CN104267200A - 基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片及制作方法 - Google Patents

基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片及制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片，包括一基底模块和一流道模块，所述流道模块上设有芯片流道及微纹路，且所述芯片流道及微纹路的起点或终点设有微流控芯片进样口。本发明同时还提供了一种基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片的制作方法；本发明针对现有的细胞亲和微色层分析法效率低下的问题，通过在微流道表面制作出微米级纹路，间接增加了流道的表面积，增大了固定的抗体与细胞的接触几率；本发明所利用的微纹路制作技术方便快捷且成本低廉，为该微流控芯片的大规模应用提供了可能。

Description

基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片及制作方法
技术领域
本发明涉及用于医学早期诊断中的基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片，属于生物医学检测和微流体控制科学领域。
背景技术
癌症细胞是指不受有机体控制大量繁殖并入侵周围生物组织最终转移至有机体各个部位的细胞。癌症细胞早期检测对改进癌症诊断方法和治疗方法有重要意义。由于处于早期癌症的患者血液中循环癌症细胞含量稀少，加之早期的循环癌细胞尺寸过小且初始的病变部位不明确，使早期癌细胞检测成为生物医学检测中的难题。
传统的癌细胞早期检测方法包括离心分离法，色层分析法，荧光反应法等。但这些方法一般都需要依靠复杂昂贵的设备和有经验的专业人员来实现，而且检测效率低下，经过检测的基液污染严重无法用于后续研究。随着微细加工技术和癌症检测技术的不断发展，微流控检测芯片因其卓越的处理效率，简单的操作方法成为癌症检测领域的研究热点。由于芯片中流道一般为为几十至几百微米，故而可以提供很高的表面体积比，可使细胞与流道表面移植的特异性识别抗体充分接触，快速高效地从极少量的血液样品中分离出癌细胞。同时微流控检测芯片由于结构简单，对检测样品的污染相对较小，另外分离后的癌细胞还可以用于后续的分析研究中。
目前主流的微流控芯片检测癌细胞的方法主要有三种。第一种是基于细胞亲和的微色层分析法。相较于传统色层分析法，微色层分析法是指在微流道的表面培养一层可识别癌细胞的高亲和性配体，当细胞混合液通过微流道时，配体与癌细胞接触而捕获癌细胞，达到分离正常细胞和癌细胞的目的。第二种是利用癌细胞尺寸进行捕获和分离。由于癌细胞比起正常体细胞稍大，通过设计独特的流道形状，可以从细胞混合液中筛选出癌细胞。此种方法的优势是不需要了解癌细胞表面的靶抗原信息即可分离癌细胞。第三种方法是片上细胞介电泳分离法。介电泳是指极化细胞在非匀强电场下的受力现象。细胞所受介电泳力的大小和细胞质的成分，细胞壁的厚度以及细胞的尺寸都有关。当在芯片上施加合适的电场时，就可以通过癌细胞对电场的特殊响应分离癌细胞。这三种方法均有不足，例如第一种方法尽管利用了微流道技术，但检测效率依然很低，因为要保证配体和细胞充分接触，流速不能过快，制约了捕获效率。第二种方法缺点较为明显，由于利用癌细胞本身的尺寸进行分离，不可避免地使癌细胞与流道避免接触，有时会破坏细胞壁，使捕获的癌细胞存活率降低。第三种方法的问题在于无法保证分离出的癌细胞纯度。由于细胞的细胞质组成复杂，而影响介电泳力的因素也很多，这就导致在同一非匀强电场下不同细胞的受力可能相同，最终导致分离的癌细胞中夹杂正常细胞，影响检测的准确性。
因此，现阶段急需开发一种制作简单、操控方便、成本低廉的癌细胞捕获芯片，实现高效捕捉试样中微量癌细胞的目标。
发明内容
本发明就是针对现有的技术不足，提供一种基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片。本发明的目的在于，针对现有的细胞亲和微色层分析法效率低下的问题，本发明通过在微流道表面制作出微米级纹路，间接增加了流道的表面积，增大了固定的抗体与细胞的接触几率。
为解决上述问题，本发明提供了一种基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片，包括一基底模块和一流道模块，所述流道模块上设有芯片流道及微纹路，且所述芯片流道及微纹路的起点或终点设有微流控芯片进样口。
进一步的，所述芯片流道及微纹路呈U型持续连接状。
更进一步的，所述流道模块和基底模块的尺寸均为40×40×2mm3。
本发明还提供了一种基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片的制作方法，具体步骤如下：
(1)制作PDMS模具，使用绘图软件绘制PDMS聚合物芯片流道的形状图，用高分辨的打印机制作光刻掩模版，通过光刻方法制作芯片模具以及用于氧离子刻蚀的弹性掩模版模具。
(2)制作微流控芯片，将PDMS基液和固化剂按10：1的质量比进行混合，充分搅拌后利用超声波震荡仪做进一步混合，真空去泡20min后浇铸在步骤(1)中的芯片模具和掩模版模具上，微流控芯片分为流道模块和基底两个部分；流道模块和基底均为40×40×2mm3的块状PDMS，弹性掩模版的尺寸为40×40×0.5mm3。
(3)制作流道上微纹路，将弹性掩模版和微流控芯片的流道模块在显微镜下对准后放置在特殊设计的拉伸夹具上固定，在横纵两个方向各拉伸5mm，并放入深度反应离子刻蚀机中进行氧离子照射，刻蚀机的参数设置为：压力：80mTor，ICP功率：1000W，RIE功率：20W，氧气流量：80sccm，反应时间：180s。
反应过后，以缓慢释放所施加的拉力，当拉力完全释放后，即在基底表面形成了微米级的人字形纹路。
(4)芯片键和处理，在10000级无尘室中将步骤(3)得到的流道模块与PDMS基底分别进行紫外灭菌处理24小时，然后通过离子键和，得到半成品。
(5)芯片流道化学改性，将含有1mg/mL特异性抗体的磷酸缓冲液通过芯片进样口步骤(4)所得半成品芯片内，使其充满流道中并保持30s，再用混合缓冲液以D-PBS为基液(含4.5g/Lglucose，5mmol/LMgCl2，0.1mg/mLyeasttRNA，1mg/mLBSA，10％FBS)冲洗流道，制得微流控芯片成品。
本发明通过在微流道表面制作出微米级纹路，间接增加了流道的表面积，增大了固定的抗体与细胞的接触几率。同时流道中的人字形纹路直接破坏了流体的层流状态，增加了流体阻力，进一步增加了细胞与流道上抗体的接触几率，使癌细胞和配体之间的亲和反应快速高效的进行。另外区别于传统的软光刻方法，本发明所利用的微纹路制作技术方便快捷且成本低廉，为该微流控芯片的大规模应用提供了可能。
附图说明
图1所示的是本发明中流道模块立体示意图；
图2所示的是本发明中弹性掩模版立体示意图；
图3所示的是本发明中拉伸夹具立体示意图；
图4所示的是本发明中带微纹路的流道的结构示意图；
图5所示的是本发明中微流控芯片示意图；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
由图5所示，一种基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片，包括一基底模块1和一流道模块2，流道模块和基底模块的尺寸均为40×40×2mm3；在流道模块2上设有呈U型持续连接状的芯片流道及微纹路3，且芯片流道及微纹路3的起点或终点设有微流控芯片进样口4。
本发明还提供了一种基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片的制作方法，具体步骤如下：
(1)制作PDMS模具，使用绘图软件绘制PDMS聚合物芯片流道的形状图，用高分辨的打印机制作光刻掩模版。通过光刻方法制作芯片模具以及用于氧离子刻蚀的弹性掩模版模具。
(2)制作微流控芯片，将PDMS基液和固化剂按10：1的质量比进行混合，充分搅拌后利用超声波震荡仪做进一步混合。真空去泡20min后浇铸在步骤1中的芯片模具和掩模版模具上。微流控芯片分为流道模块和基底两个部分。流道模块和基底均为为40×40×2mm3的块状PDMS。弹性掩模版的尺寸为40×40×0.5mm3。制作好的流道模块和弹性掩模版示意图如图1和图2所示。
(3)制作流道上微纹路，将弹性掩模版和微流控芯片的流道模块在显微镜下对准后放置在特殊设计的拉伸夹具上固定(如图3)，在横纵两个方向各拉伸5mm，并放入深度反应离子刻蚀机中进行氧离子照射，刻蚀机的参数设置为：压力：80mTor，ICP功率：1000W，RIE功率：20W，氧气流量：80sccm，反应时间：180s，反应过后，以缓慢释放所施加的拉力。当拉力完全释放后，即在基底表面形成了微米级的人字形纹路(图4)。
(4)芯片键和处理，在10000级无尘室中将步骤3得到的流道模块和与PDMS基底分别进行紫外灭菌处理24小时，然后通过离子键和，得到半成品。如图5所示。
(5)芯片流道化学改性，将含有1mg/mL特异性抗体的磷酸缓冲液通过芯片进样口步骤(4)所得半成品芯片内，使其充满流道中并保持30s，再用混合缓冲液(以D-PBS为基液，含4.5g/Lglucose，5mmol/LMgCl2，0.1mg/mLyeasttRNA，1mg/mLBSA，10％FBS)冲洗流道，制得微流控芯片成品。

Claims (4)

1.基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片，其特征在于，包括一基底模块和一流道模块，所述流道模块上设有芯片流道及微纹路，且所述芯片流道及微纹路的起点或终点设有微流控芯片进样口。
2.根据权利要求1所述的基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片，其特征在于，所述芯片流道及微纹路呈U型持续连接状。
3.根据权利要求1所述的基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片，其特征在于，所述流道模块和基底模块的尺寸均为40×40×2mm3。
4.基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片的制作方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)制作PDMS模具，使用绘图软件绘制PDMS聚合物芯片流道的形状图，用高分辨的打印机制作光刻掩模版，通过光刻方法制作芯片模具以及用于氧离子刻蚀的弹性掩模版模具；
(2)制作微流控芯片，将PDMS基液和固化剂按10：1的质量比进行混合，充分搅拌后利用超声波震荡仪做进一步混合，真空去泡20min后浇铸在步骤(1)中的芯片模具和掩模版模具上，微流控芯片分为流道模块和基底两个部分；流道模块和基底均为40×40×2mm3的块状PDMS，弹性掩模版的尺寸为40×40×0.5mm3；
(3)制作流道上微纹路，将弹性掩模版和微流控芯片的流道模块在显微镜下对准后放置在特殊设计的拉伸夹具上固定，在横纵两个方向各拉伸5mm，并放入深度反应离子刻蚀机中进行氧离子照射，反应过后，以缓慢释放所施加的拉力，当拉力完全释放后，即在基底表面形成了微米级的人字形纹路；
(4)芯片键和处理，在10000级无尘室中将步骤(3)得到的流道模块与PDMS基底分别进行紫外灭菌处理24小时，然后通过离子键和，得到半成品；
(5)芯片流道化学改性，将含有1mg/mL特异性抗体的磷酸缓冲液通过芯片进样口步骤(4)所得半成品芯片内，使其充满流道中并保持30s，再用混合缓冲液以D-PBS为基液(含4.5g/Lglucose，5mmol/LMgCl2，0.1mg/mLyeasttRNA，1mg/mLBSA，10％FBS)冲洗流道，制得微流控芯片成品。5、根据权利要求4所述的基于流道表面微米级纹路的癌症细胞检测微流控芯片的制作方法，其特征在于，所述步骤(3)中刻蚀机的参数设置为：压力：80mTor，ICP功率：1000W，RIE功率：20W，氧气流量：80sccm，反应时间：180s。
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