CN104374883A - 斑马鱼在检测bbp生殖毒性中的应用及快速检测bbp生殖毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明生物技术领域，涉及一种检测邻苯二甲酸丁基苄酯（ButylbenzylPhthalate，BBP)的生殖毒性检测方法。具体涉及一种利用模式生物斑马鱼检测BBP生殖毒性检测方法。更具体的是涉及利用成体斑马鱼快速检测BBP对雄性生精能力和雌性产卵能力的方法。本发明的方法经实验结果显示，检测周期只需8天，短于现有文献报道的其它方法；检测BBP的生殖毒性的最低浓度为0.6mg.L^-1优于其它方法的检测浓度。

Description

斑马鱼在检测BBP生殖毒性中的应用及快速检测BBP生殖毒性的方法

技术领域

 本发明公开了斑马鱼在检测BBP生殖毒性中的应用及快速检测BBP生殖毒性的方法。

背景技术

1) BBP

邻苯二甲酸酯（PAEs）是一种广泛使用的聚氯乙烯增塑剂类化合物。近年来，发现它也是一类潜在的环境内分泌干扰物。作为增塑剂，由于PAEs与塑料主体结构之间不以化学键相结合，在使用过程中会不断从塑料中释放出来，污染环境。美国人类生殖危险评估中心（CERHR）通过综合评定提出与人类健康密切相关的9种PAEs， BBP就是其中的一种。目前的检测BBP类增塑剂的方法GC-MS、液相色谱-质谱联用（HPLC-MS），方法虽然基本可以满足常规检测要求，但是各种前处理手段繁琐，成本高昂，需要专业人员和专业设备较多而且该方法需要样品纯度高（不能检测环境中BBP）,所以应当探索前处理耗用成本低，灵敏度、重现性及易操作性均好的方法。研究还发现，BBP是具有明显雌激素生物效应的8种酞酸酯类中的一种，其应用广泛、难以降解成为备受关注的全球性环境污染物之一。邻苯二甲酸丁基苄酯（BBP）分子式为C₁₉H₂0O₄，分子量312.3。由于BBP在相关的产品中呈游离状态，因此可转移进入环境从而对大气、土壤、水体造成严重污染，并通过食物、呼吸、饮水和皮肤接触等各种途径进入人体，造成危害。BBP急性毒性较低，但较高剂量下易引起动物生殖系统。

2) 生殖毒性

指外来物质对雌性和雄性生殖系统，包括排卵、生精，从生殖细胞分化到整个细胞发育，也包括对胚胎细胞发育所致的损害，引起生化功能和结构的变化，影响繁殖能力，甚至累及后代。环境内分泌干扰物的污染及其对人类生育功能的危害，已经成为当今环境医学关注的热点，也直接关系着人类和自然的可持续发展。BBP作为一种环境污染物对生物生殖系统所造成的损害不容忽视。迄今为止，较多研究关注了BBP雄性生殖毒性。在胚胎期，生殖系统对BBP毒性比较敏感，因为胚胎期是人体各器官发育的重要时期。动物实验表明，胚胎期或者哺乳期暴露高剂量的BBP（>250 mg/d）会导致明显的生殖发育毒性包括：隐睾、尿道下裂、附属性腺萎缩及发育不全、睾丸损伤、精子生成减少、青春期发育推迟、肛殖距减小。

3) 斑马鱼

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio)是近年来应用越来越广泛的重要模式生物。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因同源性高，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，具有饲养成本低、体积小、发育周期短、体外受精、透明易观察、单次产卵数较高等特点。而与线虫和果蝇这样的模式生物相比，虽然后者也可用于大规模筛选，但并不能阐明高等生物特有的组织或器官发育和功能。目前，已有一系列论文报道影响斑马鱼胚胎发育的突变体的筛选及鉴定，揭开了斑马鱼广泛应用于与发育和疾病相关的基因功能分析的序幕。因此近年来斑马鱼已经发展成为人类疾病和毒理学研究得的良好的动物模型目前斑马鱼已被美国国家卫生研究院（NIH）列为继人和小鼠之后的第三大模式生物。目前，在美国及欧洲共有2000多家机构从事斑马鱼相关技术的基础和应用基础研究，并有9家斑马鱼新药筛选公司向全球范围提供商业化服务。近几年来，欧洲经济与合作发展组织(OECD)和日本的生殖毒理学家就采用斑马鱼作为检测水环境内分泌干扰物浓度的早期敏感对象，并取得积极成果。中国也已在2011将斑马鱼技术列入“重大新药创制专项”十二五计划。

4）毒理学检测模型

在毒理研究中，实验模型的选择一直是个难题，普通的动物模型如大鼠和小鼠存在着生长周期较长（8周以上），检测指标不确定，灵敏度差，样品纯度高且难以大规模研究等缺点，而单纯的细胞材料又很难再现体内的实际情况。斑马鱼模型现已广泛应用于包括急性毒性、发育毒性与致畸性、胚胎毒性、心血管毒性、肝毒性、神经毒性、肾毒性、行为毒性和生殖毒性等在内的一系列药物毒性评价中。2009年欧洲斑马鱼药物筛选技术服务公司Biobide（www.biobide.es）获得了美国食品与药品管理局（FDA）和欧洲药品评估局（EMEA）的GLP认证，标志着斑马鱼药物毒理学与安全性评价模型已经得到了欧美国家政府的正式认可。2013年4月8号，美国FDA在其官网刊文报道斑马鱼在药物早期毒性评价中的作用。斑马鱼的基因与人类基因相似度达到87%，这意味着在它身上得出的水质监测结果，多数情况下都适用于人类。

斑马鱼模型检测化合物毒理学案例中。用化合物处理斑马鱼，可观察到斑马鱼一系列的特异的组织器官发育异常，结合半致死率评价方法，并与哺乳动物的致畸作用进行比较，这样就可以对化合物毒性获得较为准确的评估。数据显示，斑马鱼药物评价系统识别非致畸物质成功率为75%，识别致畸物质成功率则高达100%。该评价系统的特异性（70%~ 80%）和敏感性（>80%）非常突出，优于小鼠或者大鼠等常规实验动物。报道还表明，阿斯利康等5家跨国医药巨头已经用斑马鱼进行先导化合物早期发育毒性评价，涉及了58种遴选的化合物（不包括BBP），整体的预测准确定超过80%,具有很高的可靠性和灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种低成本的快速检测二甲酸丁基苄酯生殖毒性的方法，更具体的，本发明涉及利用模式生物斑马鱼来快速检测二甲酸丁基苄酯生殖毒性。

模式生物斑马鱼在检测BBP生殖毒性中的应用，其是采用成体斑马鱼快速检测BBP对雄性斑马鱼生精能力、对雌性斑马鱼产卵能力。

一种快速检测BBP生殖毒性的方法，包括下述步骤：

1）斑马鱼的饲养；

2）将性成熟斑马鱼转移进行BBP暴露，然后检测BBP对于斑马鱼7天的急毒效应，求得BBP对斑马鱼7天的LC50；

3）检测BBP的生殖毒性，包括BBP对雄性斑马鱼精子生成能力的影响和BBP对雌性斑马鱼产卵能力的影响。

步骤1）采用AB系野生型斑马鱼作为实验对象，饲养4-6个月。

步骤2）进行BBP暴露时的BBP浓度为0-5mg.L^-1之间。

本发明生物技术领域，涉及一种检测邻苯二甲酸丁基苄酯（Butyl benzyl Phthalate，BBP)的生殖毒性检测方法。具体涉及一种利用模式生物斑马鱼检测BBP生殖毒性检测方法。更具体的是涉及利用成体斑马鱼快速检测BBP对雄性生精能力和雌性产卵能力的方法。本发明采用模式生物斑马鱼来快速检测BBP生殖毒性，检测周期只需8天，短于现有文献报道的其它方法；检测BBP的浓度范围在0.6-2.96 mg.L^-1之间，最优区间0.6-1.5mg.L^-1，检测BBP的生殖毒性的最低浓度为0.6 mg.L^-1，优于其它方法的检测浓度；检测一份样品的BBP成本测算低于50元/次，低于其它方法成本。本发明在利用AB斑马鱼检测BBP生殖毒性技术中，检测BBP的浓度范围在0.6-2.96 mg.L^-1之间，低于此浓度检测灵敏度受影响，而超过此浓度则会引起实验斑马鱼的死亡。

附图说明

图1为BBP对于雄性斑马鱼精子产生的影响。

图2为BBP对于雌性斑马鱼产卵的影响。

图3为斑马鱼置换实验BBP对于斑马鱼交配的影响。

图4为斑马鱼置换实验BBP对于斑马鱼交配的影响。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1

1.斑马鱼的饲养：1）AB 系野生型斑马鱼购自美国俄勒冈州立大学（Oregon State University， OR. USA）国际斑马鱼中心。成年斑马鱼饲养于2.5 L的鱼缸中，循环的系统水流经过鱼缸。每天成年斑马鱼给予盐水小虾（brine shrimp）喂食2次。盐水小虾由人工合成的海水孵化。在小鱼出生后2－16天，给予幼鱼人工饲料Hatchfry EncapsulonTM（Argent Chemical Laboratories, Redmond, WA, USA).喂食。鱼房恒温28.5 oC，光照和熄灯的时间为 14：10 小时；2）自来水经过活性碳过滤并经由反向渗透装置处理获得纯化水，而后在其中添加分析纯度的天然盐以合成符合美国环保署标准（U.S. Environmental Protection Agency Guideline， U.S. EPA, 1986）的淡水。合成的淡水经过充氧，以9 L/天的流速供应给每个鱼缸。自动监测仪 (YSI 5200 Recirculating System Monitor，Aquatic Habitats，FL，USA)持续监测系统水的温度（28℃），pH值（6.9-7.3），电导率（240），溶氧（6ppm）及氨浓度(小于2.0mg/L)等指标（按斑马鱼操作手册）。斑马鱼性成熟后，进行生殖毒性的检测。

2.检测BBP对于斑马鱼7天的急毒效应：按照周永欣和章宗涉（1989）的方法进行鱼类急性毒性实验。将性成熟斑马鱼转移到1 L的鱼缸中开始BBP暴露。暴露的剂量为0.00，2.45，2.75，3.05，3.35，3.65及3.95 mg.L^-1。每个鱼缸中随机放入20条鱼，每组有3个鱼缸。每24小时用新配置的BBP溶液换水一次。定时观察鱼的中毒症状并及时将死鱼捞出，记录鱼的死亡数量。BBP对斑马鱼7天急性半致死试验结果如表1所示。从表1中可以看出7天内随着BBP浓度的升高斑马鱼死亡率也随着升高。用SPSS13.0软件求得BBP对斑马鱼7天LC50为2.96 mg.L^-1。

表1、BBP对斑马鱼7天急性毒性实验

3. 检测BBP的生殖毒性：

1) BBP对精子生成的影响。BBP处理组（BBP浓度分别为0.6 mg.L^-1,0.9 mg.L^-1,1.2 mg.L^-1,1.5mg.L^-1）各随机选取10条雄鱼，在交配产卵前人工取精液。具体取法为先将雄鱼用Tricaine麻醉，将其置于柔软的吸水纸上，用干净的吸水纸吸干鱼体上特别是生殖孔附近的水份。而后使用手指或者小镊子沿躯干前腹部向后部轻轻挤压，此时可看见生殖孔出流出乳白色的精液。使用毛细吸管或加样枪吸取。吸出的精液溶于1％NaCO₃溶液中以阻止精子运动。然后吸取少量稀释的精液，加于改良牛鲍血细胞计数板中，在显微镜下统计精子计数。每条雄鱼的大致精液量也被记录下来。由于难以精确测定精液体积，我们采用3个标准来评判,分别是：体积 > 1 μL; 体积 < 1 μL以及无法取出精液。BBP暴露7天后，精液检查发现处理组（BBP浓度≥0.6 mg.L^-1）和对照组（BBP浓度为0）的精子密度并有显著差异(P< 0.05, 如图1，** 与BBP-0组相比P＜0.001,即差异有统计学意义)；

2) BBP对卵子生成的影响。BBP处理组（BBP浓度分别为0.6 mg.L^-1,0.9 mg.L^-1,1.2 mg.L^-1,1.5mg.L^-1）随机选取10条雌鱼，次日早上8点收集各缸鱼卵，统计个数。BBP暴露7天后，卵子检查发现BBP处理组（BBP浓度≥0.9 mg.L^-1）和对照组（BBP浓度为0）的卵子计数并有显著差异(P< 0.05, 如图2，*与BBP-0组相比P＜0.05,即差异有统计学意义)。

实施例2

为了进一步了解BBP暴露对雌鱼和雄鱼生殖功能分别的影响，我们设计了和对照组雌/雄鱼分别进行的置换交配实验。

a、斑马鱼的饲养：同实施例1。

b、检测BBP对于斑马鱼7天的急毒效应：同实施例1。

c、雌/雄鱼置换交配实验检测BBP的生殖毒性：BBP处理组（BBP浓度分别为0.6 mg.L^-1,0.9 mg.L^-1,1.2 mg.L^-1,1.5mg.L^-1）各随机选取有18条雄鱼以及各随机选取有18条雌鱼。每个BBP处理组的18条雄鱼被取出，代之以溶剂对照组（BBP浓度为0）的18条雄鱼，并让其与BBP处理组相应雌鱼交配。同样的替换也被应用于每个BBP处理组的雌鱼。次日8点收集鱼卵统计数量。检测精子和卵子方法同实施例1。

在雄鱼置换交配产卵实验中（BBP组雄鱼被对照组雄鱼代替），BBP浓度分别为0.6 mg.L^-1，0.9 mg.L^-1,1.2 mg.L^-1,1.5mg.L^-1的处理组雌鱼一次交配后平均受精卵数量显著低于对照组 (P< 0.05, 如图3，*与BBP-0组相比P＜0.05,即差异有统计学意义；** 与BBP-0组相比P＜0.001,即差异有统计学意义)；在雌鱼置换交配精子检测中（BBP组雌鱼被对照组雌鱼代替），BBP浓度分别为0.3 mg.L^-1，0.6 mg.L^-1，0.9 mg.L^-1,1.2 mg.L^-1,1.5mg.L^-1的处理组雄鱼一次交配后平均受精卵数量显著低于对照组 (P< 0.05, 如图4，** 与BBP-0组相比P＜0.001,即差异有统计学意义)。

Claims (4)

1.斑马鱼在检测BBP生殖毒性中的应用，其是采用成体斑马鱼快速检测BBP对雄性斑马鱼生精能力、对雌性斑马鱼产卵能力。

2.一种快速检测BBP生殖毒性的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1）斑马鱼的饲养；

2）将性成熟斑马鱼转移进行BBP暴露，然后检测BBP对于斑马鱼7天的急毒效应，求得BBP对斑马鱼7天的LC50；

3）检测BBP的生殖毒性，包括BBP对雄性斑马鱼精子生成能力的影响和BBP对雌性斑马鱼产卵能力的影响。

3.如权利要求2所述快速检测BBP生殖毒性的方法，其特征在于，步骤1）采用AB系野生型斑马鱼作为实验对象，饲养4-6个月。

4.如权利要求2所述快速检测BBP生殖毒性的方法，其特征在于，步骤2）进行BBP暴露时的BBP浓度为0-5mg.L^-1之间。