CN104345050A - 一种在黄绿光波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种在黄绿波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法。该方法包括以下步骤：a.使用淬灭的荧光素钠作为参考染料，其中以荧光素钠作为荧光染料；以碘离子（I-）作为淬灭剂；b.通过测量仪器获得该参考染料的时间分辨荧光光谱；以及c.以该时间分辨荧光光谱作为该测量仪器的仪器响应函数。其中荧光素钠的终浓度为200-800μM，碘离子（I-）的终浓度为8-12.2M，体系的pH值为pH≥9。与固体颗粒散射测量仪器响应函数的方法相比，利用本发明方法获得仪器响应函数避免了不同激发波长之间的颜色效应，提高了整个实验结果的准确性，并且避免了更换滤波片的麻烦。
Description
技术领域
本发明属于光学光谱测量领域，涉及时间分辨荧光仪器响应函数的测量方法，尤其涉及一种在黄绿光波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法。
背景技术
在时间分辨荧光光谱测量中，所测得的荧光衰减曲线实际上是仪器响应函数（InstrumentResponse Function，IRF）和理想时间衰减曲线的卷积。要获得理想时间衰减曲线，就需要去除仪器响应函数（IRF）所带来的影响。因此，仪器响应函数是否准确将直接影响到理想时间衰减曲线的测量准确性。通常，仪器响应函数是通过测量激发光的时域剖面图来获得的。瑞利光散射为这一测量提供了足够强度的信号，可以通过测量仪器对瑞利散射的响应来获得仪器响应函数。用这种方法获得仪器响应函数时，存在一些缺陷，比如只能将探测波长靠近激发波长位置处进行信号探测，然而，被激发的物质发出的荧光的波长相对于激发光的波长有一定的偏移，而且测量仪器如单色仪、光电倍增管或雪崩光电二极管都存在颜色效应，这将导致用这种方法得到的仪器响应函数出现系统误差。因此，人们期望一种新的能获得更精确的仪器响应函数的方法。
荧光素是一种常见的具有光致荧光特性的染料，因其具备消光系数高、量子产率大、以及吸收和发射带存在大量重叠区域等优点，作为一种单寿命的荧光染料被广泛应用在荧光光谱领域中（ZhengH,ZhanXQ,BianQN,et al.ChemCommun,2013,49(5):429-47，《化学通讯》；HolcovaV,SimaJ,DusekJ.Cent Eur J Chem,2013,11(2):200-4，《中欧化学杂志》），被用作测量时间分辨荧光仪器响应函数的参考染料。除了荧光素，罗丹明6G(Hanley QS,Subramaniam V,Arndt-Jovin DJ,et al.Cytometry,2001,43(4):248-60《细胞计数》)和玫瑰红(Szabelski M,Luchowski R,Gryczynski Z,et al.ChemPhysLett,2009,471(1-3):153-9，《化学物理快报》)也被用作测量时间分辨荧光仪器响应函数的参考染料。
荧光素钠较荧光素具有更高的荧光强度和更短的荧光寿命。另外，与罗丹明6G和玫瑰红的发射波长不同，荧光素钠的发射波长为黄绿光波段，与生物分子中应用广泛的绿色荧光蛋白（GFP）和黄色荧光蛋白（YFP）的发射波长范围一致。由于在样品发射波段来测量仪器响应函数，能提高整个实验结果的准确性，并且可避免更换滤光片的麻烦，因此，用荧光素钠的碱性溶液来获得仪器响应函数（IRF）是合适的，即非常适合用作测量仪器响应函数的参考燃料。尤其对于绿色和黄色荧光蛋白的研究，使用荧光素钠作为一种在黄绿光波段测量仪器响应函数的参考染料具有重要的参考价值。
如前所述，测量仪器测得的荧光衰减曲线是理想荧光衰减曲线和仪器响应函数的卷积。如果某种物质（荧光团）的荧光寿命非常小，以致于远小于仪器本身的响应时间，那么，测量测得的该物质的荧光衰减曲线数据基本上就可以作为该仪器装置的仪器响应函数，从而简单地通过测量该被测物质的荧光衰减曲线来快速地获得仪器响应函数。
有很多方法可以将荧光团寿命有效减小至皮秒量级，从而使其作为仪器响应函数的参考物质成为可能。碰撞淬灭(Lawrence WG,VanMarter TA,Nowlin ML,et al.J ChemPhys,1997,106(1):127-41《化学物理学报》)就是其中一种最简单可行的办法。
碰撞淬灭的淬灭机制是使处于激发态的荧光团与溶液中的淬灭剂发生碰撞导致荧光强度的减弱。通过改变染料中的淬灭剂的浓度可以改变荧光衰减过程。作为测量仪器响应函数的染料分子，碘化物淬灭的罗丹明6G的荧光寿命为50ps(Hanley QS,Subramaniam V,Arndt-JovinDJ,Jovin TM.2001.Cytometry43:248-60《细胞计数》；Harris JM,Lytle FE.1977.Review ofScientific Instruments48:1469-76《科学仪器评论》)；淬灭的赤藓红B的荧光寿命为25ps(Szabelski M,Ilijev D,Sarkar P,Luchowski R,Gryczynski Z,et al.2009.AppliedSpectroscopy63:363-8《应用光谱学》)，淬灭的LDS798的荧光寿命为24ps(Luchowski R,Gryczynski Z,Sarkar P,Borejdo J,Szabelski M,et al.2009.Rev SciInstrum80:033109《科学仪器综述》)。
发明内容
本发明的目的在于提出一种在黄绿光波段测量时间分辨荧光的仪器响应函数的方法。
本发明的方法中，使用淬灭的荧光素钠作为参考染料，其中以荧光素钠作为荧光染料；以碘离子（I-）作为淬灭剂；通过测量仪器获得所述荧光素纳的时间分辨荧光光谱；以及以所述的时间分辨荧光光谱作为所述测量仪器的仪器响应函数。
该参考染料中，所述荧光素钠的终浓度为200-800μM，所述碘离子（I-）的终浓度为8-12.2M，所述参考染料的pH值为pH≥9。
该参考染料的制备包括以下步骤：
a1.配制高浓度或饱和的碘化物溶液，称取一定质量的碘化物溶液并将其溶于所需pH值的pH缓冲液中，配制成高浓度或饱和的碘化物碱性溶液；
a2.配制高浓度或饱和的荧光素钠溶液，称取一定质量的荧光素钠溶液并将其溶于所需pH值的pH缓冲液中，配制成高浓度或饱和荧光素钠碱性溶液；以及
a3.将该碘化物碱性溶液和该荧光素钠碱性溶液按一定比例混合，使其满足该碘离子终浓度和该荧光素钠终浓度，以构成该参考染料。
该碘化物为碘化钠或碘化钾。
该pH缓冲液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液以及碳酸钠-氢氧化钠缓冲液中的任何一种。
该测量仪器为频率上转换时间分辨荧光装置或时间分辨单光子计数装置。
本发明与现有的仪器响应函数测量方法相比，具有如下有益效果：
⑴本发明在荧光发射波段来测量仪器响应函数，与采用固体颗粒的散射测量仪器响应函数相比，避免了不同激发波长之间的颜色效应，提高了整个实验结果的准确性，并且避免了更换滤波片的麻烦；
⑵本发明所选用的参考染料消光系数高、量子产率大、以及吸收和发射带存在大量重叠区域等优点，并且具有对酸碱环境比较敏感，在水中溶解度大的优点；
⑶本发明对时间分辨荧光仪器响应函数的测量适用于黄绿波段，这与生物分子中的绿色荧光蛋白（GFP）和黄色荧光蛋白（YFP）的发射波长一致。因此，本发明非常适于绿色和黄色荧光蛋白的研究；
⑷本发明与现有的用于时间分辨荧光仪器响应函数的参考染料相比具有更短的寿命（17ps），现有的碘化物淬灭的罗丹明6G的荧光寿命为50ps，淬灭的赤藓红B的荧光寿命为25ps，淬灭的LDS798的荧光寿命为24ps；
⑸本发明的参考染料体系成本低廉，易于制备。
附图说明
图1为本发明的参考染料为淬灭的荧光素钠的频率上转换时间分辨荧光光谱图；
图2为本发明的参考染料为淬灭的荧光素钠的TCSPC系统获得的时间分辨荧光光谱图；
图3为利用本发明方法获得的仪器响应函数对荧光素时间分辨荧光测量的光谱图；
图4为利用本发明方法获得的仪器响应函数对环形绿色荧光蛋白时间分辨荧光测量的光谱图；以及
图5为利用本发明方法获得的仪器响应函数对环形黄色荧光蛋白时间分辨荧光测量的光谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式做进一步详细的说明，但不应以此限制本发明的保护范围。
参考染料的配制
先准备好pH10的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液，秤取碘化钠（NaI）18.3g，用准备好的pH10的缓冲液定容至10mL，配制成12.2M（接近饱和）的NaI溶液；秤取荧光素钠1.91g，用准备好的pH10的缓冲液定容至100mL，配制成51.4mM的荧光素钠碱性溶液；量取配制好的12.2M的NaI（碘化钠）溶液1000μL，51.44mM的荧光素钠溶液10μL并混匀，得到的混合溶液即为用于测量时间分辨荧光的仪器响应函数的参考染料，其中作为淬灭剂的碘离子的终浓度为12.1M，作为荧光染料的荧光素钠的终浓度为510μM，参考染料体系的pH为10。
上述参考染料的配制中，碘化物为碘化钠。作为可选的实施方式，也可以为碘化钾。
上述参考染料的配制中，缓冲液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。作为可选的实施方式，也可以是甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液以及碳酸钠-氢氧化钠缓冲液中的任何一种。
参考染料寿命的测量
下面将描述对前述配制的参考染料进行寿命的测量。如前所述，参考染料为pH10的NaI-荧光素钠溶液，其中碘离子的终浓度为12.1M，荧光素钠的终浓度为510μM。采用频率上转换时间分辨荧光装置作为测量仪器，对上述参考染料的时间分辨进行测量，激发波长为475nm，探测波长选在315nm。该探测波长由参考染料520nm的荧光与800nm的探测光通过频率上转换得到，计算方式如下：vs＝ve+vd，v＝c/λ，其中vs、ve、vd分别为上转换信号频率、激发光频率、探测光频率，c为光速，λ为波长。通过测量，获得参考染料的时间分辨荧光光谱（即荧光衰减曲线），见图1。
接着，再获取前述频率上转换时间分辨荧光装置的仪器响应函数。该上转换时间分辨荧光装置的仪器响应函数由如下方式获得：以520nm激发光代替上述参考染料520nm的荧光，其它条件不变，测量上转换信号的时间分辨光谱，从而获得仪器响应函数，如图1中的小图所示。仪器响应函数的FWHM（半高全宽）为300fs。
如前所述，已获得参考染料的时间分辨荧光光谱以及探测仪器的仪器响应函数。测量仪器测得的荧光衰减曲线是理想荧光衰减曲线和仪器响应函数的卷积，可表示为 Isig(t)是指实验所测荧光强度衰减曲线，Ic是指理想的荧光衰减曲线，iIRF(t)是指仪器响应函数，表示卷积运算。理想衰减曲线的单指数模型可表示为：Ic＝A*exp(-t/τ)，A表示系数，τ表示荧光寿命，t表示时间。对上述参考染料的时间分辨荧光光谱数据Isig(t)用单指数迭代卷积重构进行拟合。
通过上述的拟合公式进行拟合，得到荧光的寿命为17ps。这里，由于荧光寿命（17ps）远大于测量仪器的仪器响应函数的半高全宽（300fs），因此，上述拟合方式拟合得到的荧光寿命是可靠准确的。
通过上述的测量可知，参考染料的寿命为17ps，比现有技术中碘化物淬灭的罗丹明6G的荧光寿命50ps，淬灭的赤藓红B的荧光寿命25ps以及淬灭的LDS798的荧光寿命24ps还要小，因此，利用本发明的参考染料可获得更精确的仪器响应函数。
仪器响应函数的获得及验证
下面是利用上述配制的参考染料在黄绿光波段测量时间分辨荧光的仪器响应函数的具体例子。
以上述方式配制的NaI-荧光素钠为参考染料利用TCSPC（时间分辨单光子计数）装置进行时间分辨荧光测量，其中碘离子的终浓度为12.1M，荧光素钠的终浓度为510μM，体系的pH为10。通过测量，获得上述参考染料的时间分辨荧光光谱。如图2所示，其半高全宽为190ps。该时间分辨荧光光谱即可作为该测量仪器TCSPC的仪器响应函数。
上述例子中采用TCSPC装置测量时间分辨荧光从而获得仪器响应函数，本领域的技术人员熟知，也可以采用其它测量仪器，例如频率上转换时间分辨荧光装置等。
接下来，利用通过本发明的方法获得的仪器响应函数对下述三种材料的时间分辨荧光的寿命进行拟合，以验证本发明方法获得的仪器响应函数的准确性。拟合的误差用拟合方差表示，即其中kt为有效的数据点数，对于TCSPC，由于每个数据点上的因变量都是高斯分布的，所以理想情况下，拟合方差应接近1。一般来说，拟合方差越接近于1，则误差越小，准确性越高。
一个验证的例子是，利用通过本发明的方法获得的仪器响应函数对荧光素的时间分辨荧光的寿命进行拟合。其中激发光为475nm，20MHz。其结果如图3所示，以NaI-荧光素钠的时间分辨光谱作为仪器响应函数（图中带三角的实线）对荧光素的时间分辨荧光光谱（图中带圈数据）进行拟合，拟合结果如图中不带三角的实线。其拟合寿命为5.52ns。拟合方差是1.09。一般来说，拟合方差越接近于1，则误差越小，准确性越高。
另一个验证的例子是，利用通过本发明的方法获得的仪器响应函数对环形绿色荧光蛋白的时间分辨荧光的寿命进行拟合。其中激发光为400nm，20MHz。其结果如图4所示，以NaI-荧光素钠的时间分辨光谱作为仪器响应函数（图中用三角形数据点表示）对环形绿色荧光蛋白的时间分辨荧光光谱（图中带圈数据）进行拟合，拟合结果如图中不带三角的实线。其拟合寿命为2.39ns。拟合方差是1.09。一般来说，拟合方差越接近于1，则误差越小，准确性越高。
再一个验证的例子是，利用通过本发明的方法获得的仪器响应函数对环形黄色荧光蛋白的时间分辨荧光的寿命进行拟合。其中激发光为490nm，20MHz。其结果如图5所示以NaI-荧光素钠的时间分辨光谱作为仪器响应函数（图中用三角形数据点表示）对环形黄色荧光蛋白的时间分辨荧光光谱（图中带圈数据）进行拟合，拟合结果如图中不带三角的实线。其拟合寿命为1.71ns。拟合方差是1.03。一般来说，拟合方差越接近于1，则误差越小，准确性越高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围。任何所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种变动与润饰，本发明保护范围应以权利要求书所界定的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种在黄绿波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
a．使用淬灭的荧光素钠作为参考染料，其中以荧光素钠作为荧光染料；以碘离子（I-）作为淬灭剂；
b．通过测量仪器获得所述参考染料的时间分辨荧光光谱；以及
c．以所述时间分辨荧光光谱作为所述测量仪器的仪器响应函数。
2.根据权利要求1所述的在黄绿波段测量时间分辨荧光的仪器响应函数的方法，其特征在于，所述参考染料中，所述荧光素钠的终浓度为200-800μM，所述碘离子（I-）的终浓度为8-12.2M，所述参考染料的pH值为pH≥9。
3.根据权利要求2所述的在黄绿波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法，其特征在于，所述参考染料的制备包括以下步骤：
a1.配制高浓度或饱和的碘化物溶液，称取一定质量的碘化物溶液并将其溶于所需pH值的pH缓冲液中，配制成高浓度或饱和的碘化物碱性溶液；
a2.配制高浓度或饱和的荧光素钠溶液，称取一定质量的荧光素钠溶液并将其溶于所需pH值的pH缓冲液中，配制成高浓度或饱和荧光素钠碱性溶液；以及
a3.将所述碘化物碱性溶液和所述荧光素钠碱性溶液按一定比例混合，使其满足所述碘离子终浓度和所述荧光素钠终浓度，以构成所述参考染料。
4.根据权利要求3所述的在黄绿波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法，其特征在于，所述的碘化物为碘化钠或碘化钾。
5.根据权利要求4所述的在黄绿波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法，其特征在于，所述pH缓冲液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液以及碳酸钠-氢氧化钠缓冲液中的任何一种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的在黄绿波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法，其特征在于，所述测量仪器为频率上转换时间分辨荧光装置。
7.根据权利要求1-5中的任一项所述的在黄绿波段测量时间分辨荧光仪器响应函数的方法，其特征在于，所述测量仪器为时间分辨单光子计数装置。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN110006932A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-07-12 | 中国科学院高能物理研究所 | K边成像方法 |
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