CN104434945A - 络氨酸磷酸酶激动剂在清除细胞和生物体内病原体中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及络氨酸磷酸酶激动剂在清除细胞和生物体内病原体中的应用。本发明通过建立LPS内毒素急性肺损伤的模型，予以络氨酸磷酸酶PTPN11激动剂对大鼠的病毒和细菌的清除作用测试，得到了络氨酸磷酸酶PTPN11的激活，通过Janus激酶2(简称JAK2)的激素样作用介导，可以明显增强生物体组织细胞对于感染性病毒或细菌类病原体进行的细胞膜内穴样内吞(caveolar mediated endocysis)，并通过相应机制作用下，由细胞胞内的泛素化和蛋白酶体机制，对于病原体组装蛋白进行水解清除，从而机体可以在感染早期及时清除病原体，避免过分激活免疫系统对于机体造成的附带损伤。

Description

络氨酸磷酸酶激动剂在清除细胞和生物体内病原体中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及络氨酸磷酸酶PTPN11激动剂在清除细胞和生物体的病原体中的应用。

背景技术

病毒和细菌感染是严重危害人类健康的主要急性疾病之一，随着老龄化社会的到来，目前全球病毒和细菌感染患者的患病率在不断增加，其中病毒和细菌感染性导致的急性呼吸系统损伤患者占感染性疾病的80％-95％左右。病毒和细菌感染性急性呼吸系统损伤患者，如果炎症状况情况控制不理想，病原体的清除不及时，造成细胞和组织的炎症反应过分放大，严重的时将会产生感染性休克，机体代谢紊乱，凝血机制的异常激活等状况，甚至出现多脏器衰竭导致患者的死亡。所以目前病毒和细菌感染性系统损伤及其并发症成为老年社会的医疗问题重要方面，严重危害人类健康，成为人类社会卫生领域的一个重大挑战。

病毒和细菌感染性损伤的目前主要以抗菌抗病毒治疗以及维持身体内环境稳定为主，而目前对于机体自身除免疫介导之外的病原体入侵及清除体系尚未有明确的研究，而自单细胞生物至今的复杂生物体为止，细胞对于外来病原体及异物的清除机制成为生物体自身防御体系的一部分并在生物体上得以长期保留。因此对细胞自身清除病原体功能的调节机制研究及其激动因子的寻找不仅对深入了解细胞和生物体组织清除病原体的正常防御机制有重要意义，而且对于病原体感染导致的急性损伤的预防和治疗也具有现实应用价值。

PTPN11属于络氨酸磷酸酶家族成员，络氨酸磷酸酶有112种该家族成员，PTP家族可分为三大类：酪氨酸特异性、双特异性和低分子量磷酸酶。酪氨酸特异性和低分子量磷酸酶主要作用于含磷酸化酪氨酸(pTyr)的蛋白质，除此之外，双特异性磷酸酶也作用于含磷酸化丝氨酸(pSer)或磷酸化苏氨酸(pThr)的蛋白质。某些双特异性磷酸酶还可水解磷酸化蛋白以外的底物。酪氨酸特异性磷酸酶可进一步分为两大类：以CD45、PTP为代表的受体样PTP和以PTPB1，SHP-2为代表的胞内PTP。前者含有一个胞外配体结合区、一个跨膜区和一个或两个PTP胞浆区。后者的结构包括一个单独的催化区和包括SH2在内的多种氨基端或羧基端延伸区，该区可能有靶向或调控功能。人类的PTPN11基因定位于第12号染色体(12q24)，基因大小为91kb，PTPN11基因组序列编码605个氨基酸，有5种亚型，络氨酸特异性磷酸酶(PTP1B)、双特异性磷酸酶(DSPs)、cdc25磷酸酶(Cdc25A)，肌管素相关磷酸酶(MTMR13)、低分子量蛋白磷酸酶(PTPase A)。PTPN11基因在各个组织中广泛表达，在细胞核、内质网、细胞骨架及细胞膜上均有表达，PTPN11编码的络氨酸特异性磷酸酶(PTP1B)参与了细胞的细胞膜内穴样内吞机制，在清除病原体和免疫介导方面发挥有重要作用。肺、心脏、脑及骨骼肌中表达丰度较高；在细胞中，PTPN11编码的PTPN1B主要位于细胞膜和胞浆以及细胞核中。该成员已有文献报道PTPN11的激活和JAK2激酶的激素样功能相关，参与调控细胞对于病毒和细菌等病原体的内吞和清除机制，PTPN11与PTPN1在作用上有较多的同源性。

在既往的研究中，通过PTPN11的激活增强caveolar mediated endocysis机制参与增强病毒和细菌清除过程尚未有文献报道，既往文献多以阻断caveolar mediated endocysis机制来减少病原体对于细胞的感染类研究居多。本研究发现通过PTPN11对于整合素和细胞骨架蛋白的磷酸化修饰作用，可以增强caveolar mediated endocysis介导的细胞内吞机制中，促进细胞对于胞外病原微生物的内吞，内吞的病原体经由JAK2介导的蛋白酶体或泛素化途径进行水解，在清除生物体病原体的同时，阻断由病原体诱导的免疫激活机制，避免过度的免疫激活造成的损伤。同时，该内吞机制同时受到温度相关性正相调控。

根据2004年Frank SJ的研究，PTPN11在直接转录PTP1B增强细胞内吞的同时，可以催化JAK2的去磷酸化反应，增强JAK2激酶的活性，从而强化JAK2的激素样作用，增强细胞膜内穴样内吞机制，既往研究证实PTPN家族基因发生变异功能丧失将导致严重的免疫功能紊乱，小鼠出现持续性炎症溃疡表现。

发明内容

本发明提供一种络氨酸磷酸酶激动剂在清除细胞和生物体内病原体中的应用。

本发明提供一种络氨酸磷酸酶激动剂在分离和制备治疗生物体病原体感染性疾病药物中的应用。

络氨酸磷酸酶激动剂在清除细胞和生物体的病原体中的应用。

作为优选，络氨酸磷酸酶激动剂包括以下化合物成分：连翘酯苷E、异连翘酯苷A、大黄素、连翘酯苷A、毛蕊花糖苷、戟马鞭草苷、马鞭草苷、连翘苷、3-羟基光甘草酚、牡荆苷。

其中：

连翘酯苷E的结构是：

异连翘酯苷A的结构是：

大黄素的结构是：

连翘酯苷A的结构是：

毛蕊花糖苷的结构是：

戟马鞭草苷的结构是：

马鞭草苷的结构是：

连翘苷的结构是：

3-羟基光甘草酚的结构是：

牡荆苷的结构是：

络氨酸磷酸酶激动剂在制备治疗生物体内感染性病原体药物中的应用。

作为优选，络氨酸磷酸酶激动剂(下称PTPN11激动剂)包括以下化合物成分：连翘酯苷E、异连翘酯苷A、大黄素、连翘酯苷A、毛蕊花糖苷、戟马鞭草苷、马鞭草苷、连翘苷、3-羟基光甘草酚、牡荆苷。

作为优选，病原体包括腺病毒科、流感病毒、甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝病毒、手足口病毒、疱疹病毒、黄病毒、多瘤病毒科、逆转录病毒、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌及非典型病原体。

本发明的有益效果是：

1、PTPN11激动剂(连翘酯苷E、异连翘酯苷A、大黄素、连翘酯苷A、毛蕊花糖苷、戟马鞭草苷、马鞭草苷、连翘苷、3-羟基光甘草酚、牡荆苷复合制剂)处理LPS诱导的急性肺损伤大鼠，予以分别第1、3、5、7天取大鼠肺组织，并观察组织炎症的病理情况，从图片可以看出PTPN11激动剂可以明显抑制LPS诱导大鼠的急性肺组织损伤反应，所以，PTPN11激动剂可以应用清除生物体感染的治疗。

2、PTPN11激动剂在抑制LPS诱导的肺组织炎症反应中效果明显。

3、PTPN11激动剂在临床上应用于生物体感染性疾病的治疗提供明确实验室证据。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例中PTPN11激动剂对于控制大鼠LPS诱导肺组织炎症反应的病理图片(HE染色)。

图2是本发明实施例中PTPN11激动剂对于大鼠LPS诱导肺组织白介素1-beta的免疫荧光成像(A生理盐水对照组，B：LPS模型组，C：PTPN11激动剂干预组，D：地塞米松治疗组)。

图3是本发明实施例中PTPN11激动剂对于LPS诱导肺损伤大鼠血清白介素1-beta水平的影响。

图4是本发明实施例中PTPN11激动剂对于LPS诱导肺损伤大鼠血清肿瘤坏死因子TNF-alpha水平的影响。

图5是本发明实施例中PTPN11激动剂对于在大鼠肺组织细胞膜穴样内吞机制通路的影响(IPA软件的分子信号通路分析)。

图6是本发明实施例中PTPN11激动剂的分离鉴定与制备方法。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实验所用到的大鼠模型为SPF(Specific pathogen Free)级SD(Sprague-Dawley)大鼠，雄性，8-10周龄，体重220-250g购自复旦大学医学院实验动物中心。

1、PTPN11激动剂对LPS诱导大鼠急性肺损伤的保护作用的病理学证据

通过对于大鼠肺组织HE常规病理染色检查，发现PTPN11激动剂可以明显降低大鼠的肺组织的炎症反应水平。具体见图1所示

2、PTPN11激动剂对于LPS诱导大鼠急性肺损伤的保护作用的血清学证据

通过免疫荧光测试显示大鼠肺组织的白介素1-beta，显示白介素1-beta主要表达于大鼠的肺泡上皮细胞的细胞膜及胞浆内，PTPN11激动剂干预组的白介素1-beta荧光显像明显下降，证实PTPN11激动剂可以明显抑制肺组织细胞分泌炎症因子白介素1-beta。具体见图2所示。通过对于大鼠血清炎症因子IL-1β.TNF-α的ELISA检测，与对照组相比，PTPN11激动剂干预可以明显降低大鼠的炎症因子水平，具体见图3、4所示

3、PTPN11激动剂对于LPS诱导大鼠急性肺损伤细胞的关键炎症基因-核因子NF-κB表达水平的影响

通过对于冰冻肺组织的NF-κB的mRNA进行RT-PCR检验，发现PTPN11激动剂可以明显下调核因子NF-κB的表达，具体见表1所示

表1：PTPN11激动剂对于LPS诱导肺损伤大鼠肺组织核因子NF-κB表达水平的影响

4、PTPN11激动剂对于LPS诱导大鼠急性肺损伤细胞保护作用的机制-细胞膜穴样内吞机制通路的影响。

通过对于PTPN11激动剂干预组大鼠肺组织和模型对照组进行蛋白质谱组学分析，发现PTPN11激动剂干预组的细胞膜穴样内吞机制有明显的上调(P值分别为0.0000127)，质谱分析发现细胞膜穴样内吞机制相关的蛋白Flotin、COP、PTP1B表达明显上调并伴有相应的磷酸化修饰。具体见图5所示

5、PTPN11激动剂的分离鉴定与制备方法：

对疏风解毒胶囊内容物采用70％乙醇提取，依次以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液分别上硅胶柱、聚酰胺柱及大孔树脂梯度洗脱，相同组分合并后，分别利用重结晶等方法，得到了10个化合物。并通过理化性质、HPLC及TLC对照品比对，其色谱行为相同，分离得到的化合物的结构。

具体的提取与分离方法如下：

取疏风解毒胶囊内容物，粉碎，用70％乙醇提取，提取液合并后40℃真空浓缩回收乙醇，将浓缩物分散到水中后。

分别用3倍体积的氯仿萃取4-5次，萃取液减压浓缩，浓缩物上硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，分部收集洗脱液，薄层层析(TLC)检测后，相同组分合并，得到2个组分，组分1经过多次重结晶最后得到化合物1；

水层再用乙酸乙酯萃取4-5次，萃取液减压浓缩回收乙酸乙酷，浓缩物用20％的乙醇溶解后上聚酰胺柱，用20％、40％、60％、80％、无水乙醇洗脱，分部收集，TLC跟踪检测，相同组分合并，得到4个组分(组分3、组分4、组分5、组分6)，分别多次重结晶得到化合物2-5；

水层再用水饱和正丁醇萃取4-5次，萃取液减压浓缩回收正丁醇，浓缩物用水稀释后取1/2上D101大孔树脂柱，用不同浓度乙醇洗脱，分部收集，TLC跟踪检测，相同组分合并，得到4个组分(组分7、组分8、组分9、组分10)，分别多次重结晶得到化合物6-9；

另1/2上AB-8树脂柱，用70％乙醇洗脱，收集，TLC跟踪检测，得到1个组分，多次重结晶得到化合物10。

用核磁共振(NMR)对化合物进行结构鉴定，分离纯化过程见图6。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (7)

1.络氨酸磷酸酶激动剂在清除细胞和生物体内病原体中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述络氨酸磷酸酶激动剂包括以下化合物成分：连翘酯苷E、异连翘酯苷A、大黄素、连翘酯苷A、毛蕊花糖苷、戟马鞭草苷、马鞭草苷、连翘苷、3-羟基光甘草酚或牡荆苷。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，

所述连翘酯苷E的结构是：

异连翘酯苷A的结构是：

大黄素的结构是：

连翘酯苷A的结构是：

毛蕊花糖苷的结构是：

戟马鞭草苷的结构是：

马鞭草苷的结构是：

连翘苷的结构是：

3-羟基光甘草酚的结构是：

牡荆苷的结构是：

4.络氨酸磷酸酶激动剂在制备治疗生物体内感染性病原体药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述络氨酸磷酸酶激动剂包括以下化合物成分：连翘酯苷E、异连翘酯苷A、大黄素、连翘酯苷A、毛蕊花糖苷、戟马鞭草苷、马鞭草苷、连翘苷、3-羟基光甘草酚或牡荆苷。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，

所述连翘酯苷E的结构是：

异连翘酯苷A的结构是：

大黄素的结构是：

连翘酯苷A的结构是：

毛蕊花糖苷的结构是：

戟马鞭草苷的结构是：

马鞭草苷的结构是：

连翘苷的结构是：

3-羟基光甘草酚的结构是：

牡荆苷的结构是：

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病原体包括腺病毒科、流感病毒、甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝病毒、手足口病毒、疱疹病毒、黄病毒、多瘤病毒科、逆转录病毒、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或非典型病原体。