,是HEP的主要活性成分。鉴于Ica的多种生物活性,将Ica装载到组织工程支架中,可提高支架材料的生物学功能。然而,当Ica的浓度大于1×10-5M时具有明显的细胞毒性,尽管Ica的溶解度较低,但在常温下获得的饱和溶液其浓度也达到2×10-5M,对细胞的生长有明显的抑制作用。为了提高Ica的生物利用度,避免非共价的载入方式存在的初始暴释以及载入量有限等问题,需要将Ica共价引入组织工程支架中,但Ica化学性质相对稳定,没有易于发生反应的活性基团,难以与其它物质以共价的形式反应结合,只能以非共价形式载入到支架材料中。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供水溶性好、细胞毒性低的功能化淫羊藿苷衍生物及其制备方法,通过功能化淫羊藿苷衍生物可将Ica以共价形式载入到组织工程支架材料中。本发明的再一目的是提供淫羊藿苷衍生物作为生物活性物质在组织工程中的应用。
本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物,为丁二酸化淫羊藿苷(简称Ica-SA)、马来酸化淫羊藿苷(简称Ica-MAL)。丁二酸化淫羊藿苷的结构式如下:
马来酸化淫羊藿苷的结构式如下:
上述结构式中,丁二酸残基或马来酸残基与淫羊藿苷分子结构式中的葡萄糖环和/或鼠李糖环上的任意一个或多个羟基相连,或与淫羊藿苷分子结构式中C5位的酚羟基相连。
上述功能化淫羊藿苷衍生物,所述丁二酸残基与淫羊藿苷分子的摩尔比为(2.8~1.1):1。
上述功能化淫羊藿苷衍生物,所述马来酸残基与淫羊藿苷分子的摩尔比为(2.7~1.4):1。
本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法,工艺步骤如下:
以淫羊藿苷和酸酐为原料,淫羊藿苷与酸酐的摩尔比为1:(2~11);将淫羊藿苷和酸酐分别溶解于极性溶剂中形成淫羊藿苷溶液和酸酐溶液,在搅拌下将酸酐溶液与淫羊藿苷溶液混合均匀,然后在25℃~40℃反应4小时~24小时,反应结束后除去极性溶剂和残留酸酐及其分解产物得反应产物,将反应产物冷冻干燥得到功能化淫羊藿苷衍生物;
所述溶解淫羊藿苷和溶解酸酐的极性溶剂体积相等,且溶解淫羊藿苷和溶解酸酐的极性溶剂的体积之和与淫羊藿苷的质量之比为1:(10~50),极性溶剂的体积的单位为L,淫羊藿苷的质量单位为g。
上述方法中,所述酸酐为丁二酸酐或马来酸酐。
上述方法中,所述的极性溶剂为吡啶、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃中的任一种。
上述方法中,反应结束后除去极性溶剂和残留酸酐及其分解产物的操作有以下两种:
1、第一种的操作
步骤依次如下:
(1)通过减压蒸馏或自然挥发除去反应液中大部分极性溶剂,得膏状物;
(2)将所得膏状物用有机萃取剂溶解后加入去离子水搅拌洗涤,然后静置分层并分离出水层得含产物的有机层,所述有机萃取剂的体积与淫羊藿苷的质量之比为1:(2~10),有机萃取剂体积的单位为L,淫羊藿苷质量的单位为g;
(3)将含产物的有机层加入去离子水搅拌洗涤后静置分层并分离出水层,对所得含产物的有机层重复上述操作,直至分离出的水层达到中性;
(4)通过减压蒸馏或自然挥发除去有机层中的有机萃取剂得产物。
上述操作中,所述有机萃取剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯中的任一种。
2、第二种的操作
第二种的操作是将所得反应液转移到透析袋中,用去离子水进行透析,所述透析袋的截流分子量为500道尔顿~800道尔顿。
实验表明:本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物具有良好的水溶性,与淫羊藿苷化合物相比,细胞毒性明显降低,即使在高浓度下,也没有表现出明显的毒副作用(见实施例8);将本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物加入支架材料中,可使淫羊藿苷以共价形式与支架材料结合,减缓淫羊藿苷的释放速率(见实施例9);将本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物的支架材料用于软骨细胞培养,能够保持软骨细胞表型,形成大量的细胞簇(见实施例10)。因此,本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物可作为调节种子细胞分化和细胞外基质代谢的生物活性物质在组织工程中应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、本发明将羧基,或羧基和双键活性基团引入到淫羊藿苷分子中形成了新型的功能化淫羊藿苷衍生物,增加了淫羊藿苷衍生物的类型。
2、由于本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物含有亲水性基团——羧基,与淫羊藿苷相比,水溶性更好,细胞毒性更低,在高浓度下没有表现出对细胞的明显毒性。
3、由于本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物含有羧基,或含有羧基和双键活性基团,因而提供了淫羊藿苷分子与支架材料化学接枝的位点,使得淫羊藿苷能够以共价的形式载入组织工程支架材料中,有利于其在体内的持续作用,提高了淫羊藿苷的生物利用度;同时,由于引入的羧基和/或双键基团与淫羊藿苷的结合位点主要是在其糖环上,不会改变药物本身的药理活性,在体内环境中,随着支架材料的降解以及酸酐与Ica之间形成的化学键的断裂会持续释放出药物分子并发挥其药理活性,拓宽了淫羊藿苷在生物医学工程领域的应用。
4、加入本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物的支架材料用于细胞培养,具有促进种子细胞分化和基质合成代谢的功能,且性质稳定。
5、本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物与现有载入支架的外源性生长因子相比,价格低廉,有利于推广使用。
6、本发明所述方法工艺简单,原料易于获取,所用设备为常规设备,因而有利于工业化生产。
附图说明
图1为淫羊藿苷(Ica)及其功能化衍生物的1H-NMR图谱,其中,图(a)为Ica的1H-NMR图谱;图(b)为Ica-SA的1H-NMR图谱,图(c)为Ica-MAL的1H-NMR图谱。
图2为不同浓度的淫羊藿苷(Ica)及其功能化衍生物作用于3T3细胞48小时后的细胞活性对比图。
图3为淫羊藿苷(Ica)及其功能化衍生物作用于3T3细胞48小时后的激光共聚焦照片(左)和显微镜照片(右)(A图为Ica,B图为Ica-SA,C图为Ica-MAL,摩尔浓度均为4×10-4M,D图为空白对照)。
图4为水凝胶支架在PBS溶液中浸泡14天后经AlCl3溶液染色后的照片(从左至右依次为HA水凝胶支架照片,HA/Ica-MAL水凝胶支架照片,HA/Ica水凝胶支架照片)。
图5为包裹在水凝胶支架中的兔软骨细胞体外培养9天后的激光共聚焦照片(A图为HA/Ica-MAL,水凝胶中Ica-MAL的摩尔浓度为3×10-4M;B图为HA水凝胶)。
图6为淫羊藿苷/壳聚糖/羟基磷灰石复合支架材料(Ica/CHS/HA)和载入本发明制备的功能化淫羊藿苷衍生物的复合支架材料(I ca-CHS/HA)的药物释放曲线。
图7为兔骨髓基质干细胞在复合支架材料表面培养的MTT结果。
图8为支架材料浸提液培养兔骨髓基质干细胞10天后茜素红S染色显微镜照片(a为CHS/HA,b为Ica-CHS/HA)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物及其制备方法和应用作进一步说明。
下述实施例中,淫羊藿苷购自南京替斯艾么中药技术研究所;丁二酸酐,马来酸酐均购自美国sigma公司;3T3细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;兔子软骨细胞为自提,具体方法为:将新生乳兔置于75%酒精中溺死,于无菌条件下剥离兔子四肢关节,将关节软骨剪下用胰蛋白酶消化0.5小时,吸弃胰蛋白酶,随后将软骨剪碎继续用ColⅡ酶消化该组织6小时得到细胞悬液,用细胞筛网过滤细胞悬液,离心悬液,重悬细胞并分皿,置于37℃、饱和湿度、5%(体积百分数)CO2的细胞培养箱中培养得到软骨细胞;甲基丙烯酸化透明质酸(HA-MA)为自制,具体方法为:透明质酸(HA)溶解于去离子水中,在4℃条件下逐渐滴加甲基丙烯酸酐(MA)反应12小时左右(HA与MA的质量体积比为3:14),用酒精沉淀产物后,重溶沉淀并透析除杂,冻干该溶液形成海绵状;DMEM培养基,α-培养基购自美国HyClone公司;胎牛血清为美国Life Technologies公司的Gibco胎牛血清;其余化学试剂均为市售分析纯。
实施例1
以淫羊藿苷和丁二酸酐为原料,淫羊藿苷和丁二酸酐的摩尔比为1:10.8。
称取淫羊藿苷200mg溶解于2ml吡啶中,称取丁二酸酐320mg溶解于2ml吡啶中,在搅拌下将丁二酸酐溶液滴加到淫羊藿苷溶液中混合均匀,在25℃下反应12小时,反应结束后于旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分溶剂,得到浅黄色膏状固体,将所得膏状固体用20mL有机萃取剂乙酸乙酯溶解,再加入50mL去离子水,在60℃条件下搅拌洗涤15min,静置分层后用分液漏斗分离出水层,再向含衍生物的乙酸乙酯层中加入50ml去离子水洗涤,重复操作数次,直至水层pH值趋于中性。然后转移出乙酸乙酯层并将乙酸乙酯置于超净台挥发后,用冷冻干燥机冷冻干燥48小时得浅黄色细小晶体。
采用氢核磁共振光谱(1H-NMR)和液质联用对该衍生物进行表征。此衍生物的1H-NMR图谱如图1(b)所示,液质联用进一步证实丁二酸残基引入到了淫羊藿苷分子中,得到功能化淫羊藿苷衍生物,其取代度为2.79,平均分子量为955.3。
实施例2
称取淫羊藿苷200mg溶解于2ml吡啶中,称取丁二酸酐320mg溶解于2ml吡啶中,在搅拌下将丁二酸酐溶液滴加到淫羊藿苷溶液中混合均匀,在25℃下反应4小时,反应结束后于旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分溶剂,得到浅黄色膏状固体,将所得膏状固体用20mL有机萃取剂乙酸乙酯溶解,再加入50mL去离子水,在60℃条件下搅拌洗涤15min,静置分层后用分液漏斗分离出水层,再向含衍生物的乙酸乙酯层中加入50ml去离子水洗涤,重复操作数次,直至水层pH值趋于中性。然后转移出乙酸乙酯层并将乙酸乙酯置于超净台挥发后,用冷冻干燥机冷冻干燥48小时得浅黄色细小晶体。采用氢核磁共振光谱(1H-NMR)和液质联用对该衍生物进行表征。此衍生物的1H-NMR图谱类似于图1(b),通过核磁氢谱计算出此化合物的取代度为2.4,平均分子量为918.5。
实施例3
以淫羊藿苷和丁二酸酐为原料,淫羊藿苷和丁二酸酐的摩尔比为1:10.8。
称取淫羊藿苷200mg溶解于2ml吡啶中,称取丁二酸酐320mg溶解于2ml吡啶中,在搅拌下将丁二酸酐溶液滴加到淫羊藿苷溶液中混合均匀,在40℃下搅拌反应4小时。反应结束后于超净台窗口挥发除去大部分溶剂,得到浅黄色膏状固体。将所得膏状固体用20mL有机萃取剂乙酸乙酯溶解,再加入50ml去离子水,在60℃条件下搅拌洗涤15min,静置分层后用分液漏斗分离出水相,再向含衍生物的乙酸乙酯层中加入去离子水50ml洗涤,重复操作数次,直至水相pH值趋于中性。然后转移出乙酸乙酯层并将乙酸乙酯减压蒸馏除去后,用冷冻干燥机冷冻干燥48小时得浅黄色细小晶体。采用氢核磁共振光谱(1H-NMR)和液质联用对该衍生物进行表征。此衍生物的1H-NMR图谱类似于图1(b),通过核磁氢谱计算出此化合物的取代度为2.42,平均分子量为918.5。
实施例4
以淫羊藿苷和丁二酸酐为原料,淫羊藿苷和丁二酸酐的摩尔比为1:5.4。
称取淫羊藿苷200mg溶解于10ml吡啶中,称取丁二酸酐160mg溶解于10ml吡啶中,在搅拌下将丁二酸酐溶液滴加到淫羊藿苷溶液中混合均匀,在25℃下搅拌反应24小时。反应结束后于超净台窗口挥发除去大部分溶剂,得到浅黄色膏状固体。将所得膏状固体用100mL有机萃取剂乙酸丙酯溶解,接着加入50ml去离子水在60℃条件下搅拌洗涤15min,静置分层后用分液漏斗分离出水相,再向含衍生物的乙酸丙酯层中加入去离子水50ml洗涤,重复操作数次,直至水相pH值趋于中性。转移出乙酸丙酯层并将乙酸丙酯减压蒸馏除去后,用冷冻干燥机冷冻干燥48小时得浅黄色细小晶体。采用氢核磁共振光谱(1H-NMR)和液质联用对该衍生物进行表征。此衍生物的1H-NMR图谱类似于图1(b),通过核磁氢谱计算出此化合物的取代度为1.82,平均分子量为858.7。
实施例5
以淫羊藿苷和丁二酸酐为原料,淫羊藿苷和丁二酸酐的摩尔比为1:2。
称取淫羊藿苷200mg溶解于10ml吡啶中,称取丁二酸酐60mg溶解于10ml吡啶中,在搅拌下将丁二酸酐溶液滴加到淫羊藿苷溶液中混合均匀,在25℃下搅拌反应24小时。反应结束后于超净台窗口挥发除去大部分溶剂,得到浅黄色膏状固体。将所得膏状固体用100mL有机萃取剂乙酸异戊酯溶解,接着加入50ml去离子水在60℃条件下搅拌洗涤15min,静置分层后用分液漏斗分离出水相,再向含衍生物的乙酸异戊酯层中加入去离子水50ml洗涤,重复操作数次,直至水相pH值趋于中性。转移出乙酸异戊酯层并将乙酸异戊酯置于超净台挥发后,用冷冻干燥机冷冻干燥48小时得浅黄色细小晶体。采用氢核磁共振光谱(1H-NMR)和液质联用对该衍生物进行表征。此衍生物的1H-NMR图谱类似于图1(b),通过核磁氢谱计算出此化合物的取代度为1.18,平均分子量为794.7。
实施例6
以淫羊藿苷和马来酸酐为原料,淫羊藿苷和马来酸酐的摩尔比为1:10。
称取淫羊藿200mg溶解于2ml吡啶中,称取马来酸酐320mg溶解于2ml甲酰胺中,在搅拌下将马来酸酐溶液滴加到淫羊藿苷溶液中混合均匀,在40℃下搅拌反应12小时。反应结束后得到棕黑色液体,将该棕黑色液体转移到透析袋中(透析袋截留分子量为500~800Da),置于去离子水中透析3天,期间每天更换四次去离子水。将透析过的液体用冷冻干燥机冷冻干燥48小时即得黄棕色晶体。采用氢核磁共振光谱(1H-NMR)和液质联用对该化合物进行表征。此化合物的1H-NMR图谱类似于图1(b),通过核磁氢谱计算出此化合物的取代度为2.68,平均分子量为944.3。
实施例7
以淫羊藿苷和马来酸酐为原料,淫羊藿苷和马来酸酐的摩尔比为1:8。
称取淫羊藿苷200mg溶解于2ml吡啶中,称取马来酸酐240mg溶解于2ml吡啶中,在搅拌下将马来酸酐溶液滴加到淫羊藿苷溶液中混合均匀,在40℃下搅拌反应4小时,反应结束后得到棕黑色液体。将该棕黑色液体转移到透析袋中(透析袋截留分子量为500~800Da),置于去离子水中透析3天,期间每天更换四次去离子水。再将透析得到的液体用冷冻干燥机冷冻干燥48小时得到黄棕色晶体。
采用氢核磁共振光谱(1H-NMR)和液质联用对该化合物进行表征。此化合物的1H-NMR图谱如图1(c)所示,液质联用进一步证实丁二酸残基引入到了淫羊藿苷分子中,得到功能化淫羊藿苷衍生物,其取代度为2.13,平均分子量为884.7。
实施例8
以淫羊藿苷和马来酸酐为原料,淫羊藿苷和马来酸酐的摩尔比为1:5.3。
称取淫羊藿苷200mg溶解于2ml吡啶中,称取马来酸酐160mg溶解于2ml N,N-二甲基甲酰胺中,在搅拌下将酸酐溶液滴加到淫羊藿苷溶液中混合均匀,在25℃下搅拌反应4小时,反应结束后得到棕黑色液体。将该棕黑色液体转移到透析袋中(透析袋截留分子量为500~800Da),置于去离子水中透析3天,期间每天更换四次去离子水。再将透析得到的液体用冷冻干燥机冷冻干燥48小时即得黄棕色晶体。采用氢核磁共振光谱(1H-NMR)和液质联用对该化合物进行表征。此化合物的1H-NMR图谱类于图1(c),通过核磁氢谱计算出此化合物的取代度为1.48,平均分子量为824.2。
实施例9:功能化淫羊藿苷衍生物的细胞毒性实验
将3T3细胞消化悬浮以后调整细胞浓度为6×104/ml,吸取细胞悬浮液滴加到96孔板中,每孔加悬浮液100μl,待细胞贴壁1天后,加入用带血清的DMEM培养基配制的不同浓度的Ica、Ica-SA(取代度为2.42,实施例2制备)、Ica-MAL(取代度为2.13,实施例6制备)溶液100μl(培养基中胎牛血清含量为10%(体积比),Ica、Ica-SA、Ica-MAL分为以下几组浓度:0、0.5×10-4M、1×10-4M、2×10-4M、4×10-4M)及含有胎牛血清的DMEM培养基100μl(空白对照)。培养48小时后用MTT法测定细胞活性,在570nm波长处测得的OD值归一化处理后的结果如图2所示。将浓度为4×10-4M的各组细胞培养48小时后取出用双醋酸荧光素-碘化丙啶(FDA/PI)混合溶液染色,在激光共聚焦显微镜下观察细胞生长活性与细胞形态,并用明场显微镜观察细胞形态,得到的显微照片如图3所示。结果显示:两种淫羊藿苷衍生物均具有良好的水溶性,在几组浓度下对正常细胞3T3细胞没有表现出明显的毒副作用;纯淫羊藿苷化合物在高浓度下对3T3细胞的生长有明显抑制作用,且在高浓度下有大量细小颗粒析出,见图3A。
实施例10:淫羊藿苷共价修饰的透明质酸水凝胶(HA/Ica-MAL)组织工程支架的制备
取9.0mg Ica-MAL(取代度为2.13,实施例6制备)溶解于10ml含有0.3%(质量体积比)I2959光引发剂的PBS溶液中,再取40mg甲基丙烯酸化透明质酸(HA-MA)溶解于2ml含有0.3%(质量体积比)I2959光引发剂的PBS溶液中,将上述两种溶液各取1ml混合均匀(其中,HA-MA浓度为1%(质量体积比),Ica-MAL浓度为5×10-4M),然后将混合溶液注入200μl模具中,置于紫外灯源下照射30s,即得HA/Ica-MAL水凝胶支架。
取9.0mg Ica溶解于10ml含有0.3%(质量体积比)I2959光引发剂的PBS溶液中,再取40mg甲基丙烯酸化透明质酸(HA-MA)溶解于2ml含有0.3%(质量体积比)I2959光引发剂的PBS溶液中,将上述两种溶液各取1ml混合均匀(其中,HA-MA浓度为1%(质量体积比),Ica浓度为5×10-4M),然后将混合溶液注入200μl模具中,置于紫外灯源下照射30s,即得HA/Ica水凝胶支架。
将HA/Ica-MAL水凝胶支架和HA/Ica水凝胶支架分别浸泡在PBS溶液中,隔天换液,14天后取出,分别浸泡于AlCl3溶液中15分钟后取出,其外观如图4所示。
从附图4可以看出,HA/Ica-MAL水凝胶支架有明显的黄色,HA/Ica水凝胶支架几乎变为无色透明。由于淫羊藿苷能够与Al3+作用生成黄色的配合物,因而实验表明:HA/Ica-MAL水凝胶支架中残存的药物(Ica)明显高于HA/Ica水凝胶支架,HA/Ica-MAL水凝胶支架中的药物(Ica)释放速率明显慢于HA/Ica水凝胶支架。
实施例11:HA/Ica-MAL水凝胶支架的细胞相容性和生物活性实验
取5.4mg Ica-MAL(取代度为2.13,实施例6制备)溶解于10ml含有0.3%(质量体积比)I2959光引发剂的PBS溶液(Ica-MAL的摩尔浓度为6×10-4M),滤器过滤除菌后备用。再取20mg紫外灭菌后的甲基丙烯酸化透明质酸溶解于2ml上述溶解有Ica-MAL的PBS溶液(HA-MA浓度为2%(质量体积比)),得到的液体与等体积软骨细胞悬液混合(细胞密度为2×107个/ml),混合均匀后低速离心去除气泡,注入200μl模具中,置于紫外灯源下正反照射30s,即形成包裹了软骨细胞的HA/Ica-MAL水凝胶构建物(Ica-MAL的最终摩尔浓度为3×10-4M)。
取20mg紫外灭菌后的HA-MA海绵溶解于2ml含有0.3%(质量体积比)I2959光引发剂的PBS溶液中,得到的液体与等体积软骨细胞悬液混合(细胞密度为2×107个/ml),混合均匀后低速离心去除气泡,注入200μl模具中,置于紫外灯源下正反照射30s,即形成包裹了软骨细胞的HA水凝胶构建物。
分别将两组水凝胶构建物置于含10%胎牛血清的α-培养基中并于37℃、饱和湿度、5%(体积比)CO2的细胞培养箱中培养,每3天更换一次培养基。于第9天时取出,用FDA/PI混合溶液染色,在激光共聚焦显微镜下观察细胞生长活性与细胞形态,激光共聚焦照片见图5。
从图5可以看出:HA/Ica-MAL水凝胶支架具有良好的细胞相容性,包裹的软骨细胞在培养过程中一直保持其圆形的表型,并逐渐呈现局部聚集和增殖状态,形成大量的细胞簇;HA水凝胶支架中的细胞团聚和增殖情况明显不如HA/Ica-MAL水凝胶支架。上述实验结果表明,在HA/Ica-MAL水凝胶支架中,持续释放的淫羊藿苷保持了其药理活性,不仅能够保持软骨细胞表型,而且具有促进软骨细胞分化和基质合成代谢的功能。因而,本发明所述功能化淫羊藿苷衍生物可作为调节种子细胞分化和细胞外基质代谢的生物活性物质在组织工程中应用。
实施例12淫羊藿苷共价修饰的壳聚糖/羟基磷灰石复合支架材料的制备
(1)原料溶液的配制
以壳聚糖、羟基磷灰石和丁二酸化淫羊藿苷为原料,壳聚糖与羟基磷灰石的质量之比为1:1,按照以下方法配制原料溶液:
在常压、室温下以体积浓度为0.7%的盐酸为溶剂配制壳聚糖溶液,盐酸的用量以壳聚糖在壳聚糖溶液中的浓度达到60mg/mL为限;
在常压、室温下将羟基磷灰石用去离子水或蒸馏水配制成12%w/v的浆料;
在常压、室温下将丁二酸化淫羊藿苷用0.2mol/L的氢氧化钠溶液配制成浓度为1×10-1mol/L的溶液;
所述丁二酸化淫羊藿苷选用的是由实施例2制备的。
(2)淫羊藿苷控释型壳聚糖/羟基磷灰石复合支架材料的制备
将配制好的壳聚糖溶液与羟基磷灰石浆料搅拌混合均匀得到混合浆料,壳聚糖溶液与羟基磷灰石浆料的体积比为2:1。在搅拌下向所得混合浆料中滴加丁二酸化淫羊藿苷溶液,滴加结束后搅拌均匀,丁二酸化淫羊藿苷溶液的滴加量为使其在混合浆料中的终浓度为1×10-3mol/L,然后加入交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺,加入的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和丁二酸化淫羊藿苷中的羧基三者物质的量之比为25:25:1,用氢氧化钠溶液调节pH至6,继续搅拌反应20min后将反应液离心去除气泡,注入24孔(每孔500ul)或48孔(每孔300ul)细胞培养板中,于常压、37℃环境中放置2h,得到凝胶状产物,将凝胶状产物在-80℃下冷冻48h后用冷冻干燥机冷冻干燥,得多孔支架材料,将所得多孔支架材料依次用0.5mol/L的碳酸氢钠溶液和去离子水洗涤至中性,再次冷冻干燥,得到淫羊藿苷控释型壳聚糖/羟基磷灰石复合支架材料;
所述丁二酸化淫羊藿苷的终浓度=(丁二酸化淫羊藿苷溶液的滴加体积×丁二酸化淫羊藿苷溶液的摩尔浓度)/(壳聚糖溶液的体积+羟基磷灰石浆料的体积)。
实施例13淫羊藿苷/壳聚糖/羟基磷灰石共混复合支架材料(Ica/CHS/HA)的制备
将丁二酸化淫羊藿苷溶液替换为淫羊藿苷溶液,按照实施例12的方法制备得到共混复合支架材料Ica/CHS/HA。
实施例14壳聚糖/羟基磷灰石复合支架材料(CHS/HA)的制备
不添加淫羊藿苷或丁二酸化淫羊藿苷,按照实施例12的方法制备得到CHS/HA复合支架材料。
实施例15复合支架的药物释放实验
将上述实施例12中注入到48孔板得到的Ica-CHS/HA与Ica/CHS/HA复合支架分别浸泡在2ml的0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,置于37℃恒温恒湿箱中,在预设的时间点,分别取出1.2ml浸泡液并补加相应体积的PBS,在360nm下测定取出的浸泡液的紫外吸收,计算出药物的累计释放百分数,结果见图6。
从图6中可以看出,相比于Ica/CHS/HA复合支架,Ica-CHS/HA复合支架具有明显的缓释效果,这是因为Ica-CHS/HA复合支架中的Ica是以共价方式载入,通过化学键合可使Ica缓慢释放。
实施例16细胞培养实验
选用上述实施例12中注入到24孔板得到的Ica-CHS/HA与CHS/HA复合支架材料分别依次用75%的酒精浸泡4h、PBS溶液洗涤、紫外灭菌过夜后,接种2×104个/ml的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)悬浮液于材料表面,培养基为α-MEM培养基、10%(v/v)的血清,培养1天、4天和7天后,在24孔板中加入5mg/ml的MTT溶液(100μl/孔),置于培养箱37℃避光孵育4h,再弃去上层液体,每孔加入1ml DMSO,振荡5min,将所得反应液取200μl加入96孔板,用酶标仪测量溶液在490nm的吸光度值,结果如图7。从图7中可以看出,Ica-CHS/HA复合支架相比于CHS/HA复合支架更有利于细胞的增殖,表明Ica-CHS/HA复合支架无毒性,相比于CHS/HA复合支架具有更好的细胞相容性。
选用上述实施例12中注入到24孔板得到的Ica-CHS/HA与CHS/HA复合支架材料,依次用75%的酒精浸泡4h、PBS溶液洗涤、紫外灭菌过夜后,加入24孔板中,再加入1ml成骨诱导培养基,37℃静置1天后取出浸提液,加入到接种有2×104个/ml的兔骨髓基质干细胞的24孔板中,每两天更换一次浸提液,并将此浸提液用来更换培养有骨髓基质干细胞的培养基,培养10天后,用Tris-Hcl缓冲液(pH=8.3)配制的茜素红S染色。图8为染色后的显微镜照片,从图8可以看出,与CHS/HA组相比,Ica-CHS/HA组有更多的钙沉积,表明制备的Ica-CHS/HA复合支架能够促进BMSCs向成骨方向分化。
Claims (10)
1.功能化淫羊藿苷衍生物,其特征在于结构式如下:
其中,丁二酸残基或马来酸残基与淫羊藿苷分子结构式中的葡萄糖环和/或鼠李糖环上的任意一个或多个羟基相连,或与淫羊藿苷分子结构式中C5位的酚羟基相连。
2.根据权利要求1所述功能化淫羊藿苷衍生物,其特征在于所述丁二酸残基与淫羊藿苷分子的摩尔比为(2.8~1.1):1。
3.根据权利要求1或2所述功能化淫羊藿苷衍生物,其特征在于所述马来酸残基与淫羊藿苷分子的摩尔比为(2.7~1.4):1。
4.一种功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法,其特征在于:
以淫羊藿苷和酸酐为原料,淫羊藿苷与酸酐的摩尔比为1:(2~11);将淫羊藿苷和酸酐分别溶解于极性溶剂中形成淫羊藿苷溶液和酸酐溶液,在搅拌下将酸酐溶液与淫羊藿苷溶液混合均匀,然后在25℃~40℃反应4小时~24小时,反应结束后除去极性溶剂和残留酸酐及其分解产物得反应产物,将反应产物冷冻干燥得到功能化淫羊藿苷衍生物;
所述溶解淫羊藿苷和溶解酸酐的极性溶剂体积相等,且溶解淫羊藿苷和溶解酸酐的极性溶剂的体积之和与淫羊藿苷的质量之比为1:(10~50),极性溶剂的体积的单位为L,淫羊藿苷的质量单位为g。
5.根据权利要求4所述功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法,其特征在于所述酸酐为丁二酸酐或马来酸酐。
6.根据权利要求4或5所述功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法,其特征在于所述的极性溶剂为吡啶、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃中的任一种。
7.根据权利要求4或5所述功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法,其特征在于反应结束后除去极性溶剂和残留酸酐及其分解产物的操作依次如下:
(1)通过减压蒸馏或自然挥发除去反应液中大部分极性溶剂,得膏状物;
(2)将所得膏状物用有机萃取剂溶解后加入去离子水搅拌洗涤,然后静置分层并分离出水层得含产物的有机层,所述有机萃取剂的体积与淫羊藿苷的质量之比为1:(2~10),有机萃取剂体积的单位为L,淫羊藿苷质量的单位为g;
(3)将含产物的有机层加入去离子水搅拌洗涤后静置分层并分离出水层,对所得含产物的有机层重复上述操作,直至分离出的水层达到中性;
(4)通过减压蒸馏或自然挥发除去有机层中的有机萃取剂得产物。
8.根据权利要求7所述功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法,其特征在于所述有机萃取剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯中的任一种。
9.根据权利要求4或5所述功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法,其特征在于反应结束后除去极性溶剂和残留酸酐及其分解产物的操作是:将所得反应液转移到透析袋中,用去离子水进行透析,所述透析袋的截流分子量为500道尔顿~800道尔顿。
10.权利要求1~3所述功能化淫羊藿苷衍生物作为调节种子细胞分化和细胞外基质代谢的生物活性物质在组织工程中的应用。
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