CN104271152B - 拔出牙齿的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及拔出牙齿的方法，包括将待拔出的牙齿周围的组织与包含能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂，诸如胶原酶的组合物接触，随后拔出牙齿。

Description

拔出牙齿的方法
发明领域
本发明涉及拔出牙齿的方法，包括将待拔出的牙齿周围的组织与包含能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂，诸如胶原酶的组合物接触，随后拔出牙齿。本发明还涉及在酶促拔出之后用牙种植体(dental implant)代替牙齿的方法。
发明背景
用于拔出牙齿的各种牙科程序是本领域已知的。通常，这些方法包括用牙挺(dental elevator)使牙齿脱位直到足够地破坏牙周韧带，并使支撑牙槽骨足够加宽以使牙齿足够松动，由此准备除去。牙齿的除去通常通过用拔牙钳应用间歇性向顶的和横向力来完成。当牙齿不容易接近时(例如，因为其在牙龈线下损坏)，可包括手术过程，需要抬高覆盖牙齿的软组织并用钻头除去周围颚骨组织的一些，以接近要拔出的牙齿。
在此类常规牙科程序期间及之后，通常发生出血、液体渗出或流出，或其他形式的流体损失。此外，在程序期间骨组织被除去或受损。结果，肿胀和剩余出血在愈合期间持续存在。通常，当拔牙程序中对周围的组织的损伤更大时，这些副作用更加明显。
Komatsu(J.Biomech.,40:634-644,2007)公开了胶原分子和原纤维在牙齿-PDL骨段中PDL的应力松弛期间的排列。
Komatsu等人(J.Biomech.,40:2700-2706,2007；以及J.Dental Biomech.,doi:10.406/2010/502318)公开了胶原酶体外减少由PDL胶原纤维占据的更大面积，减少纤维的双折射延迟并减少PDL样品中的PDL纤维面积。
对最小化拔牙的不良后果，包括疼痛、组织损伤和/或创伤，并使能够方便重建缺牙区域，同时减少处理时间且更短的愈合期存在未满足的需要。
发明概述
本发明涉及用于降低需要其的受试者中与拔牙相关的风险的方法，包括将有效体积的包含有效量的能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂诸如胶原酶的组合物应用进所述牙齿的牙周韧带空间，由此降低需要其的受试者中与拔牙相关的风险和过度疼痛。
本发明部分地基于以下的意外发现：通过将能够切断牙齿周围的牙周韧带的试剂局部应用进入牙齿周围的组织拔出牙齿，与使用常规方法拔出牙齿需要的力相比需要投入显著更小的力。此外，由于其有利的特性，诸如，减少出血、减少牙槽变形、以及最小化对牙槽骨的损伤，本发明的方法可确保较佳的患者舒适度，并因此，患者顺从性。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在有此需要的受试者中拔出牙齿的方法，包括：(a)将包含有效量试剂的组合物应用进入所述牙齿周围的组织，该试剂能够破坏牙齿周围的牙周韧带；以及(b)拔出所述牙齿。
在另一个实施方案中，试剂是酶，所述酶能够裂解(cleave)或水解胶原肽键。在又另一个实施方案中，酶是蛋白水解酶。在又另一个实施方案中，酶是蛋白酶。在又另一个实施方案中，酶是能够水解或以其他方式裂解胶原中肽键的蛋白水解酶。在又另一个实施方案中，酶选自由以下组成的组：分散酶、胶原酶、蛋白酶K、透明质酸酶及其组合。每个可能性代表了本发明的独立实施方案。
在又另一个实施方案中，组合物还包含选自由以下组成的组的试剂：止痛药、麻醉剂、抗生素、麻醉药、维生素、生长因子和调味剂。每个可能性代表了本发明的独立实施方案。
在又另一个实施方案中，拔出包括应用与所述牙齿的长轴平行的拔出力，由此最小化牙齿周围的组织的损伤、出血和骨损失。在又另一个实施方案中，拔出没有应用旋转力。
在另一个实施方案中，应用包括接触牙齿周围的牙周韧带空间处的至少一个部位。在另一个实施方案中，接触包括将所述组合物注射进入内牙周韧带。
在另一个实施方案中，拔出所述牙齿的步骤在应用所述组合物之后的15分钟至3小时内进行。
在又另一个实施方案中，能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂是胶原酶。
在又另一个实施方案中，能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂是针对胶原蛋白的抗体。
在又另一个实施方案中，所述胶原酶选自由以下组成的组：胶原酶I、胶原酶II、胶原酶III及其组合。每个可能性代表了本发明的独立实施方案。在又另一个实施方案中，所述组合物包括胶原酶I对胶原酶II的1:1的质量比。在又另一个实施方案中，所述组合物具有0.01至3ml的有效体积。在又另一个实施方案中，所述组合物具有0.01至2ml的有效体积。
在又另一个实施方案中，需要其的所述受试者是患有出血性紊乱的受试者。
在又另一个实施方案中，该方法还包括通过将牙种植体放置在拔出所述牙齿后获得的空腔处代替所述牙齿。
在又另一个实施方案中，本发明提供了用于在有此需要的受试者中拔出牙齿的方法，包括：(a)将包含有效量胶原酶的组合物注射进入牙齿周围的牙周韧带处的多个部位；以及(b)在注射所述组合物之后至少15分钟时拔出所述牙齿。
在又另一个实施方案中，该方法还包括将牙种植体放置在拔出所述牙齿后获得的空腔处。
在又另一个实施方案中，本发明提供了用牙种植体代替牙齿的方法，包括：(a)将包含有效量胶原酶的组合物应用至牙齿周围的牙周韧带；(b)在应用所述组合物之后至少15分钟时拔出所述牙齿；以及(c)将牙种植体放置在拔出所述牙齿后获得的空腔处。
在又另一个实施方案中，应用包括将所述组合物注射进入所述牙齿周围的牙周韧带处的至少一个部位。在又另一个实施方案中，应用包括将所述组合物注射进入所述牙齿周围的牙周韧带处的多个部位。在又另一个实施方案中，应用包括将所述组合物注射进入所述牙齿周围的牙周韧带处的2至8个部位。
在又另一个实施方案中，该方法还包括在拔出所述牙齿之前，将有效量的钝化剂应用进入所述牙齿周围的组织。在又另一个实施方案中，所述钝化剂是螯合剂。
在又另一个实施方案中，所述钝化剂是乙二胺四乙酸(EDTA)及其衍生物。在又另一个实施方案中，所述钝化剂是EDTA。
在又另一个实施方案中，本发明提供了用于拔出牙齿的试剂盒，包括第一容器、第二容器和使用说明书，所述第一容器包含组合物，所述组合物包含进入所述牙齿周围的组织的有效量的试剂；所述第二容器包括包含有效量的钝化剂的组合物；所述使用说明书列出了该试剂盒的各组分的用途和使用顺序。
在又另一个实施方案中，试剂盒还包括包含选自由以下组成的组的试剂的容器：止痛药、麻醉剂、抗生素、麻醉药、维生素、生长因子、调味剂及其组合。
在又另一个实施方案中，试剂盒还包括用于拔出所述牙齿的牙科工具。
在又另一个实施方案中，本发明提供了试剂用于松动需要其的受试者的牙齿的牙周韧带的用途，包括向牙齿周围的牙周韧带应用能够破坏所述牙齿的所述牙周韧带的试剂，由此松动将所述牙齿锚定在其牙槽的牙周韧带。
在又另一个实施方案中，试剂是能够裂解或水解牙齿周围的牙周韧带处的肽键的酶。在又另一个实施方案中，所述试剂是蛋白水解酶。在又另一个实施方案中，酶选自由以下组成的组：分散酶、胶原酶、蛋白酶K、透明质酸酶及其组合。在又另一个实施方案中，酶是胶原酶。在又另一个实施方案中，所述胶原酶选自由以下组成的组：胶原酶I、胶原酶II、胶原酶III及其组合。在又另一个实施方案中，所述组合物包括胶原酶I对胶原酶II的1:1的质量比。在又另一个实施方案中，所述组合物具有0.01至3ml的有效体积。
在又另一个实施方案中，所述组合物还包括选自由以下组成的组的试剂：止痛药、麻醉剂、抗生素、麻醉药、维生素、生长因子、调味剂及其组合。
在又另一个实施方案中，能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂是针对胶原蛋白的抗体。
在又另一个实施方案中，应用包括接触牙齿周围的牙周韧带空间处的至少一个部位。
在又另一个实施方案中，所述受试者患有出血性紊乱。
在又另一个实施方案中，用途还包括在拔出所述牙齿之前，将有效量的钝化剂应用进入所述牙齿周围的组织。在又另一个实施方案中，所述钝化剂是乙二胺四乙酸。在又另一个实施方案中，用途包括在应用所述组合物之后的10分钟至3小时应用有效量的钝化剂。
在又另一个实施方案中，本发明的用途和方法减少了需要其的受试者中与拔牙相关的风险。
在又另一个实施方案中，本发明的用途和方法通过允许在需要其的受试者中直接放置牙种植体加速拔出的牙齿的恢复。
附图简述
图1示出了从猪下颌骨的牙间隙区域获得的牙龈组织的切片。
图2示出了来自猪下颌骨的牙间隙区域的牙龈组织(A)、与PBS温育3小时之后(图B)、以及与PBS温育24小时(图C)或与胶原酶温育3小时之后(图D)以及与胶原酶温育24小时(图E)的切片。
图3是用于可视化胶原变性的实验设置的图解(A)和代表性切片(B)。
图4示出了在注射墨汁(A)后当在光学显微镜下观察的固定的H&E染色的组织样本，以及在注射PBS(B)或不同浓度的胶原酶(C-F)后当在偏振光下在显微镜下观察到的天狼猩红染色的组织样本。
图5示出了注射后包含嵌入在骨槽中的牙齿的下颌骨样本的固定的、脱钙的切片。
图6是韧带内注射的图解描述。
图7示出了用于测量拔牙需要的力的量的电子装置(A)。该装置的特写视图(B)显示了握住牙冠的齿(箭头)。还示出了握持下颌骨的两个轴移动工具，具有四个可调节的螺钉。
本发明的其他目标、特征和优势从以下描述将变得清晰。
发明详述
本发明提供了通过酶促或生化切断将牙齿锚定至其牙槽的牙周韧带纤维而拔出牙齿或牙齿的断根的片段的方法。在另一个实施方案中，本发明方法包括使牙周韧带空间与包含能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂的组合物接触。在一个实施方案中，试剂是胶原酶且PDL由胶原制成，使得胶原酶破坏胶原中的肽键。因此，根据本发明的方法的拔牙导致在拔牙程序期间最小化并甚至避免在颊舌和近中远侧方向应用旋转压力和脱位力的需要。
应当理解，如本文所用的术语“牙齿”包括，但不限于，健康的牙齿、受损的牙齿、患病的牙齿、牙齿的片段，诸如，牙齿的断根。
如本文所用的术语“牙周韧带”，通常缩写为PDL，是指一组特化的结缔组织纤维，其基本上将牙齿的牙骨质附着至其位于的牙槽骨。各韧带具有0.15–0.38mm的宽度。主要由I型和III型胶原蛋白组成，PDL纤维成束聚集并根据其位置命名，例如牙槽嵴纤维、水平纤维、斜纤维、根尖周纤维、和根间纤维。
牙周韧带是属于牙齿附件系统的牙周组织的一部分，支撑牙齿的结构，有助于将牙齿附着到周围组织，并允许感觉触摸和压力。其由牙骨质、牙周韧带、牙槽骨、和牙龈组成。这其中，牙骨质是唯一的为牙齿的一部分。牙周韧带将牙槽骨连接到牙骨质。牙槽骨包围牙根以提供支撑并创建了通常称为牙槽(alveolus)或“牙槽(socket)”。卧在骨上的是牙龈或齿龈，其在嘴中容易可见。
牙骨质是覆盖嵌入牙槽骨中的牙根的牙质的组织。在根内的是牙根管，由牙髓占据的空间，其从牙冠腔的顶部向下延伸进入各牙根管的底部，并经由根尖孔通向牙周组织。暴露在牙龈上的牙的部分是牙冠。覆盖牙冠的牙釉质被白色物质高度矿化。在牙釉质下面的是牙本质，其是微观多孔的硬组织。位于牙齿中部的牙髓腔容纳主要由结缔组织、神经网络和血管组成的牙髓。
例如由于外伤或由于由细菌代谢物对牙齿硬组织的脱矿质(龋齿)，任何牙齿可变得受损或腐烂。随着腐烂继续，细菌常常通过多孔牙本质迁移并感染牙髓。转而，对感染的免疫应答可接着，导致血管扩大并挤压进入牙齿的神经。结果是牙髓的发炎(牙髓炎)。
可影响牙齿的另一种状况是牙周(牙龈)疾病。牙周疾病的主要原因是由在牙齿和牙龈上自然形成的细菌的不可见粘层的噬斑的沉积引起的感染。噬斑包含产生刺激患者的免疫系统的毒素的细菌。例如，由于炎症介质像诱导骨吸收和基质金属蛋白酶(MMP)活化的前列腺素E2的过度产生，慢性感染过程中受损的宿主反应是牙周组织的破坏的主要问题。破坏胶原蛋白中肽键的MMP，例如，MMP-1和MMP-8，蛋白水解酶(胶原酶)的活化导致牙周组织的破坏。最终，牙齿可变得松动，并可必须被除去。
当影响口腔及其解剖结构的这些或其他状况发生时，用于干预的各种牙科程序是已知的。这些程序由普通的牙科执业医生、牙髓病专家、口腔修复科医师、颌面外科医生和牙周病医师常规进行。
用于除去或拔出牙齿的主要指征是当牙冠受损或腐烂至使用任何临床可用口腔修复方法将不允许未来重建的程度时。因为晚期的牙周(牙龈)疾病也可指示拔牙。除去或拔出牙齿的另一个常见的原因是，当牙齿的存在导致拥挤、或咬合不正、或阻止另一个牙齿(例如，智齿)长出，或准备正畸治疗(“支架”)时。指示拔牙的另一种状况是非可治疗的根尖周脓肿。
有时，如果牙齿的牙冠在龈下破损，或牙槽中存在牙根残留物，或如果拔牙选择的牙齿没有完全长出牙龈以上，首先除去一些覆盖的牙龈和骨组织以接近待拔出的牙齿可以是必要的。
在对牙质的损伤是不可逆的情况，常常指示除去或拔出牙齿。在简单的拔出期间，牙医首先用牙挺举起牙齿，并然后用牙钳抓住牙齿，且来回摇动牙齿。这摇摆运动通过破坏保持牙齿锚定至周围牙槽骨的牙周韧带纤维使牙齿从牙槽骨中松动。然后从牙槽中拔出牙齿，留下空旷的牙槽。
代替牙齿的方法包括拔牙后立即植入牙种植体。牙种植体是一种“根”的装置，通常由钛制成，用于牙科以支持类似牙齿的修复。为了立即植入种植体，无创伤拔牙是关键，以保持拔牙槽的壁，并改善植入物的初期稳定性。
如在牙科领域中熟知的，在拔牙期间由医师施加的压力对以下的邻近组织具有毁灭性创伤效应：诸如但不限于：软牙龈和牙槽下的牙槽骨。在某些情况下，在拔牙期间由医生施加的压力破碎牙齿组件，诸如：冠或根，增加拔牙的难度、整体骨质流失、和术后愈合时间。本发明使无创伤拔牙的过程容易，由此避免或至少减少机械拔牙过程的不利影响。
在一个实施方案中，本发明提供了用于拔出需要其的受试者中的牙齿的方法，包括以下步骤：a)将包含有效量试剂的组合物应用进入所述牙齿周围的组织，所述试剂能够破坏牙齿周围的牙周韧带；以及b)拔出所述牙齿。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了许多优势，包括，但不限于，最小化对选自牙龈、骨、和/或血管的周围组织的创伤，最小化与拔牙相关的疼痛以及最小化机械程序的持续时间。
根据一些实施方案，周围组织是指待拔出的组织周围的组织，所述组织选自牙龈、骨、和/或血管。
根据特定的实施方案，以可预测的、可重复的且有效的方式减少程序的持续时间。拔牙的持续时间的减少由使用的酶的量来确定并且暴露于酶的持续时间如可由熟练的技术人员容易地确定。
根据某些实施方案，与拔牙相关的创伤在以下邻近的组织中是明显的：诸如牙龈、底层骨板、口腔内的血管或口腔中和/或面部的任何其他组织。
本发明的方法的另外的优势包括，避免手动切断gingivodental纤维的步骤，包括，以骨膜起子手动切断gingivodental纤维，和阻止破碎的根尖的形成。
在另一个实施方案中，本发明的方法通过最小化在拔牙之前对牙龈和下颚骨的切片的需要有益于减少需要其的受试者中与拔牙相关的风险。此外，本发明的方法允许最小化伴随拔牙的创伤并减少本发明的方法拔牙之前麻醉剂的剂量。此外，本发明的方法提供了用于拔牙的无痛的方法或减少疼痛的平台。事实上，本发明的方法需要用于拔牙的极少的机械压力(力)。
在另一个实施方案中，与拔牙相关联的风险，包括，出血、肿胀、疼痛、拔牙部位的感染(干槽症)，以及损害口中其他牙齿或组织(牙龈或颊),以及其他。由于拔牙程序和/或麻醉，与拔牙相关的风险还可包括，颌骨骨折、对TMJ(下颌关节)的暂时性或永久性损伤、口腔的暂时性或永久性麻木、和危及生命的并发症。此外，与拔牙相关的风险可以是延长的出血、擦伤、窦暴露(sinus exposure)和口腔窦连通、神经损伤、牙齿或牙齿的一部分进入上颌窦的位移，干槽症(齿槽骨炎)。
应当注意，本发明的方法还有效地减少与创伤手术相关的心理效应。此外，本发明的方法减少了全身性副作用，允许在私人诊所治疗全身受损的患者并适合于与感染和/或炎症相关的牙齿。
如本文所用，术语“拔出”，包括，但不限于，通常在局部麻醉下，对可见于口中的牙齿进行的简单的机械拔出，并且仅需要使用仪器举起和/或抓住牙齿的可见部分，以及，涉及外科手术的拔出，例如，在除去不能容易接近的牙齿的情况下，因为其在牙龈线下被破坏或因为它没有完全长出。
在另一个实施方案中，利用本发明的方法的拔出导致覆盖牙槽的原开放性伤口的加速的愈合。在另一个实施方案中，利用本发明的方法的拔出导致牙龈软组织的加速的填充。在另一个实施方案中，利用本发明的方法的拔出导致牙槽随骨重建加速的闭合。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于在需要其的受试者中在拔出所述牙齿后获得的空腔处植入牙种植体的方法。在另一个实施方案中，用于在需要其的受试者中植入牙种植体的方法包括以下步骤：a)将包含有效量试剂的组合物应用至牙齿周围的牙周韧带，所述试剂能够切断牙齿周围的PDL，例如，所述试剂是胶原酶；b)在应用所述组合物后至少15分钟时拔出所述牙齿；以及c)在拔出所述牙齿后获得的空腔处植入牙种植体。
本发明用于植入牙种植体的方法对牙槽骨周围的骨板引起的损失最小，并因此提高成功植入(移植)的机会。此外，本发明的方法提高了牙种植体植入的可行性，而没有任何支撑骨增强手术的需要。
不受限于任何机制或理论，本发明基于以下概念：松动将牙齿锚定至其牙槽的牙周韧带，导致需要由牙医进行拔牙程序的拔出程序，以使用用于拔出的减小的力和/或压力。本发明还基于以下概念：松动将牙齿锚定至其牙槽的牙周韧带导致特征为口腔中组织撕裂最小的拔出程序。此外，松动将牙齿锚定至其牙槽的牙周韧带(PDL)导致特征为口腔中出血最小的拔出程序，并放弃多余的来回摇动牙齿直到破坏牙周韧带。
推测，PDL的松动通过使PDL与包含胶原酶或由胶原酶组成的组合物接触来实现，由于胶原酶是具有消化胶原蛋白的特定能力的酶。胶原酶可从由溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)发酵随后纯化来获得。胶原酶可通过色谱技术来纯化。可选地，胶原酶可提供为无菌的冻干粉。任选地，胶原酶包括50 ABC单位/ml的最低测定。
根据一个实施方案，能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂是酶。根据另一个实施方案，所述酶能够裂解或水解胶原蛋白肽键。根据又另一个实施方案，酶是蛋白水解酶。在又另一个实施方案中，酶选自由以下组成的组：分散酶、胶原酶、蛋白酶K、透明质酸酶及其组合。每个可能性代表了本发明的独立实施方案。
根据又另一个实施方案中，组合物还包含选自由以下组成的组的试剂：止痛药、麻醉剂、抗生素、麻醉药、维生素、生长因子和调味剂。每个可能性代表了本发明的独立实施方案。
组合物还可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
根据又另一个实施方案，方法还包括在拔出所述牙齿之前将有效量的钝化剂应用至所述牙齿周围的组织，并随后应用能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂。根据又另一个实施方案中，所述钝化剂是螯合剂。
如本文所用的术语“螯合剂”，包括但不限于，能够钝化金属酶的天然或合成的试剂。
根据又另一个实施方案，所述钝化剂是乙二胺四乙酸(EDTA)或其类似物或衍生物。根据又另一个实施方案中，所述钝化剂是EDTA。
如本文所用的术语“其类似物或衍生物”包括EDTA的合适的生物活性变体。在本发明的上下文中，化学修饰包括以化学实体、基团或部分的修饰。此外，每一种特定的化合物，诸如本文所述的那些，可产生具有相似活性和因此根据本发明的有用性的类似物或衍生物的整个家族。同样地，单一化合物，诸如本文所述的那些，可代表根据本发明有用的化合物的更大种类的单一家族成员。因此，本发明不仅完全包括了本文描述的化合物，而且包括了此类化合物的类似物及衍生物，特别是通过本领域通常已知的方法可鉴定的以及由本领域熟练的技术人员可识别的那些。
胶原酶可以以液体包括液体载体应用、滴入或注入进PDL空间。应用后，可固定患者的头部，以避免大幅度运动，持续数分钟，例如4至120分钟，以尽量减少胶原酶溶液从PDL空间的挤出泄漏。允许胶原酶对PDL足够、但不过度的作用时间，产生良好的临床结果。
本发明的胶原酶组合物可通过混合特定数目的活性单位或特定质量的优选纯化的酶来制备。胶原酶是为其活性需要紧密结合锌且松散结合钙的金属蛋白酶，并已知通过在生理条件下水解胶原蛋白的三螺旋区域消化胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原酶，由被称为胶原酶AUX I和胶原酶ABC I和胶原酶AUX II和胶原酶ABC II的两种微生物胶原酶组成。应理解，术语“胶原酶I”、“ABC I”、“AUX I”，“胶原酶AUX I”和“胶原酶ABC I”意思相同，并可互换使用。类似地，术语“胶原酶II”、“ABC II”、“AUX II”、“胶原酶AUX II”、和“胶原酶ABC II”是指相同的酶，并也可互换使用。这些胶原酶由细菌细胞分泌。通过色谱方法将其从溶组织梭菌培养物上清液中分离并纯化。两种胶原酶是特殊的蛋白酶并共享相同的EC号(E.C 3.4.24.3)。
胶原酶AUX I具有由具有115kDa的分子量的约1000个氨基酸组成的单一多肽链。胶原酶AUX II还具有由具有110kDa的分子量的约1000个氨基酸组成的单一多肽链。尽管文献中指示，在胶原酶AUX I和AUX II的区域中存在序列同源性，但两种多肽似乎没有免疫学交叉反应性，如由蛋白质印迹分析所指示的。药物物质(胶原酶浓缩物)具有约1比1质量比的胶原酶AUX I和AUX II。胶原酶浓缩物具有1.528的消光系数。
因此，本发明的胶原酶组合物可含一种或更多种类型的胶原酶，例如，胶原酶I、胶原酶II、胶原酶III或其组合。胶原酶组合物还可包含针对所有类型的胶原酶的广泛的特异性。胶原酶组合物可包含胶原酶I对胶原酶II的1比1质量比、胶原酶I对胶原酶II的1.5-10比1质量比、胶原酶I对胶原酶II的1比1.5-10质量比、胶原酶I和胶原酶II的1比2比、以及其他的选项。在一些实施方案中，组合几种类型的胶原酶改进了由不同胶原酶提供的协同活性，导致优异的治疗益处。
在另一个实施方案中，本发明的胶原酶是具有针对胶原蛋白的协同活性的胶原酶I和胶原酶II的组合。在另一个实施方案中，胶原酶活性通过酶水解合成肽或胶原蛋白底物的能力来测量。本领域技术人员将认识到，除本文所公开的那些以外的酶测定也可被用于界定并制备功能上等同的酶组合物。
在另一个实施方案中，药物制剂包含与一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的治疗有效量的本发明的胶原酶组合物。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”意指任何类型的无毒的惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例为糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；二醇，诸如丙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇，和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒的相容的润滑剂，诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及根据配制者的判断，着色剂、释放剂、包衣剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
本发明的药物组合物可局部、皮下、韧带内、龈内、或经由植入的容器来施用。组合物可注射或通过直接滴入应用进入PDL空间。如本文所用的术语“局部施用(localadministration)”和“局部施用(topical administration)”可互换，并且可包括任何上述的直接应用。
可注射的制品，例如，无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制品还可以是无毒的药学上可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液。可应用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液、USP和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可应用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸可用于制备注射剂。
在另一个实施方案中，在药学上可接受的，包括对胶原酶惰性的液体载体或凝胶载体中应用胶原酶。在另一个实施方案中，液体载体是缓冲液。在另一个实施方案中，液体载体是等渗溶液。在另一个实施方案中，液体载体是盐水。在另一个实施方案中，液体载体是含水的NaCl/CaCl2缓冲液。在另一个实施方案中，液体载体是葡聚糖溶液。在另一个实施方案中，在heptastich溶液中应用胶原酶。
可注射制剂可进行灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤、或通过以在使用前可溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物的形式掺入灭菌剂。无菌溶液还可冷冻干燥，以备后用。
用于施用本发明的胶原酶的剂型包括凝胶剂、溶液剂或喷雾剂。当可需要时，胶原酶可与药学上可接受的载体和任何需要的防腐剂或缓冲剂在无菌条件下进行混合。在一些实施方案中，凝胶，除了包含本发明的胶原酶，还包含赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。在一些实施方案中，喷雾剂，除了包含本发明的化合物，还包含赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉、或这些物质的混合物。在一些实施方案中，喷雾剂，另外包含常规推进剂，诸如但不限于氯氟化烃。
在另一个实施方案中，本发明的胶原酶是用乳糖配制的冻干的可注射的组合物。在一个实施方案中，每毫克可注射胶原酶与1-4mg的乳糖一起配制。在另一个实施方案中，每毫克的注射胶原酶具有约1000-3000SRC单位和使用合成底物pzGPGGPA用效力测定测量的10000-51000单位。
在另一个实施方案中，本发明的胶原酶组合物是用蔗糖、约6.0-8.0的pH水平下的Tris配制的冻干的可注射组合物。
在另一个实施方案中，本发明的胶原酶组合物由韧带内注射施用。在另一个实施方案中，本发明的胶原酶组合物由计算机控制的注射递送系统施用进入PDL空间。在另一个实施方案中，胶原酶组合物浸渍到龈线，并由此施用至PDL空间。
在另一个实施方案中，本发明的胶原酶组合物还包含抗生素、抗炎剂、防腐剂、麻醉剂或其任何组合。
在另一个实施方案中，如本文所用的术语本发明的化合物的“治疗有效量”和“有效量”是可互换的，并且是指赋予松动锚定指定牙齿的PDL的化合物的量。通常，将不同的量和/或浓度的本发明的组合物应用至不同的牙齿(即臼齿与门齿)。因此，取决于待拔出的特定牙齿以及还取决于年龄(儿童、成人，等)及本领域技术人员评估的牙齿状况，用不同量和/或浓度实现治疗效应。
然而，应当理解，本发明的组合物的总剂量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括待治疗的紊乱和紊乱的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体的组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的施用时间、施用途径、和排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域中熟知的类似因素。在另一个实施方案中，还原酶的量和浓度对于松动PDL有效。在另一个实施方案中，本文所用的术语“松动”包括软化、放松、或破裂。在另一个实施方案中，本发明的方法减少了PDL所施加的一直保持牙齿和牙龈紧贴的张力。
在一些实施方案中，胶原酶的有效量和浓度是至少1,000个ABC单位/ml载体、至少2,000个ABC单位/ml载体、至少3,000个ABC单位/ml载体、在2,000个至约8,000个ABC单位/ml载体的范围内、在3,000个至约25,000个ABC单位/ml载体的范围内。通常，胶原酶的量越低，浓度就应越大。因此，如果在特定情况下，期望使用2,000个ABC单位，8,000至20,000单位/ml的浓度将是可取的。
在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物总体积不超过约1ml。在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物的总体积不超过约0.8ml。在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物的总体积不超过约0.5ml。在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物的总体积不超过约0.4ml。在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物的总体积不超过约0.1ml。在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物的总体积不超过约0.05ml。在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物的总体积不超过约0.01ml。在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物的总体积不超过约0.005ml。在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物的总体积不超过约0.001ml。在另一个实施方案中，应用的/注射的组合物的总体积不超过约0.0005ml。
在另一个实施方案中，在多个位置和部分中，在至少两个位置和部分中，在至少三个位置和部分中，或在至少四个位置和部分中应用了(例如，通过注射)胶原酶组合物的总剂量/牙齿的PDL空间。在另一个实施方案中，在指定拔出的牙齿周围的不同部位应用了胶原酶组合物的总剂量/牙齿的PDL空间。在另一个实施方案中，对至少8个部分或部位进行应用，例如通过注射。
在另一个实施方案中，指定拔出的牙齿周围的不同部位靠近彼此(彼此间隔小于2mm)。在另一个实施方案中，通过注射应用组合物，其中注射器的注射针不以锐角插入而以直角插入到PDL空间，以保证胶原酶在PDL空间的小体积内的良好分布。
在另一个实施方案中，需要其的受试者是人受试者。在另一个实施方案中，受试者是宠物、哺乳动物或农场动物。
在另一个实施方案中，需要其的受试者是需要拔牙的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是具有至少一个牙齿受到龋齿严重损伤的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有牙周疾病的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是具有至少一个牙齿有根尖周感染的受试者，所述根尖周感染既不可根管上也不可由手术来维持，并且已引起了广泛的炎症(例如上颌窦或软组织的)或囊肿。在另一个实施方案中，需要其的受试者是具有至少一个牙齿由创伤损伤(牙周区域内的多发性骨折、纵行骨折、以及广泛的骨缺失)的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者为患有拥挤或长出受阻的受试者(由于正畸的原因应拔出乳牙和恒牙)。在另一个实施方案中，需要其的受试者通过口腔修复治疗来治疗，以维持正常的咬合(伸长的或严重倾斜的牙齿，特别是与先前的接触)。
在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有癌症、在肿瘤外科手术期间、并且至少一个牙齿位于肿瘤的区域内的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是经历病灶恢复(在神经痛的情况下，经常进行拔出而无临床和放射学检验发现)的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有三叉神经痛(trigeminal neuralgia)(三叉神经痛(prosopalgia))的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有局灶性感染的受试者(医师会根据潜在疾病决定)。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有心内膜炎的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有急性风湿热的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有急性肾小球肾炎的受试者。
在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有急性牙齿疼痛的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有一般性疾病的初始和重度炎性并发症的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有急性感染(脓肿)的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是智齿拔出的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是在正畸治疗结束前智齿拔出的受试者。
在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有出血性紊乱的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有糖尿病的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有心脏病的受试者。在另一个实施方案中，需要其的受试者是患有影响免疫系统疾病的受试者。
根据一个实施方案，本发明提供了用于拔出牙齿的试剂盒，该试剂盒包括包含组合物的第一容器，所述组合物包含进入所述牙齿周围的组织的有效量的试剂。根据又另一个实施方案，试剂盒还包括包含选自由以下组成的组的试剂的另外的组合物：止痛药、麻醉剂、抗生素、麻醉药、维生素、生长因子、调味剂及其组合。根据又另一个实施方案，试剂盒还包括包含有效量的钝化剂的组合物。根据又另一个实施方案，试剂盒还包括用于拔出所述牙齿的牙科工具。根据又另一个实施方案，试剂盒还包括列出了该试剂盒的各组分的用途及使用顺序的使用说明书。根据又另一个实施方案，使用说明书描述了根据本发明的方法的试剂盒的用途。
根据又另一个实施方案，使用说明书描述了根据本发明的方法的试剂盒的如下用途：(a)应用包含有效量的能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂的组合物进入待拔出的牙齿周围的组织，并且任选地，在应用之前，将所述组合物与包含选自由以下组成的组的试剂的所述另外的组合物混合：止痛药、麻醉剂、抗生素、麻醉药、维生素、生长因子、调味剂及其组合；(b)任选地，允许在(a)之后和在拔出所述牙齿之前延迟15分钟至3小时；(c)任选地，或可选地，在拔出所述牙齿之前，将钝化剂的组合物应用进入所述牙齿周围的组织；以及(d)拔出所述牙齿。
以下实施例是为了更充分地说明本发明的某些实施方案而呈现。然而，其不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可容易地设计出本文公开的原则的许多变化和修改，而不偏离本发明的范围。
实施例
实施例1
在体外由胶原酶对牙龈组织的切碎(Defragmentation)
A.使用毫米网格的尺寸测量
为了体外实验的目的选择牙龈组织，因为其可容易地以各种尺寸获得并与PDL具有许多共同特征，其中对于这种实验PDL是太薄和易碎的。
在处死后几分钟之内，从猪下颌骨的牙间隙区域获得20×3×0.3mm3的牙龈组织带。将带切成四等分样本，每个约5×3×0.3mm3(图1和图2A)。
使两份样本适应于0.5ml的包含5450个单位/ml胶原酶CLPSA溶液(WorthingtonBiochemical Corporation,NJ,USA；图2D和2E)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将两份样本适应于0.5ml PBS(图2B和2C)，并用作对照。在温和搅拌下将所有四个样本在37℃水浴中孵育不同的时间间隔。
组织降解的程度通过在与PBS或与胶原酶温育3小时后或24小时后，通过将样本放置在毫米网格上测量每个样本的总体积来确定。
结果表明，在温育3个小时后，与胶原酶温育的样本的体积减少了多于60％，至5×3×0.1mm3(图2D)，而与胶原酶温育24小时后切片被切碎为不可测量的样本(图2E)。对照样本的体积在与PBS温育3小时或24小时后相对于原样本(图2A)没有发生变化(分别图2B和2C)。
B.胶原蛋白变性的病理组织学检查。
胶原蛋白变性可使用苏木精和曙红(H&E)染色观察，但在偏振光下的天狼猩红(Picrosirius Red，PSR)的可视化是更好地。为此目的，从包含口腔咀嚼粘膜的硬腭获得钻取活组织检查。将50μl体积包含2,500、5,000、7,500或10,000个单位/ml胶原酶CLPSA溶液(Worthington Biochemical Corporation,NJ,USA)注射在组织中心的腭皱脊的正下方，如图3A所示。
为了标记注射区域，在固定之前，平行于胶原蛋白/PBS/墨汁注射的部位，在钻取活组织检查的两侧，注射印度墨汁，如图3B中由水平白虚线的两侧上的星号所示。为了评价胶原变性的区域，各切片通过平行于脊线的水平线(图3B-白虚线；表1–脊水平)、和与水平线交叉且与脊线垂直的垂直线(图3B–黑线)来标记。
对照组由未处理的(未注射的)样品和用PBS注射的样本组成(图4A和4B)。这些组在与处理组相似的条件下温育。钻取组织样本在37℃下在PBS中温育0、2、5、12和24小时，然后由福尔马林固定。
固定后，将组织修整，包埋于石蜡中，并在注射部位(标记油墨)的水平处纵向切割成片，然后用苏木精-曙红、马森三色(Masson's trichrome，MT)和天狼猩红(PSR)染色并转移至组织病理学检查。在处理之前和之后，沿着垂直线(表1-脊垂直)和沿着水平线(表1-脊水平)评估各切片的尺寸(以mm)。代表性的样本示于图4中，如下所示：(A)样品#56–仅用墨汁注射的对照，苏木精&曙红染色；(B)样品#31–用PBS注射的对照，天狼猩红(PSR)染色，在偏振光下观察；(C)样品#33–注射了胶原酶2,500个单位/ml，天狼猩红(PSR)染色，在偏振光下观察；(D)样品#35-注射了胶原酶5,000个单位/ml，天狼猩红(PSR)染色，在偏振光下观察；(E)样品#37-注射了胶原酶7,500个单位/ml，天狼猩红(PSR)染色，在偏振光下观察；以及(F)样品#39-注射了胶原酶10,000个单位/ml，天狼猩红(PSR)染色，在偏振光下观察。
处理后2和5小时后的组织结构分别总结于表1和2中。
与对照组相比，所有处理过的样品的病理检查发现以剂量依赖方式的较大的胶原溶解。如图4所示以及表1和表2中进一步描述的，牙龈组织变性的区域被呈现为浅染色和较薄胶原束，脂肪组织细胞膜和嗜曙红细胞增多和小动脉壁的粒度的浅染色。在用7,500个单位/ml胶原蛋白处理的样品中观察到变性的最大面积(图4E)。对照样品(分别图4A和4B)均在正常范围内。
表1:用墨汁、PBS或胶原酶(Coll.)注射后2小时的组织结构
表2:用墨汁、PBS或胶原酶(Coll.)注射后5小时的组织结构
实施例2
离体韧带内注射体积的评价
评估是基于关于待处理的牙齿的长度和特定切片上牙周韧带的宽度的经验发现。该数据被用于计算估计的PDL体积。然后临床上重新评估该估计。
以6个点将印度墨汁注入下颌第三门齿和第一前臼齿的PDL。终点由引起染料泄漏的注射体积来确定。在注射的6个点的每个，最佳的体积被确定为20μl。
实施例3
胶原酶注射后的PDL切碎
为了评价PDL结构而不是牙龈结构，对下颌第三门齿和双侧第一前臼齿和其周围的组织以不同浓度(2,500、5,000、7,500或10,000个单位/ml)进行酶注射(在6个点20μl)。注射两个小时后，切断下颌骨，并修剪相关牙齿周围，留下嵌在骨槽内的牙齿，然后在福尔马林中固定。将样本脱钙5-6天，然后修整(图5)，包埋在石蜡中，并沿齿的长轴切割成片。
将切片用苏木精-伊红和天狼猩红染色，并转移至组织病理学检查，以测试牙根的不同切片上PDL胶原纤维破裂和周围组织结构的完整性(适当的牙槽骨)。注射了PBS或不注射的样本作为对照。
在胶原酶处理后观察PDL切碎。
实施例4
离体拔牙
对处死动物后4小时获得的下颌第三门齿和两侧第一前臼齿以不同浓度(2,500、5,000、7,500或10,000个单位/ml)进行韧带内酶注射(在6个点20μl)，例如，如图6中所示。注射后两小时，使用标准牙钳，沿齿的长轴拔出牙齿，而不应用旋转力。确定相对于对照(未注射的和PBS注射的)牙齿，拔出的容易。
使用拔牙的电子装置，测量拔出所需的力的量，以kgf单位测量所应用的力(图7A-7B)。使用该装置，齿冠由具有螺钉紧固的牙钳牢固地保持。颌骨由能够由四个可调节的螺钉保持下颌骨的两个轴工具来分别保持。下颌骨以通过沿着牙根的长轴应用力能够拔出的方式被定位，即以向上的方向从骨/牙槽中拉出牙齿。
手工拔出注射了胶原酶溶液(10,000个单位/ml)的牙齿是显著地较容易的，即，需要投入比拔出未处理的牙齿需要的力显著更小的力。此外，尽管以单片拔出处理的牙齿，在拔出未处理的牙齿期间破坏数个牙冠。
实施例5
体内拔牙
六个月龄的家猪被麻醉。在牙齿周围的6个位置上施用一系列包含有效量胶原酶的组合物的韧带内注射。在胶原酶韧带内注射后约30分钟，用EDTA洗涤部位。
牙齿通过以下来拔出：以向上的方向从骨槽中拉牙，使用沿着牙齿的长轴的力而不使用旋转力。使用牙钳或牙挺进行拔出。将牙挺插入近中或远端PDL空间(无需坚定的根尖压力)，以凹侧朝向待拔出的牙齿。以朝向面部移动牙齿的方式旋牙挺。
适当升高牙齿后，使牙齿脱位并拔出。
拔出需要的力的量使用拔出装置来评估。结果与拔出未处理的牙齿需要的力进行比较。
实施例6
牙槽保存
当代替牙齿时，骨及相关软组织是重要的考虑因素。如果种植体待放置，必须存在足够的骨用于固定，并且对于美学上悦目的结果正确处理齿龈组织是必不可少的。如果骨质损失严重，应考虑可移动的假牙(RDP)。
应用本发明的无创伤拔牙方法减少了门齿拔出部位的愈合的持续时间的至少50％。此外，在拔牙后的前6个月内，牙槽嵴高度和宽度不存在明显减少。与相邻的近中和远端牙齿表面相关的骨处于其原始的垂直距离。因此获得了牙槽保存。因此，用胶原酶处理PDL空间增强牙槽保存，并由此提高成功植入牙种植体的机会。
具体实施方案的以上描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以至于其他人可通过应用现有知识，容易地修改和/或调整此类特定实施方案用于各种应用而无需过度实验且不偏离一般概念，并因此，此类调整和修改应该并意图被包含在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应理解，本文所采用的措辞或术语是用于描述性目的而非限制性目的。用于实施各种公开的功能的方法、材料和步骤可采取多种替代性形式而不偏离本发明。

Claims (12)

1.包含能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂的组合物在制备用于拔出牙齿的药物中的用途，其中所述试剂是胶原酶。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物与所述牙齿周围的牙周韧带空间处的至少一个部位接触。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述胶原酶选自由以下组成的组：胶原酶I、胶原酶II、胶原酶III及其组合。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述组合物包括胶原酶I对胶原酶II的1:1的质量比。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物具有0.01至3ml的有效体积。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物还包括选自由以下组成的组的试剂：止痛药、麻醉剂、抗生素、维生素、生长因子、调味剂及其组合。
7.包含能够破坏牙齿周围的牙周韧带的试剂的组合物在制备用于拔出牙齿并且将牙种植体放置在拔出所述牙齿后获得的空腔处代替所述牙齿的药物中的用途，其中所述试剂是胶原酶。
8.一种用于拔出牙齿的试剂盒，所述试剂盒包括第一容器、第二容器和使用说明书，所述第一容器包含组合物，所述组合物包含有效量的胶原酶；所述第二容器包括包含有效量的钝化剂的组合物；所述使用说明书列出了所述试剂盒的各组分的用途和使用顺序。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒还包括包含选自由以下组成的组的试剂的容器：止痛药、麻醉剂、抗生素、维生素、生长因子、调味剂及其组合。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于拔出所述牙齿的牙科工具。
11.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述钝化剂是螯合剂。
12.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述钝化剂是乙二胺四乙酸。
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