CN104311634A - 黄曲霉毒素b1的抗原模拟表位am-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,涉及黄曲霉素B1的抗原模拟表位,其氨基酸序列为WPLYYYPWSDGA。本发明黄曲霉素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的黄曲霉素B1标准品,并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于黄曲霉素B1的免疫学检测,该抗原模拟表位具有与天然黄曲霉素B1分子相似的免疫反应特性,效果非常好。减少了黄曲霉素B1对人体健康的危害,节约了成本,具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及黄曲霉毒素B1抗原模拟表位AM-1及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物,广泛存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中。AFB1对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时可导致肝癌甚至死亡,1993年被WHO的癌症研究机构划定为I类致癌物。因此,食品中AFB1的检测对于人类健康意义重大。
目前,检测食品中AFB1的方法主要有高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱及免疫学检测等方法,免疫学检测方法以其灵敏度高、检测方便、成本低廉等优势在AFB1的检测中得到了广泛的应用。然而,AFB1 全抗原的化学合成方法目前仍然存在着诸多弊端:1)作为全抗原的合成原料,AFB1标准品不仅具有极强的致癌毒性,而且价格昂贵,使得 AFB1 全抗原的制备成本高昂,限制了 AFB1 免疫学检测体系的规模化应用;2)AFB1 全抗原的化学合成制备过程繁杂,中间副产物多、从而造成全抗原的生产批次误差大、质量不均一,成为影响免疫学检测方法准确性的重要技术瓶颈;3)AFB1 全抗原的化学合成过程中,使用的有机试剂、中间产物及废水、废渣易对操作人员产生毒害并严重污染周边环境。 鉴于此,开展 AFB1 全抗原的无害化替代性制备研究,将其应用于免疫学检测体系,解决化学合成制备 AFB1 全抗原过程中所面临的强毒性、高成本、高污染、批间误差大等关键问题,不仅具有重要的理论价值,也有显著的应用前景。
本发明通过用噬菌体展示肽库技术,从肽库中筛选出能与靶分子(抗AFB1单克隆抗体)特异性结合的多肽(抗原模拟表位),该抗原模拟表位具有与天然AFB1分子相似的免疫反应特性,通过获得的AFB1抗原模拟表位,以代替价格昂贵且毒性强的AFB1标准品,并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测。
发明内容
本发明以抗AFB1单克隆抗体为靶分子,将靶分子固相包被于酶标板上,投入噬菌体随机展示十二肽库,分别进行亲和性竞争洗脱淘选,获得了能与抗AFB1抗体特异性结合的AFB1的抗原模拟表位,命名为AM-1,其氨基酸序列如下:
从噬菌体随机十二肽库中筛选的AFB1抗原模拟表位AM-1,其氨基酸序列为:WPLYYYPWSDGA
上述抗原模拟表位AM-1结构中,大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种,即W代表色氨酸残基,P代表脯氨酸残基,Y代表酪氨酸残基,S代表丝氨酸残基,D代表天冬氨酸残基,G代表甘氨酸残基,A代表丙氨酸残基。
本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列,其序列为:
GGCCTCTGTATTATTATCCTTGGTCTGATGGTCTGAT。
发明提及的AFB1抗原模拟表位AM-1可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有AFB1抗原模拟表位(多肽)的噬菌体,通过生物扩增的方式,大量繁殖生产展示有AFB1抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列,通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位的基因,通过克隆至表达载体,以多肽-融合蛋白的形式进行AFB1抗原模拟表位的大量制备。
本发明还涉及所述黄曲霉素B1抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
本发明黄曲霉素B1抗原模拟表位(WPLYYYPWSDGA)在应用时,可以把合成的模拟表位用于免疫学检测分析,将通过噬菌体扩增获得的展示有AFB1抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子直接用于分析检测,当然,也可以将AFB1抗原模拟表位从噬菌体上切下来代替AFB1标准品来进行免疫学检测分析。
还涉及黄曲霉素B1抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。
还涉及黄曲霉素B1抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。
前述黄曲霉素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的AFB1标准品,并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测,该抗原模拟表位具有与天然AFB1分子相似的免疫反应特性,效果非常好。
本发明的有益效果是:本发明黄曲霉素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的AFB1标准品,并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测,该抗原模拟表位具有与天然AFB1分子相似的免疫反应特性,效果非常好。减少了AFB1对人体健康的危害,节约了成本,具有很高的应用价值。
附图说明
图1 以AFB1抗原模拟表位AM-1建立的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围0.1-10 ng/mL,IC50为1.0 ng/mL。
具体实施方式
实施例1
1)AFB1抗原模拟表位的亲和性竞争淘选:具体方法为:用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗AFB1单克隆抗体,并以终浓度100 μg/mL 包被96孔酶标板,4℃孵育过夜。第二天用PBST (10mM PBS pH 7.4包含0.1% Tween-20 (v/v) ) 洗涤3次后,加入300 μl封闭液(3% BSA-PBS)37℃孵育1小时。1小时后弃封闭液,用PBST洗涤5次,每孔加入100 μl噬菌体肽库(噬菌体展示十二肽库,购自NEB公司,用PBS 10倍稀释噬菌体原液,约1.0×1011 pfu),37℃振荡反应1小时。弃去未结合的噬菌体,用PBST洗涤10次,结合上的噬菌体用500ng溶于10%的AFB1标准品进行竞争洗脱。取10 μl洗脱噬菌体测滴度,其余的用于感染20 mL生长至对数前期的E. coli ER2738菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体,并测定扩增后噬菌体的滴度。
2)在第二、第三、第四轮的淘选过程中,包被的抗AFB1单克隆抗体浓度分别为75 μg/mL、50 μg/mL、50 μg/mL,所用的PBST浓度为0.25%、0.25%、0.5%,封闭液为3%的OVA-PBS、BSA-PBS、OVA-PBS,其余步骤同上。
3)阳性噬菌体克隆的鉴定: 从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取20个噬菌体斑,进行噬菌体的扩增,采用间接酶联免疫吸附检测方法(Indirect Enzyme Linked immunoasorbent assay, I-ELISA)进行阳性噬菌体克隆的鉴定,具体方法为:首先,用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗AFB1单克隆抗体,2 μg/mL包被96孔酶标板,4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) )洗涤3次后,用含有4%脱脂奶粉的PBS进行封闭,37℃孵育1小时;投入100 μl噬菌体斑扩增液(1.0×1011 pfu),以原始噬菌体肽库作为阴性对照,37 ℃孵育0.5小时;加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 μL,37 ℃孵育0.5小时;加入100μL TMB底物液,避光显色5min,酶标仪(Thermo Scientific Multiskan FC)读取450 nm处的吸收值。选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。
3) AFB1抗原模拟表位AM-1的鉴定:采用间接竞争ELISA的方法进行AFB1抗原模拟表位的鉴定,具体方法为:用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗AFB1单克隆抗体,2 μg/mL包被酶标板,4℃孵育过夜;第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后,用含有4%脱脂奶粉的PBS进行封闭,37℃孵育0.5小时;投入50 μL经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆(1.0×1011 pfu)和50 μL AFB1标准品(浓度范围为0-100 ng/ml),37℃孵育0.5小时;加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100 μL,37℃孵育0.5小时;加入100μL TMB底物液,避光显色5min,读取OD450,能结合抗AFB1单克隆抗体,且能被AFB1标准品所阻断的噬菌体,鉴定为AFB1的抗原模拟表位。
实施例2. AFB1抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
将经过间接竞争ELISA鉴定展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体进行扩增,提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下:进行噬菌体扩增,在第一步离心后,将800 μL含噬菌体上清转入一新离心管。加入200 μL PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100 μL碘化物缓冲液 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaI),加入250 μlTE缓冲液(10mM Tria-Hcl(pH8.0),1 mM EDTA),加入等体积的无水乙醇,-20℃冰冻2小时,离心后再用70%乙醇洗涤沉淀(DNA测序模板)。沉淀最终重悬于20 μL灭菌水,取2 μL进行琼脂糖凝胶电泳分析;取5 μL噬菌体模板进行DNA测序,其-96 gIII 测序引物为:5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依据DNA测序结果及密码子表可获得AFB1抗原模拟表位的氨基酸序列。
实施例3. AFB1 抗原模拟表位AM-1作为竞争抗原在ELISA中的应用
(1) 样品提取
称取5g 样品(谷物及其相关食品),加入25 mL80 %的甲醇-PBS溶液,200 rpm振荡4分钟;将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后,取1 mL滤液加入4毫升 PBS(磷酸盐缓冲液,pH=7.2)
混匀后,即为样品提取液,待用。
(2)包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗AFB1单克隆抗体,2 μg/mL包被酶标板,4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后,用含有4%脱脂奶粉的PBS进行封闭,37℃孵育1小时后,用PBST洗板6次待用。
(3)标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条,每孔分别投入50 μL展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体(1.0×1011 pfu)和一系列不同浓度的50 μL AFB1标准品,37℃孵育0.5小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗,37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色,读取OD450。以AFB1浓度对数为横坐标,结合率(加入AFB1的孔的OD450/未加入AFB1的孔的OD450×100%)为纵坐标,建立间接竞争标准曲线。结果显示标准曲线呈S型,线性相关性较好,检测范围0.1-10 ng/mL,IC50为1.0 ng/mL(图1)。
(4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条,每孔分别投入50 μL展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体(1.0×1011 pfu)和待测样品提取液,37℃孵育0.5小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗,37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色,读取OD450,计算结合率,并根据标准曲线,倒推出样品中AFB1的含量。
实施例4. AFB1 抗原模拟表位作为固相抗原在ELISA中的应用
(1) 样品提取
称取5g 样品(谷物及其相关食品),加入25 mL 80 %的甲醇-PBS溶液,200 rpm振荡4分钟;将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后,取1 mL滤液加入4毫升 PBS(磷酸盐缓冲液,pH=7.4)
混匀后,即为样品提取液,待用。
(2)包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体(2.0×1011 pfu),100μL包被于酶标板,4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后,用含有4%脱脂奶粉的PBS进行封闭,37℃孵育1小时后,用PBST洗板6次待用。
(3)标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条,每孔分别投入50 μL抗AFB1单克隆抗体(0.5 ng/ml)和一系列不同浓度的50 μLAFB1标准品,37℃孵育0.5小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗,37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色,读取OD450。以AFB1浓度对数为横坐标,结合率(加入AFB1的孔的OD450/未加入AFB1的孔的OD450×100%)为纵坐标,建立间接竞争标准曲线。
(4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条,每孔分别投入50 μL抗AFB1单克隆抗体(0.5 ng/ml)和一系列不同浓度的50 μl AFB1标准品,37℃孵育0.5小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗,37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色,读取OD450。以AFB1浓度对数为横坐标,结合率(加入AFB1的孔的OD450/未加入AFB1的孔的OD450×100%)为纵坐标,建立间接竞争标准曲线
实施例5. AFB1 抗原模拟表位AM-1作为固相抗原在胶体金免疫层析分析中的应用
(1) 样品提取
称取5g 样品(谷物及其相关食品),加入25 mL 80 % 的甲醇-PBS溶液,200 rpm振荡4分钟;将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后,取1 mL滤液加入4毫升 PBS(磷酸盐缓冲液,pH=7.2)
混匀后,即为样品提取液,待用。
(2)噬菌体及控制线的点阵
用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体(2.0×1011 pfu),用点阵仪或微量移液器将噬菌体划线于硝酸纤维素膜上(孔径0.2-0.45微米),作为检测线;将0.5 mg/ml的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗,用点阵仪或微量移液划线于同一张硝酸纤维素膜上(位于检测线的上方,距离大于5毫米),作为控制线。
(3)胶体金标记AFB1抗体
将AFB1抗体逐滴加入胶体金溶液(pH=8.2)中,边滴边搅拌,30分钟后,取1% PEG加入上述溶液中,继续搅拌15分钟后加入十分之一体积的 10% BSA溶液,搅拌15分钟后,静置30分钟,离心后去上清,得到胶体金标记的AFB1抗体溶液。
(4)胶体金检测卡的组装
将胶体金标记的AFB1抗体点喷于胶金垫上(1.0 mg/L),将样品垫、胶金垫,点阵了检测线和控制线的硝酸纤维素膜和吸收纸进行组装,切成试纸条,装入检测卡中待用。
(5)样品的检测
将样品提取液加入样品垫中,静置10min,若样品中含有AFB1且超过胶体金检测试纸的检测阈值,则检测线区域不显色,而控制线区域显色;若样品中不含有AFB1且低于胶体金检测试纸的检测阈值,则检测线区域显色,控制线区域也显色。若控制线区域不显色,表明试纸条失效。
实施例5 AFB1抗原模拟表位AM-1的大量制备
(1)以噬菌体扩增的方式
将展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体加入至20 mL接种有ER 2738的培养物中,37 ℃220 rpm振荡培养4.5 h。将培养物转入另一离心管中,4 ℃ 8000 rpm离心10 min,将上清的上部80 %转入一新鲜管中,加入1/6体积的PEG/NaCl,4 ℃下静置3小时。4℃ 10000 rpm离心PEG/NaCL静置溶液 15 min。弃上清,短暂离心后吸去残留上清液。加入1mL PBS进行重悬,即为噬菌体扩增液。
(2)以AFB1抗原模拟表位-融合蛋白的方式进行制备
A. PCR扩增AFB1抗原模拟表位的外源编码基因
PCR 反应体系: (50 μL)
10 × PCR Buffer 5 μL
dNTP Mixture (each for 2.5 mM) 4 μL
M13KE insert extension primer (10 mM) 1 μL
-96 gIII sequencing primer (10 mM) 1 μL
噬菌体DNA模板 1 μL
Pyrobest DNA Polymerase 0.5 μL
灭菌ddH2O 37.5 μL
PCR 反应条件:
94℃ 5 min,
以下30 cycles: 94℃ 30 sec,55℃ 30 sec,72℃ 30sec, 72℃ 10 min。
采用 PCR 产物回收试剂盒纯化 PCR 产物,微量核酸定量仪定量。AFB1抗原模拟表位AM-1的编码基因序列为:GGCCTCTGTATTATTATCCTTGGTCTGATGGTCTGAT。
B. 外源编码基因及表达载体的双酶切
分别采用ACC65I和Eag I 酶对外源编码基因和表达载体(pMAl-pIII, NEB公司,可表达MBP融合蛋白)进行双酶切。
C. 酶切后产物的连接及转化
将质粒pMal-PIII 和目的片段以1∶10(摩尔比)混匀,于 16 ℃ 水浴连接 12 h, 取10 μL连接产物加至100 μL感受态细胞DH5α中,充分混匀。冰浴30 min后,42 ℃ 水浴热激90 s,立即冰浴5 min后补加800 μL LB液体培养液,37 ℃,200 rpm培养1 h,8000 rpm离心5 min,吸去上清留取约300 μL,涂布于LB-A固体(Amp)培养基中,37 ℃过夜培养,得到亚克隆阳性克隆。
D.克隆转化
将上述步骤得到的亚克隆用天根试剂盒提取目的质粒,取10μL至100 μL感受态细胞TB1中,充分混匀。冰浴30 min后,42 ℃ 水浴热激90 s,立即冰浴5 min后补加800 μL LB液体培养液,37 ℃,200 rpm培养45min,8000rpm离心5 min,吸去上清留取约300 μL,涂布于LB-A固体(Amp)培养基中,37 ℃过夜培养,得到阳性克隆阳性克隆。
E. AFB1抗原模拟表位-MBP融合蛋白的表达
将上述获得的阳性克隆子,从平板上挑一单菌落接种于5 mL LB-A,0.2%蔗糖中,37℃,220 r/min,振荡培养过夜,将过夜培养物按1 %接种量(v/v)接种于50 mL的LB-A,0.2 %蔗糖培养基中,分别接种3瓶,37℃,220 r/min振荡培养,当培养物细菌浓度OD600达到0.6时,向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L,220 r/min振荡培养,将诱导物(IPEG溶液)于4 ℃,4000 g,离心20 min收集菌体沉淀,弃上清。重悬细胞于400 mL 30 mM Tris-HCl,20%蔗糖,pH 8.0 (80 mL/g细胞湿重),加入EDTA至1 mM,室温下震荡5-10 min,8000 g,4℃,离心20 min,弃上清,沉淀重悬于400 ml预冷的5 mM MgSO4,冰上震荡10 min,8000 g,4℃,离心20 min,保留上清,向上清液中加入8 mL 1 M Tris-HCl, pH 7.4,获得AFB1抗原模拟表位-MBP融合蛋白。
SEQUENCE LISTING
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<130> 2014
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Trp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Pro Trp Ser Asp Gly Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcctctgta ttattatcct tggtctgatg gtctgat 37
Claims (7)
1.黄曲霉素B1的抗原模拟表位AM-1,其特征在于其氨基酸序列为WPLYYYPWSDGA。
2.编码权利要求1所述抗原模拟表位AM-1氨基酸序列的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的核苷酸,序列为:
GGCCTCTGTATTATTATCCTTGGTCTGATGGTCTGAT。
4.根据权利要求1所述抗原模拟表位的制备方法,其特征在于通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备;所述噬菌体扩增是指将展示有黄曲霉素B1抗原模拟表位的噬菌体,通过生物扩增的方式,大量繁殖生产展示有黄曲霉素B1抗原模拟表位的噬菌体粒子;所述化学合成指依据模拟表位模拟表位氨基酸序列,通过化学合成多肽的方式进行多肽合成;所述基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位的基因,通过克隆至表达载体,以多肽-融合蛋白的形式进行黄曲霉素B1抗原模拟表位的大量制备。
5.权利要求1所述抗原模拟表位AM-1在免疫学检测分析中的应用。
6.根据权利要求4所述应用,其特征在于黄曲霉素B1抗原模拟表位AM-1以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。
7.根据如权利要求4所述应用,其特征在于黄曲霉素B1抗原模拟表位AM-1作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。
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