CN104267195A - 一种炎症多指标检测试剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种炎症多指标检测试剂及试剂盒，包括多指标检测板、多指标组合反应液、多指标组合标准品；所述多指标检测板设有矩阵分布的检测孔，检测孔分别经过PCT、IL6、IL18、IFN-γ中的2-4种不同的检测指标蛋白或其抗体包被，每一纵列孔内包被一种相同的蛋白或抗体，不同纵列孔内包被的蛋白或抗体不同；所述多指标组合反应液是含有2-4种能与上述检测指标特异结合的预标记抗体的混合液；所述多指标组合标准品为已知浓度的或经梯度稀释的上述检测指标蛋白的混合液。本发明的一种炎症多指标检测试剂盒，不仅适合于检测是否有炎症，还能帮助分析炎症类型，有助于疾病的早期发现和诊断。

Description

一种炎症多指标检测试剂及试剂盒
技术领域
本发明属于免疫监测技术领域，具体是涉及一种炎症多指标检测试剂及试剂盒。
背景技术
炎症是诸多疾病的征兆，是机体对外来物、病原体、组织损伤、自身免疫性疾病以及其他有害刺激的保护性反应。炎症的表现包括：血管舒张、血管通透性增加、血液涌入、血浆渗漏、嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润和活化涌入。这也是为什么炎症往往伴随着局部组织发烧、红肿等症状。炎症反应在限制外来物质、吞噬病原体和组织碎片中起重要作用。急性炎症是初始相位，是为了消除入侵的外来物质、病原体和其他有害刺激；然而，如果刺激持续存在，急性炎症就会发展成慢性炎症。在慢性炎症过程中，组织会不停地被破坏、细胞类型会被不断被轮换。炎症过程受多种细胞因子调控，而细胞因子的类型会因炎症的原因，位置和严重性而不同。因此，检测细胞因子的类型和含量对理解炎症及其背后的疾病有非常重要的意义。
降钙素原(procalcitonin，PCT)是诊断和监测细菌性感染炎症的特异性指标。PCT是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，它在血浆中的水平升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。
白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)作为一种细胞因子，是一种在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，可以鉴定急性炎症。IL-6有刺激肝细胞产生一系列急性期蛋白的作用，参与炎症反应和发热反应，某些人体肿瘤细胞、特别是骨髓瘤细胞，可分泌IL-6作为自身生长因子刺激其生长。
白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是从小鼠及人的肝细胞中克隆得到的一种新的细胞因子，人的IL-18主要由单核-巨噬细胞产生，主要介导细胞免疫反应，可用于鉴定自身免疫性炎症。IL-18可刺激Th1细胞分泌多种细胞因子，促进Th1细胞增殖，诱导调节Th1细胞的分化成熟和促进Th1细胞为主的细胞免疫反应；并增强NK细胞的溶解活性，既可促进Fas-FasL配体介导的NK细胞的细胞毒活力，又可促进穿孔素介导的NK细胞对靶细胞传统杀伤活性。
干扰素(Interferon，IFN)是动物细胞在受到某些病毒感染后分泌的具有抗病毒功能的宿主特异性糖蛋白。细胞感染病毒后分泌的干扰素能够与周围未感染的细胞上的相关受体作用，促使这些细胞合成抗病毒蛋白防止进一步的感染，从而起到抗病毒的作用。干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)是由免疫系统中的T细胞和自然杀伤细胞产生的一种水溶性二聚体细胞因子，是II型干扰素的唯一成员。最初叫巨噬细胞活化因子。
目前临床上用于检测判断炎症的指标不多，而且是单项检测，与疾病关联的特异性不强，比如，血液中白细胞升高被视为炎症的金指标，但对于分析什么类型炎症，什么原因引起的炎症却无能为力。因此，检测是否有炎症，并且帮助分析炎症类型，比如：病毒性炎症、细菌性炎症、急性炎症、自身免疫疾病炎症，非常有助于疾病的早期发现和诊断。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种炎症检测试剂盒，不仅适合于检测是否有炎症，还能帮助分析炎症类型，有助于疾病的早期发现和诊断。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种炎症多指标检测板，检测板由透明聚丙烯或聚苯乙烯塑料压模制得,含有2-4组，每组3个或3个以上可盛装50-500μl液体的检测孔，每组的检测孔是经由：PCT、IL6、IL18、IFN-γ中的任一蛋白或其抗体包被过的；同组的检测孔中包被的蛋白或其抗体相同，不同组的检测孔中包被的蛋白或其抗体不同。
进一步的，所述检测板是一种4指标检测板，检测板上设置有4组，每组8个检测孔连排组成的矩阵孔，矩阵孔的上方自左至右分别标记有：PCT、IL6、IL8、IFN-γ，矩阵孔的左边自上而下分别标记有：阳性对照、阴性对照、试样1、试样2、试样3、试样4、试样5、空白,矩阵孔自左至右纵列是分别经过PCT、IL6、IL18、IFN-γ4指标蛋白或其抗体包被过的。
进一步的，所述多指标检测板上设置有12组，每组8个检测孔，连排组成的矩阵孔，其中：有3组的检测孔包被有相同的PCT蛋白或其抗体，有3组的检测孔包被有相同的IL6蛋白或其抗体，有3组的检测孔包被有相同的IL18蛋白或其抗体，有3组的检测孔包被有相同的IFN-γ蛋白或其抗体。
一种炎症检测用多指标组合标准品，多指标组合标准品是含有下述指标蛋白：PCT、IL6、IL18、IFN-γ中的任意2-4种的混合液。
进一步的，所述多指标组合标准品中各指标蛋白浓度为PCT：3000pg/ml,IL-6：300pg/ml,IL-18：1000pg/ml,IFN-γ：1000pg/ml。
进一步的，所述多指标组合标准品是组合阳性对照液和组合阴性对照液，所述组合阳性对照液中各指标蛋白及其浓度为PCT：500-1000pg/ml,IL-6：30-60pg/ml,IL-18：150-300pg/ml,IFN-γ：130-260pg/ml；所述组合阴性对照液中各指标蛋白及其浓度为PCT:0-500pg/ml,IL-6:0-30pg/ml,IL-18:0-150pg/ml,IFN-γ:0-130pg/ml。
一种炎症检测用多指标组合反应液，多指标组合反应液同时包含有下述2-4种能与被检指标蛋白：PCT、IL6、IL18、IFN-γ特异结合的预标记抗体或受体蛋白的混合液；所述被检指标蛋白PCT、IL6、IL18、IFN-γ各自所对应的预标记抗体或受体蛋白的终浓度分别为：0.1-1μg/ml，0.2-2μg/ml，0.1-2μg/ml，0.1-1μg,最好是：0.2μg/ml，0.5μg/ml，0.3μg/ml，0.3μg/ml。
进一步的，所述预标记抗体或受体蛋白的标记分子可以是：过氧化氢酶、碱性磷酸酶、荧光化合物或纳米量子点。
一种炎症多指标检测试剂盒，包括权利要求1所述的多指标检测板、权利要求8所述的多指标组合反应液、权利要求4所述的多指标组合标准品、样品稀释液、洗涤液及显色液，所述的样品稀释液是含有0.1-0.5％柠檬酸三钠的pH值7.4的PBS缓冲液。
进一步的，炎症多指标检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)试样稀释：分别将待测试样用样品稀释液稀释2-5倍，混匀备用；
(2)加样反应：在多指标检测板的阳性对照孔、阴性对照孔、试样孔和空白孔中分别加入阳性对照液、阴性对照液、稀释后的试样和样品稀释液，然后在每个孔中再加入组合反应液，混合后室温或37℃孵育10-60min；
(3)显色反应：倒空检测孔中液体，用洗涤液洗孔1-3次后加入显色液，静置显色，观察检测孔内颜色变化，或测定检测孔内液体的吸光度(OD)；
(4)结果分析：通过与阳性对照及阴性对照的对比或通过标准曲线定量，来判读或计算试样中各项检测指标的浓度(含量)。
一种制备上述炎症多指标检测试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)制备多指标检测板；
(2)配制多指标组合反应液；
(3)配制多指标组合标准品
1)配制组合阳性对照液；
2)配制组合阴性对照液；
(4)配制样品稀释液
将柠檬酸三钠溶解于PBS缓冲液,调pH值至7.4，制成含0.4％柠檬酸三钠的PBS缓冲液，分装后低温储存备用；
(5)配制显色液
取TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)20mg与100ml的10mM(pH4)柠檬酸缓冲液混合,再加入3％过氧化氢溶液1ml，充分混匀后,分装后避光低温储存备用。
(6)配制洗涤液
取PBS溶液1L，加入1ml吐温20(Tween20)，充分混匀，分装后低温储存备用。
(7)取上述步骤(1)-(6)所制备的多指标检测板1个、多指标组合反应液1管、组合阳性对照液1管、组合阴性对照液1管、样品稀释液1瓶、显色液1管、洗涤液1瓶，合装于一个盒子内，得到炎症检测试剂盒。
进一步的，所述多指标检测板由如下步骤制备得到：
(1)制模，用透明聚丙烯或聚苯乙烯塑料压模制得，矩阵孔的上方自左至右分别标记检测指标蛋白名称，矩阵孔的下方自左至右分别标记数字编号，矩阵孔的左边自上而下分别标记分组名称；
(2)按照多克隆抗体制备方法、单克隆抗体制备方法或购买得到检测指标蛋白的抗体，用0.1M,pH＝8的Tris缓冲液分别将蛋白的特异抗体配制成浓度为1μg/ml抗体包被液；
(3)在检测孔内分别按照标记的名称添加100μl上述抗体包被液，在室温下孵育4h后,倒空板,用PBS冲洗各孔3次,然后,在各孔内添加200μl的2％BSA-PBS封闭液,在室温下孵育4h,用PBS冲洗各孔3次,然后,在45℃下干燥，将该多指标检测板抽真空密封于铝袋内,储存在低温干燥冰箱备用。
进一步的，所述多指标组合反应液由如下步骤制备得到:
(1)将EDC、HRP、检测指标蛋白单克隆抗体按摩尔数20：1：1溶解于PBS缓冲液，并在室温反应2h；
2)通过透析去除游离的EDC，进一步通过HPLC纯化获得高纯度HRP-检测指标蛋白抗体偶联物；
3)分别制备得到HRP-PCT抗体偶联物、HRP-IL6抗体偶联物、HRP-IL18抗体偶联物、HRP-IFN-γ抗体偶联物中的2-4种；
4)取10ml含有1％BSA的PBS溶液，逐个加入步骤3)中的HRP-PCT检测指标蛋白抗体，充分混匀得到组合反应液，分装后低温储存备用。
进一步的，所述多指标组合标准品由如下步骤制备得到:
(1)配制组合阳性对照液：选用纯化的并经准确定量的以下2-4种检测指标蛋白，按照下述各蛋白浓度用含有1％BSA的PBS溶液溶解配制而成，分装后低温储存备用，各蛋白浓度：PCT 500-1000pg/ml,IL-630-60pg/ml,IL-18150-300pg/ml,IFN-γ130-260pg/ml；
(2)配制组合阴性对照液：选用纯化的并经准确定量的以下2-4种检测指标蛋白，按照下述各蛋白浓度用含有1％BSA的PBS溶液溶解配制而成，分装后低温储存备用，各蛋白浓度：PCT 0-500pg/ml,IL-60-30pg/ml,IL-180-150pg/ml,IFN-γ0-130pg/ml。
本发明具有的优点和积极效果是：可在一次试验中同时检测多个炎症检测指标,从而实现快速鉴别炎症类型，而且使得所测得的各指标的含量及其比例关系更具可比性,因此能更准确地用于鉴别炎症类型及其关联的疾病。
附图说明
图1是本发明的炎症多指标检测板的正视图；
图2是本发明实施例12中炎症指标标准曲线。
图1中：1.检测板，2.检测孔。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1
一种炎症多指标检测试剂盒，包括：
(1)1个多指标检测板1(32孔)：检测板1上设置有4组，每组8个检测孔2连排组成的矩阵孔，矩阵孔的上方自左至右分别标记：PCT、IL6、IL8、IFN-γ，矩阵孔的下方自左至右分别标记：1、2、3、4，矩阵孔的左边自上而下分别标记：阳性对照、阴性对照、试样1、试样2、试样3、试样4、试样5、空白，每一竖列按照标记所示分别包被PCT抗体(列1)、IL-6抗体(列2)、IL-18抗体(列3)、IFN-γ抗体(列4)；
(2)1管多指标组合反应液(2ml)：为HRP-PCT抗体、HRP-IL6抗体、HRP-IL18抗体、HRP-IFN-γ抗体的混合液，各标记抗体的终浓度为：HRP-PCT抗体：0.2μg/ml，HRP-IL6抗体：0.5μg/ml，HRP-IL18抗体：0.3μg/ml，HRP-IFN-γ抗体：0.3μg/ml；
(3)1管组合阳性对照液(0.5ml)：各蛋白浓度：PCT：1000pg/ml,IL-6：60pg/ml,IL-18：300pg/ml,IFN-γ：260pg/ml；
(4)1管组合阴性对照液(0.5ml)：各蛋白浓度：PCT：500pg/ml,IL-6：30pg/ml,IL-18：150pg/ml,IFN-γ：130pg/ml；
(5)1瓶样品稀释液(20ml)：0.4％柠檬酸三钠的PBS缓冲液；
(6)1管显色液(4ml)：TMB溶液；
(7)1瓶洗涤液(100ml)：0.1％吐温20的PBS溶液。
实施例2
一种实施例1中多指标检测板的制备方法，包括如下步骤:
(1)按图1所示制模,用透明聚丙烯塑料压模制得，检测板1含有32个检测孔2，由4组连排的8孔条组成，矩阵孔的上方自左至右分别标记：PCT、IL6、IL8、IFN-γ，矩阵孔的下方自左至右分别标记：1、2、3、4，矩阵孔的左边自上而下分别标记：阳性对照、阴性对照、试样1、试样2、试样3、试样4、试样5、空白；
(2)制备抗PCT、IL-6、IL-18及IFN-γ4蛋白的抗体，用0.1M,pH＝8的Tris缓冲液分别将4个蛋白的特异抗体配制成浓度为1μg/ml抗体包被液；
(3)在步骤(1)制得的检测板中标记有PCT、IL6、IL8、IFN-γ的各列检测孔内分别添加100μl上述抗体包被液:PCT抗体(列1)、IL-6抗体(列2)、IL-18抗体(列3)、IFN-γ抗体(列4)，在室温下孵育4h后,倒空板,用PBS冲洗所有板孔3次,然后,在各孔内添加200μl的2％BSA-PBS封闭液,在室温下孵育4h,用PBS冲洗各孔3次,然后,在45℃下干燥，将该检测板抽真空密封于铝袋内,储存在低温干燥冰箱备用。
实施例3
一种实施例1中多指标组合反应液的制备方法，包括如下步骤:
(1)将EDC、HRP、PCT单克隆抗体按摩尔数20：1：1溶解于PBS缓冲液，并在室温反应2h；
(2)通过透析去除游离的EDC，进一步通过HPLC纯化获得高纯度的HRP-PCT抗体偶联物；
(3)分别制备HRP-IL6抗体、HRP-IL18抗体、HRP-IFN-γ抗体；
(4)取10ml含有1％BSA的PBS溶液，逐个加入HRP-PCT抗体2μg，HRP-IL6抗体5μg，HRP-IL18抗体3μg，HRP-IFN-γ抗体3μg，充分混匀便得组合反应液，其中各标记抗体的终浓度为：HRP-PCT抗体0.2μg/ml，HRP-IL6抗体0.5μg/ml，HRP-IL18抗体0.3μg/ml，HRP-IFN-γ抗体0.3μg/ml；
(5)将组合反应液按2ml/管，分装后低温储存备用。
实施例4
一种实施例1中组合阳性对照液的制备方法，包括如下步骤:
选用纯化的并经准确定量的4个蛋白：PCT、IL-6、IL-18、IFN-γ，按下述各蛋白浓度用含有1％BSA的PBS溶液溶解配制而成，各蛋白浓度：PCT 1000pg/ml,IL-660pg/ml,IL-18300pg/ml,IFN-γ260pg/ml，将组合阳性对照液按0.5ml/管，分装后低温储存备用。
实施例5
一种实施例1中组合阴性对照液的制备方法，包括如下步骤:
选用纯化的并经准确定量的4个蛋白：PCT、IL-6、IL-18、IFN-γ，按下述各蛋白浓度用含有1％BSA的PBS溶液溶解配制而成，各蛋白浓度：PCT 500pg/ml,IL-630pg/ml,IL-18150pg/ml,IFN-γ130pg/ml,将组合阴性对照液按0.5ml/管，分装后低温储存备用。
实施例6
一种实施例1中样品稀释液的制备方法，包括如下步骤:
将0.4g柠檬酸三钠溶解于100ml的PBS缓冲液,调pH值至7.4，将样品稀释液按20ml/瓶，分装后低温储存备用。
实施例7
一种实施例1中显色液的制备方法，包括如下步骤:
取TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)20mg，与100ml的10mM(pH＝4)柠檬酸缓冲液混合,再加入3％过氧化氢溶液1ml，充分混匀后,按4ml/管分装后避光低温储存备用。
实施例8
一种实施例1中洗涤液的制备方法，包括如下步骤:
取PBS溶液1L，加入1ml吐温20(Tween20)，充分混匀后按100ml/瓶分装后低温储存备用。
实施例9
一种炎症多指标检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
取上述实施例2制备的多指标检测板1个(32孔)、实施例3制备的多指标组合反应液1管(2ml)、实施例4制备的组合阳性对照液1管(0.5ml)、实施例5制备的组合阴性对照液1管(0.5ml)、实施例6制备的样品稀释液1瓶(20ml)、实施例7制备的显色液1管(4ml)及实施例8制备的洗涤液1瓶(100ml)，合装于一个盒子内，便得炎症检测试剂盒。
实施例10
一种炎症多指标检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)取实施例9所述的炎症多指标检测试剂盒一套，取出检测板及各试剂；
(2)试样稀释：取6个试验管，每管分别加样品稀释液0.5ml，标注S1，S2，S3，S4，S5，So，分别在S1，S2，S3，S4，S5中加入0.5ml的试样血液(或血清)#1、#2、#3、#4、#5，So管不加试样(仅稀释液)，混匀备用；
(3)加样反应：在检测板的各检测孔中，按表1所示，在标有试样1至试样5的各行中分别加入50μl稀释的试样S1、S2、S3、S4、S5，在标有空白的行中分别加入50μl So(仅稀释液)，在标有阳性对照行中，分别加入50μl组合阳性对照液，在标有阴性对照行中，分别加入50μl组合阴性对照液，再在所有检测孔中加入组合反应液，每孔50μl，轻晃混匀，在室温下孵育30min；
表1，检测板的各检测孔加样情况
(4)洗涤及显色：倒空检测孔，用洗涤液冲洗各孔3次,然后在吸水纸上倒拍检测板以便甩干孔中残留液,再在所有孔中加入显色液，每孔100μl，室温孵育5分钟，至阳性对照、阴性对照和空白的蓝色有显著色差；
(5)结果分析：显色结果如表2所示，++++、+++、++、+分别代表蓝色自深至浅，-代表无色，+为正常，++为弱样性，+++或以上为强阳性，根据显色结果判读如下：
试样1有急性炎症，可能是病毒感染；
试样2可能有自身免疫疾病炎症；
试样3有细菌感染急性炎症；
试样4正常无炎症；
试样5有轻微不明急性炎症。
表2，检测板的各检测孔显色情况
实施例11
一种炎症多指标检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)96孔检测板制备
1)配制抗体包被液：将抗PCT、IL-6、IL-18及IFN-γ4个蛋白的抗体用0.1M,pH＝8的Tris缓冲液稀释配制成浓度为1μg/ml抗体包被液；
2)取一市购96-孔酶标板，按表3在标记有PCT、IL6、IL8、IFN-γ的各列检测孔内分别添加100μl上述抗体包被液:PCT抗体(列1、5、9)、IL-6抗体(列2、6、10)、IL-18抗体(列3、7、11)、IFN-γ抗体(列4、8、12)，在室温下孵育4h后,倒空板,用PBS冲洗所有板孔3次,然后,在各孔内添加200μl的2％BSA-PBS封闭液,在室温下孵育4h,用PBS冲洗各孔3次,然后,在45℃下干燥，将该检测板抽真空密封于铝袋内,储存在低温干燥冰箱备用；
表3，96孔检测板中各检测指标蛋白的抗体包被布局
(2)组合蛋白标准品制备：选用纯化的并经准确定量的4个蛋白：PCT、IL-6、IL-18、IFN-γ，按下述各蛋白浓度，用含有1％BSA的PBS溶液溶解配制而成：PCT 3000pg/ml,IL-6300pg/ml,IL-181000pg/ml,IFN-γ1000pg/ml，将组合标准品液按0.5ml/管分装后低温储存备用；
(3)按照实施例3的方法制备组合反应液，按5ml/管分装后低温储存备用；
(4)按照实施例7的方法制备显色液，按10ml/管分装后低温储存备用；
(5)取步骤(1)制备的检测板1个(96孔)、步骤(2)制备的组合蛋白标准品1管(0.5ml)、步骤(3)制备的组合反应液1管(5ml)、步骤(4)制备的显色液1管(10ml)、实施例6制备的样品稀释液1瓶(20ml)及实施例8制备的洗涤液1瓶(100ml)，合装于一个盒子内，便得炎症检测试剂盒。
实施例12
一种炎症多指标检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)取实施例11所述的炎症多指标检测试剂盒一套，取出检测板及各试剂；
(2)标准品添加：如表4中#1-4列所示，在检测板的A1孔、A2孔、A3孔、A4孔各加50μl组合标准品(标1)，含PCT 3000pg/ml,IL-6300pg/ml,IL-181000pg/ml,IFN-γ1000pg/ml，在#1-4列的B-H各孔中加入25μl样品稀释液，从A1-A4各孔取25μl转移到B1-B4孔(标2)，混合后从该4孔中各取25μl转移到B1-B4孔(标3)，混合后从该4孔中各取25μl转移到C1-C4孔(标4),如此反复作梯度稀释至G1-G4孔(标7)，混合后从该4孔中各取25μl弃掉,在H1-H4孔保持25μl样品稀释液(空白)；最后，再向列1-列4所有孔中加入25μl样品稀释液，至此列1-列4所有孔中液体量均为50μl；
表4，96孔检测板中标准品及试样添加位置
(3)试样稀释及加样反应：
1)取17个小试管，每管分别加样品稀释液0.5ml，标注S1-S16、So；分别在对应的管中加入0.5ml的试样血液(或血清)#1-#16，在So管不加试样(仅有稀释液)，混匀备用；
2)在检测板的各检测孔中，按表4中#5-12列所示，在标有S1-S16的孔中分别加入50μl稀释的试样S1-S16；再在所有检测孔中加入组合反应液，每孔50μl，轻晃混匀，在37℃孵育30min；
(4)洗涤及显色：孵育完成后倒空检测孔，用洗涤冲洗各孔3次,然后在吸水纸上倒拍检测板以便甩干孔中残留液,再在所有孔中加入TMB显色液，每孔100μl，室温孵育至加标准品的孔有蓝色梯度出现，用酶标仪在370nm波长下读板(测各个孔的OD值)。读板结果如表5所示；
表5，检测96孔检测板各检测孔OD值结果
(5)结果分析：根据各指标标准品在检测孔中(表5中#1-4列)的检测结果(OD370值)和其对应的已知浓度，以各标准品浓度为横坐标，以所测OD370值为纵坐标，分别作各指标标准曲线如图2，图中A为PCT标准曲线，图中B为IL-6标准曲线，图中C为IL-18标准曲线，图中D为IFN-γ标准曲线；根据图2中各指标标准曲线及表5中所检测的各试样OD370值，将所测试样的OD370值，对着该指标标准曲线上找出与该OD370值所对应的位点，再从该点出发在横坐标上找出所对应的浓度，即是所测试样品中该指标浓度；如法，在其它指标标准曲线上找出对应各指标的浓度；各试样品所对应的各指标的含量(浓度)归纳在表6中；根据表6所示数据，可作如下判断：试样1、3、4、7、9、10和16(S1、S3、S4、S7、S9、S10、S16)各指标值正常，试样2(S2)中IL-6显著高于参考值疑似有急性炎症，试样5(S5)中IL-6和IFN-γ显著高于参考值，疑似有急性病毒感染，试样6、15(S6、S15)、中IFN-γ略高于参考值，疑似有病毒感染，试样8(S8)和试样11(S11)中IL-18显著高于参考值，疑似有自身免疫疾病，试样13(S13)中IL-18和IFN-γ值显著高于参考值疑似有自身免疫疾病或兼有病毒感染，试样12(S12)中PCT和IL-6显著高于参考值，疑似有急性细菌感染，试样14(S14)中PCT、IL-6和IFN-γ都显著高于参考值，疑似急性细菌兼病毒感染。
表6，所测样品中各指标的含量(pg/ml)
以上对本发明的较佳实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种炎症多指标检测板，其特征在于：所述检测板由透明聚丙烯或聚苯乙烯塑料压模制得,含有2-4组，每组3个或3个以上可盛装50-500μl液体的检测孔，每组的检测孔是经由：PCT、IL6、IL18、IFN-γ中的任一蛋白或其抗体包被过的；同组的检测孔中包被的蛋白或其抗体相同，不同组的检测孔中包被的蛋白或其抗体不同。
2.根据权利要求1所述的一种炎症多指标检测板，其特征在于：所述检测板是一种4指标检测板，检测板上设置有4组，每组8个检测孔连排组成的矩阵孔，矩阵孔的上方自左至右分别标记有：PCT、IL6、IL8、IFN-γ，矩阵孔的左边自上而下分别标记有：阳性对照、阴性对照、试样1、试样2、试样3、试样4、试样5、空白,矩阵孔自左至右纵列是分别经过PCT、IL6、IL18、IFN-γ4指标蛋白或其抗体包被过的。
3.根据权利要求1所述的一种炎症多指标检测板，其特征在于：所述多指标检测板上设置有12组，每组8个检测孔，连排组成的矩阵孔，其中：有3组的检测孔包被有相同的PCT蛋白或其抗体，有3组的检测孔包被有相同的IL6蛋白或其抗体，有3组的检测孔包被有相同的IL18蛋白或其抗体，有3组的检测孔包被有相同的IFN-γ蛋白或其抗体。
4.一种炎症检测用多指标组合标准品，其特征在于:所述多指标组合标准品是含有下述指标蛋白：PCT、IL6、IL18、IFN-γ中的任意2-4种的混合液。
5.根据权利要求4所述的一种炎症检测用多指标组合标准品，其特征在于：所述多指标组合标准品中各指标蛋白浓度为PCT：3000pg/ml,IL-6：300pg/ml,IL-18：1000pg/ml,IFN-γ:1000pg/ml。
6.根据权利要求4所述的一种炎症检测用多指标组合标准品，其特征在于：所述多指标组合标准品是组合阳性对照液和组合阴性对照液，所述组合阳性对照液中各指标蛋白及其浓度为PCT：500-1000pg/ml,IL-6：30-60pg/ml,IL-18：150-300pg/ml,IFN-γ：130-260pg/ml；所述组合阴性对照液中各指标蛋白及其浓度为PCT:0-500pg/ml,IL-6:0-30pg/ml,IL-18:0-150pg/ml,IFN-γ:0-130pg/ml。
7.一种炎症检测用多指标组合反应液，其特征在于:所述多指标组合反应液同时包含有下述2-4种能与被检指标蛋白：PCT、IL6、IL18、IFN-γ特异结合的预标记抗体或受体蛋白的混合液；所述被检指标蛋白PCT、IL6、IL18、IFN-γ各自所对应的预标记抗体或受体蛋白的终浓度分别为：0.1-1μg/ml，0.2-2μg/ml，0.1-2μg/ml，0.1-1μg,优选地：0.2μg/ml，0.5μg/ml，0.3μg/ml，0.3μg/ml。
8.根据权利要求7所述的一种炎症检测用多指标组合反应液，其特征在于:所述预标记抗体或受体蛋白的标记分子可以是：过氧化氢酶、碱性磷酸酶、荧光化合物或纳米量子点。
9.一种炎症多指标检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的多指标检测板、权利要求8所述的多指标组合反应液、权利要求4所述的多指标组合标准品、样品稀释液、洗涤液及显色液，所述的样品稀释液是含有0.1-0.5％柠檬酸三钠的pH值7.4的PBS缓冲液。
10.根据权利要求9所述的一种炎症多指标检测试剂盒，其特征在于：使用方法包括如下步骤：
1)试样稀释：分别将待测试样用样品稀释液稀释2-5倍，混匀备用；
2)加样反应：在多指标检测板的阳性对照孔、阴性对照孔、试样孔和空白孔中分别加入阳性对照液、阴性对照液、稀释后的试样和样品稀释液，然后在每个孔中再加入组合反应液，混合后室温或37℃孵育10-60min；
3)显色反应：倒空检测孔中液体，用洗涤液洗孔1-3次后加入显色液，静置显色，观察检测孔内颜色变化，或测定检测孔内液体的吸光度(OD)；
4)结果分析：通过与阳性对照及阴性对照的对比或通过标准曲线定量，来判读或计算试样中各项检测指标的浓度(含量)。
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