CN104288151B - 姜黄素衍生物dimmo在制备自噬诱导剂中的应用 - Google Patents

姜黄素衍生物dimmo在制备自噬诱导剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种(3E，5E)‑1‑甲基‑3‑(3，4‑二甲氧基苯亚甲基)‑5‑(3‑吲哚亚甲基)‑哌啶‑4‑酮作为自噬诱导剂的应用。本发明实验中主要利用相关实验证明了(3E，5E)‑1‑甲基‑3‑(3，4‑二甲氧基苯亚甲基)‑5‑(3‑吲哚亚甲基)‑哌啶‑4‑酮在诱导A549细胞或血管内皮细胞自噬中的应用。本发明通过倒置相差显微镜观察细胞形态学变化实验、荧光显微镜观察细胞内酸性小泡聚集实验、蛋白质免疫杂交印迹实验充分证明了(3E，5E)‑1‑甲基‑3‑(3，4‑二甲氧基苯亚甲基)‑5‑(3‑吲哚亚甲基)‑哌啶‑4‑酮在诱导A549细胞和血管内皮细胞中的作用。

Description

姜黄素衍生物DIMMO在制备自噬诱导剂中的应用
一、技术领域：
本发明涉及一种姜黄素衍生物的应用，特别是涉及一种姜黄素衍生物DIMMO在制备自噬诱导剂中的应用。姜黄素衍生物DIMMO即(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮((3E,5E)-3-(3,4-dimethoxybenzylidene)-5-[(1H-indol-3-yl)methylene]-1-methylpiperidin-4-one，简称DIMMO)。
二、背景技术：
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮简称DIMMO，其结构式为：
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮的分子式为C24H24N2O3，分子量(M)为388.46。
姜黄是一种传统中药材，是从姜科、天南星科类的植物根茎中提取的一种二酮类化学成分。姜黄素则是从姜黄中提取的一类酚类色素，是姜黄的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和降血脂等作用。有报道称姜黄素能够有效抑制人子宫内膜癌细胞(HEC1B)的增殖，并且可以引起细胞凋亡。其诱导凋亡的机制是将细胞周期阻滞在G2/M期。但姜黄素本身水溶性差，生物利用率较低，限制其广泛应用。
自噬(autophagy)是存在于真核细胞内的一种普遍生理现象，由Ashford和Porter在1962年发现并提出，自发现以来受到越来越多科研工作者的关注。自噬分为三类：巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)及分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CAM)，这里主要讨论巨自噬(以下简称“自噬”)。在自噬研究中，寻找能够有效诱导细胞自噬的化学小分子至关重要。
根据检索，关于姜黄素及姜黄素衍生物的研究以抗肿瘤居多。例如：1、申请号为201010183509.6、名称为“苯丁酰基姜黄素衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用”的发明专利，该专利公开了姜黄素衍生物在抑制肝癌中的作用。2、申请号为201110201683.3、名称为“姜黄素在制备甲状腺癌治疗剂中的应用”的发明专利，该专利公开了姜黄素可以杀伤甲状腺癌细胞并且对正常甲状腺细胞影响较小。3、申请号为201110435234.5，名称为“姜黄素衍生物C2在抗结肠癌药物中的应用”的发明专利，该专利公开了一种姜黄素衍生物比母本姜黄素本身稳定，亲脂性更强；同时，姜黄素衍生物C2与母本姜黄素相比对结肠癌细胞具有更强的杀伤毒性，对正常结肠细胞的杀伤作用较小，这为姜黄素衍生物被开发成新的抗结肠癌药物提供了理论基础。
目前，仅有研究表明姜黄素能够诱导自噬，对于姜黄素衍生物诱导细胞自噬的报道甚少。
三、发明内容：
本发明要解决的技术问题是：提供一种(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在制备自噬诱导剂中的应用。本发明提供的一种自噬诱导剂，在癌细胞和正常细胞中均有明显效果。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在制备自噬诱导剂中的应用。
根据上述的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在制备自噬诱导剂中的应用，所述(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在诱导A549细胞或血管内皮细胞自噬中的应用。
根据上述的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在制备自噬诱导剂中的应用，所述(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在诱导A549细胞或血管内皮细胞自噬中应用的有效浓度为10μM～40μM。
本发明利用的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮(DIMMO)已有论文公开其制备方法。该论文的详细信息：期刊名为JOURNAL OFCHEMICAL RESEARCH，发表年份为2012年2月(February2012)，题目为“Synthesis andbiological evaluation of curcumin analogues having a piperidone core aspotential antioxidant agents”；作者为Jian Wang,Gangchun Sun*,Zhicheng Li*,Wenpeng Mai and Jingxi Xie(*代表通讯作者)；卷期为Volume 36,Number 2；页码为pp.63-65(3)。
实验证明：
下面结合(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮的药理实验及结果，证明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮诱导细胞自噬的效果，即在制备自噬诱导剂中的应用。
血管内皮细胞及A549细胞的制备：以常规方法培养血管内皮细胞及A549细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的血管内皮细胞及A549细胞备用。
结合细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验，以观察(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮诱导细胞自噬的效果。
实验1、倒置相差显微镜观察细胞形态：
实验方法：
1)细胞接种：将细胞按一定密度传到24孔板中；
2)加药：种板24h后，吸去旧培养液，每次采用1mL、1×PBS洗2遍；
3)24孔板中每孔分别加入1mL浓度为1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮药物溶液；
4)加药处理后置于倒置相差显微镜下观察细胞形态，并拍照。
按下列实验分组处理血管内皮细胞，倒置相差显微镜下观察细胞形态。
溶剂对照组：40μM的二甲基亚砜(DMSO)孵育细胞0.5、1、3、6小时，细胞形态正常。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮处理组：分别用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮孵育细胞0.5、1、3、6、24小时，细胞出现时间和浓度依赖性的空泡化。
按下列实验分组处理A549细胞，倒置相差显微镜下观察细胞形态。
溶剂对照组：40μM的二甲基亚砜(DMSO)孵育细胞3、6、12或24小时，细胞形态正常。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮处理组：分别用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮孵育A549细胞3、6、12或24小时，与对照组相比，细胞趋圆变亮。
实验结果显示：用不同浓度的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮处理A549细胞3、6、12、或24小时，细胞明显产生空泡化，并呈时间和浓度的依赖性，同时细胞在高浓度时细胞趋圆变亮(详见附图1)。不同浓度的姜黄素衍生物(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮处理血管内皮细胞0.5、1、3、6、24小时，相比对照组细胞出现时间和浓度依赖的明显空泡化，引起细胞自噬(详见附图2)。
实验2、荧光显微镜观察吖啶橙染色后观察细胞酸性小泡聚集：
实验方法：
1)接种细胞及加药处理同实验1；
2)加药处理时间结束后弃各孔中原有培养液，采用700μL、1×PBS洗细胞2次；
3)加入1×吖啶橙染液700μL染色40s；
4)时间到，弃去吖啶橙染液，1×PBS清洗细胞2次；
5)加入1×PBS 700μL，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照；
6)先在白光下找到细胞，然后换为蓝光，在蓝光激发下细胞核为绿色，酸性膜泡为红色；
7)PS处理和分析实验结果。
按下列实验分组处理血管内皮细胞，吖啶橙染色后荧光显微镜下观察酸性小泡聚集。
溶剂对照组：40μM的二甲基亚砜(DMSO)孵育细胞0.5、1、3、6小时，未观察到明显的酸性小泡聚集。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮处理组：分别用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮孵育细胞0.5、1、3、6、24小时，吖啶橙染色后荧光显微镜下观察到明显的酸性小泡聚集且呈浓度和时间依赖性。
按照实验1中实验分组处理A549细胞3、6、12或24小时，吖啶橙染色40秒，激光扫描荧光显微镜下观察细胞酸性小泡聚集情况。
实验结果显示：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮显著诱导了细胞内酸性小泡的聚集，并且呈现浓度和时间的依赖性(详见附图3、4)。
实验3、蛋白质印迹法检测LC3蛋白表达量变化：
细胞总蛋白提取：
1)取出细胞，弃培养液，加入4℃预冷的PBS清洗两次；
2)将培养皿内PBS吸干，每个小皿加入50μL蛋白裂解液；
3)冰上裂解10min；
4)用细胞刮将裂解后的细胞刮下，转移至0.5mL离心管中；
5)100℃变性5min；
6)取出5μL测蛋白浓度，其余分装后-20℃保存。
Bradford比色法测定总蛋白浓度：
1)取6只5mL小试管，分别加入标准蛋白BSA：0、3、6、9、12和15μg，加蒸馏水补足到100μL；
2)取2uL待测样品，加水补足到100μL；
3)每管加入1.9mL考马斯亮蓝(G-250)染料溶液，振荡混匀；
4)加入96孔板，根据情况每组4个平行以上，每孔100μL；
5)酶标仪检测590nm的吸光值(以含0μg BSA的一组孔调零)；
6)利用Excel软件绘出标准曲线，相关系数在0.96以上可用；
7)根据标准曲线，确定待测样品的浓度。
蛋白质印迹法：
1)制胶：15％分离胶，5％浓缩胶；
2)蛋白样品100℃变性5min，上样10μg；
3)恒压60v进胶，当溴酚蓝/兰前沿刚进入分离胶后，恒压100v跑胶；
4)据目标蛋白分子量将胶进行适当剪切；
5)用转移槽恒流转膜，LC3用0.22μm孔径PVDF膜转1.5h，内参用0.45μm孔径PVDF膜转3h；
6)用含8％脱脂奶粉的PBST溶液在室温下封闭1h；
7)用一抗稀释液稀释目的蛋白的单克隆一抗，一抗应用液与相应的PVDF膜在4℃孵育过夜；
8)用PBST溶液浸泡膜3次，每次10min；
9)用PBS缓冲液浸泡膜1次，10min；
10)用PBS缓冲液稀释二抗(1：5000)，室温孵育1h；
11)用PBST缓冲液浸泡膜3次，每次10min；
12)用PBS缓冲液浸泡膜1次，10min；
13)用ECL显色法在暗盒中显色；
14)处理并分析结果。
按下列实验分组处理血管内皮细胞，提取总蛋白，蛋白质印迹法检测LC3蛋白表达情况。
溶剂对照组：40μM的二甲基亚砜(DMSO)每个小皿加3mL孵育细胞1小时。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮处理组：分别用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮每个小皿加3mL孵育血管内皮细胞1小时。
按下列实验分组处理A549细胞，提取总蛋白，蛋白质印迹法检测LC3蛋白表达情况。
溶剂对照组：40μM的二甲基亚砜(DMSO)每个小皿加3mL孵育细胞24小时。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮处理组：分别用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮每个小皿加3mL孵育A549细胞24小时。
实验结果显示：处理组细胞中LC3蛋白表达随浓度增多明显增多，细胞出现了自噬现象(详见附图5、6)。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在诱导A549细胞和血管内皮细胞中具有的明显作用，为制备自噬诱导剂的开发提供了诱人前景。
四、附图说明：
图1是倒置相差显微镜下，溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组处理3、6、12、24小时后的非小细胞肿瘤A549细胞。
图1中：A(3小时)、G(6小时)、M(12小时)、S(24小时)为溶剂对照组；B(3小时)、H(6小时)、N(12小时)、T(24小时)为1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；C(3小时)、I(6小时)、O(12小时)、U(24小时)为5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；D(3小时)、J(6小时)、P(12小时)、V(24小时)为10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；E(3小时)、K(6小时)、Q(12小时)、W(24小时)为20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；F(3小时)、L(6小时)、R(12小时)、X(24小时)为40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
图2是倒置相差显微镜下，溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组处理0.5、1、3、6、24小时后的血管内皮细胞。
图2中：A(0.5小时)、G(1小时)、M(3小时)、S(6小时)、Y(24小时)为溶剂对照组；B(0.5小时)、H(1小时)、N(3小时)、T(6小时)、Z(24小时)为1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；C(0.5小时)、I(1小时)、O(3小时)、U(6小时)、α(24小时)为5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；D(0.5小时)、J(1小时)、P(3小时)、V(6小时)、β(24小时)为10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；E(0.5小时)、K(1小时)、Q(3小时)、W(6小时)、γ(24小时)为20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；F(0.5小时)、L(1小时)、R(3小时)、X(6小时)、Δ(24小时)为40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
图3是吖啶橙染色，荧光显微镜下溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组处理3、6、12、24小时后的非小细胞肿瘤A549细胞。
图3中：A(3小时)、G(6小时)、M(12小时)、S(24小时)为溶剂对照组；B(3小时)、H(6小时)、N(12小时)、T(24小时)为1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；C(3小时)、I(6小时)、O(12小时)、U(24小时)为5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；D(3小时)、J(6小时)、P(12小时)、V(24小时)为10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；E(3小时)、K(6小时)、Q(12小时)、W(24小时)为20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；F(3小时)、L(6小时)、R(12小时)、X(24小时)为40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
图4是吖啶橙染色，荧光显微镜下溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组处理0.5、1、3、6、24小时后的血管内皮细胞。
图4中：A(0.5小时)、G(1小时)、M(3小时)、S(6小时)、Y(24小时)为溶剂对照组；B(0.5小时)、H(1小时)、N(3小时)、T(6小时)、Z(24小时)为1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；C(0.5小时)、I(1小时)、O(3小时)、U(6小时)、α(24小时)为5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；D(0.5小时)、J(1小时)、P(3小时)、V(6小时)、β(24小时)为10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；E(0.5小时)、K(1小时)、Q(3小时)、W(6小时)、γ(24小时)为20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组；F(0.5小时)、L(1小时)、R(3小时)、X(6小时)、Δ(24小时)为40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
图5在A549细胞中蛋白质印迹法结果。
图6在血管内皮细胞中蛋白质印迹法结果。
五、具体实施方式：
以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在促进非小肺癌细胞A549细胞自噬中的应用。
非小肺癌细胞A549细胞的制备：以常规方法培养非小肺癌细胞A549细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的A549细胞备用。
将所培养的细胞分为溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
溶剂对照组细胞用浓度为40μM的DMSO孵育3、6、12或24小时；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组细胞用不同浓度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮孵育3、6、12或24小时；每隔3小时于倒置相差显微镜下观察，分别在3、6、12和24小时，记录细胞形态学变化并拍照。
实验结果显示：对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组处理A549细胞3h，细胞形态无肉眼可见变化；但(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮不同浓度处理组细胞随着时间增加明显产生空泡化，并且细胞在高浓度时明显趋圆变亮；在24小时，40μM处尤为明显。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮促进细胞空泡化，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮促进非小肺癌细A549自噬(详见附图1)。
实施例2：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在促进非小肺癌细胞A549细胞自噬中的应用
非小肺癌细胞A549细胞的制备：以常规方法培养非小肺癌细胞A549细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的A549细胞备用。
将所培养的细胞分为溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
溶剂对照组细胞用浓度为40μM的DMSO孵育3、6、12或24小时；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组细胞用不同浓度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮孵育3、6、12或24小时。吸弃各孔中原有培养液，1×PBS清洗细胞1次，0.1mg/mL吖啶橙染液染色40s，1×PBS再次清洗，在倒置荧光显微镜下观察酸性膜泡，先在白光下找到细胞，然后换为蓝光，在蓝光激发下细胞核为绿色，酸性膜泡为红色。
实验结果显示：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮明显诱导细胞产生酸性膜泡，在24小时，40μM处尤为明显。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮诱导细胞产生酸性膜泡，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮促进非小肺癌细胞A549细胞自噬(详见附图3)。
实施例3：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在促进非小肺癌细胞A549细胞自噬中的应用。
非小肺癌细胞A549细胞的制备：以常规方法培养非小肺癌细胞A549细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的A549细胞备用。
将所培养的细胞分为溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
溶剂对照组细胞用浓度为40μM的DMSO孵育24小时；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组细胞用不同浓度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮孵育24小时。孵育细胞24小时后，用蛋白裂解液提取蛋白，考马斯亮蓝G-250测得蛋白浓度，接着蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC3的表达水平。
实验结果显示：随着(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮浓度的增加(1、5、10、20、40μM)与对照组相比LC3-Ⅱ的表达量逐渐增高，LC3-Ⅰ的表达量逐渐降低；在40μM处尤为明显。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮诱导LC3-Ⅱ蛋白表达量的增多，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮促进非小肺癌细胞A549细胞自噬。
实施例4：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在促进血管内皮细胞自噬中的应用。
血管内皮细胞的制备：以常规方法培养血管内皮细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的血管内皮细胞备用。
将所培养的细胞分为溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
溶剂对照组细胞用浓度为40μM的DMSO孵育0.5、1、3、6或24小时；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组细胞用不同浓度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮孵育0.5、1、3、6或24小时；于倒置相差显微镜下观察，在0.5、1、3、6和24小时，记录细胞形态学变化并拍照。
实验结果显示：对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组处理血管内皮细胞后，细胞形态无肉眼可见变化；但(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮不同浓度处理组细胞随着时间增加明显产生空泡化，并且细胞在高浓度时明显趋圆变亮；在24小时，40μM处尤为明显。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮促进细胞空泡化，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮促进血管内皮细胞自噬(详见附图3)。
实施例5：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在促进血管内皮细胞自噬中的应用。
血管内皮细胞的制备：以常规方法培养内皮细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的血管内皮细胞备用。
将所培养的细胞分为溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
溶剂对照组细胞用浓度为40μM的DMSO孵育3、6、12或24小时；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组细胞用不同浓度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮孵育0.5、1、3、6或24小时。吸弃各孔中原有培养液，1×PBS清洗细胞1次，0.1mg/mL吖啶橙染液染色40s，1×PBS再次清洗，在倒置荧光显微镜下观察酸性膜泡，先在白光下找到细胞，然后换为蓝光，在蓝光激发下细胞核为绿色，酸性膜泡为红色。
实验结果显示：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮明显诱导细胞产生酸性膜泡；在24小时，40μM处尤为明显。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮诱导细胞产生酸性膜泡，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮促进血管内皮细胞自噬(详见附图4)。
实施例6：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在促进血管内皮细胞自噬中的应用。
血管内皮细胞的制备：以常规方法培养血管内皮细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的血管内皮细胞备用。
将所培养的细胞分为溶剂对照组和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组。
溶剂对照组细胞用浓度为40μM的DMSO孵育1小时：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮实验组细胞用不同浓度(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮孵育1小时。孵育细胞1小时后，用蛋白裂解液提取蛋白，考马斯亮蓝G-250测得蛋白浓度，接着蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC3的表达水平。
实验结果显示：随着(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮浓度的增加(1、5、10、20、40μM)与对照组相比LC3-Ⅱ的表达量逐渐增高，在40μM处尤为明显。
(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮诱导LC3-Ⅱ蛋白表达量的增多，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮促进血管内皮细胞自噬。
实施例1～3是(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在促进非小肺癌细胞A549细胞自噬中的应用；
实施例4～6是(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在促进血管内皮细胞自噬中的应用。

Claims (3)

1.(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在制备自噬诱导剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在制备自噬诱导剂中的应用，其特征在于：所述(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在诱导A549细胞或血管内皮细胞自噬中的应用。
3.根据权利要求2所述的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在制备自噬诱导剂中的应用，其特征在于：所述(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮在诱导A549细胞或血管内皮细胞自噬中应用的有效浓度为10μM～40μM。
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"姜黄素类似物诱导A549细胞自噬和抑制增殖的作用";徐亚来等;《中国癌症防治杂志》;20130930;第5卷(第3期);摘要，第217页图1 *
Synthesis and biological evaluation of curcumin analogues having a piperidone core as potential antiosidant agents;Jian Wang,et.al;《JOURNAL OF CHEMICAL RESEARCH》;20120229;第63-65页 *

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