CN104212834A - 稳定表达人mate1转运体的细胞模型的构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供构建pcDNA3.1（+）-hMATE1重组质粒的方法，获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒用于构建MDCK-hMATE1、MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1三种细胞模型。建立的MDCK-hMATE1细胞模型在MDCK细胞上稳定高表达hMATE1，可作为快速、高通量筛选hMATE1的底物和抑制剂的研究模型；可预测由hMATE1介导的药物-药物相互作用；可运用本发明建立的MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1双转染细胞模型研究细胞对hOCT1/hOCT2和MATE1共同底物药物的转运研究。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及稳定表达人multidrug and toxin excretion protein 1(hMATE1)转运体的马丁达比狗肾上皮(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK)细胞模型的构建，共转染人有机阳离子转运体1(human organic cation transporter 1，hOCT1)和hMATE1的MDCK细胞模型的构建，共转染人有机阳离子转运体2(human organic cation transporter 2，hOCT2)和hMATE1的MDCK细胞模型的构建以及三种细胞模型的应用。
技术背景
随着对药物代谢研究的深入，由药物转运体介导的零相代谢和三相代谢在药物体内处置中的作用越来越受到关注。目前已发现solute carrier(SLC)超家族和ATP-binding carrier(ABC)超家族的多种转运体，如有机阳离子转运体(organic cation transporters,OCTs)、有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides,OATPs)、有机阴离子转运体(organic anion transporters,OATs)、MATEs、P-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)及乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)等在药物的体内处置过程中发挥着重要作用。其中MATEs家族的重要成员hMATE1由人SLC47A1(NM_018242.2)基因编码，主要分布在肝脏肝血窦侧肝细胞的胆毛细管一侧和肾小管上皮细胞刷状缘侧，可将多种代谢物和外源性物质外排至胆汁和尿液中[Atsushi Y.,Ken-ichi I.Importance of the multidrug and toxin extrusion MATE/SLC47A family to pharmacokinetics,pharmacodynamics/toxicodynamics and pharmacogenomics.British Jounal of Pharmacology.2011；164:1817-1825.]。hMATE1的底物范围非常广泛，涵盖生理条件下呈阳离子的化合物、两性化合物及阴离子化合物，外源性药物毒物及内源性代谢物。hMATE1的底物包括MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium)、TEA+(tetraethylammonium)、二甲双胍、西咪替丁、4’6-二脒基-2-苯基吲哚(4’6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、阿昔洛韦、普鲁卡因胺、奥沙利铂、非索非那定、百草枯、肌酐及两性化合物头孢氨苄，其底物谱与hOCT1、hOCT2的底物谱有很大的重叠性。由于hOCT1主要分布在人肝脏肝血窦一侧的肝细胞的基底侧膜上，hOCT2分布在人近端肾小管上皮细胞的基底侧膜上，并且已有研究通过免疫荧光法证明hOCT2和hMATE1共同存在于同一肾小管上皮细胞中[Hideyuki M.,Ken-ichi I.Precise comparison of protein localization among OCT,OAT and MATE in human kidney.Journal of pharmaceutical sciences.2013；102:3302-3308.]，且分别位于细胞的基底侧膜和刷状缘侧膜上，可见hOCTs和hMATE1在某些药物的处置中发挥共同作用。目前，药物在转运体层面的相互作用已被认为是引起代谢性药物相互作用的重要原因之一，在药物研发阶段有必要考察与转运体的关系。而常用的许多人源细胞系，低表达或不表达转运体；原代细胞来源困难，且原代细胞上转运体的表达量 也会随体外培养时间的延长而减少。因此构建稳定表达人源性转运体的细胞模型是体外研究药物与转运体相互作用的重要工具。
发明内容
本发明的目的之一是提供构建pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒的方法，通过以下步骤实现：先从冰冻人肾脏组织中提取总RNA，经逆转录PCR获得cDNA文库，通过设计含有Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ两个酶切位点的特异性引物(其核苷酸序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示)，以该cDNA为模板特异性扩增获得人SLC47A1基因的编码区域片段，得到的目的基因片段通过Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ两个酶切位点连接到表达载体质粒pcDNA3.1(+)-Hygro上，构建pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒。
获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒用于构建本发明中的MDCK-hMATE1、MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1三种细胞模型。
本发明的目的之二是提供利用获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒构建稳定表达hMATE1的MDCK-hMATE1细胞模型的构建方法，通过以下步骤实现：用本发明中获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转染MDCK细胞48小时后，在培养基中加入400μg/ml的潮霉素B进行抗性筛选，持续筛选两周后，通过有限稀释法挑选培养单克隆细胞，经过荧光底物DAPI初步筛选过量表达hMATE1的单克隆，采用Real-Time PCR法进行mRNA水平验证并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(引物序列见SEQ ID No：3、SEQ ID No：4)为内参进行hMATE1 mRNA(引物序列见SEQ ID No：5、SEQ ID No：6)的相对含量测定。MDCK-hMATE1细胞模型通过对经典底物MPP+和二甲双胍在有或无阳性抑制剂西咪替丁存在下的摄取能力进行功能确证。
完成构建的MDCK-hMATE1细胞可用于高通量快速筛选MATE1底物和抑制剂。底物筛选可通过以下步骤实现：在待研究药物孵育前，先用添加30mmol/LNH4Cl的人工摄取缓冲液(artificial uptake buffer,AUB)孵育20min，换成AUB继续孵育5min。完成前两步预孵育后方进行待研究药物的孵育。在MDCK-pcDNA3.1和MDCK-hMATE1细胞同时进行待研究药物孵育相同时间的实验，若待研究药物在MDCK-hMATE1细胞上的积聚量超过mock细胞上积聚量的2倍，则可认为待研究药物是MATE1的底物。抑制剂筛选可通过以下步骤实现：在待研究药物孵育前，先用添加30mmol/LNH4Cl的AUB孵育20min，换成AUB继续孵育5min。完成前两步预孵育后方进行待研究药物的孵育。MPP+、二甲双胍作为MATE1的经典底物，分别与不同浓度的待研究药物共孵育，通过检测药物对细胞内MPP+或二甲双胍积聚量的影响，计算待检测药物对MPP+或二甲双胍的抑制率及IC50值。MPP+和二甲双胍都采用液质联用法进行测定。
本发明的目的之三是提供利用获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒构建稳定表达hMATE1的MDCK-hOCT1/hMATE1细胞模型的构建方法，通过以下步骤实现：用pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转染MDCK-hOCT1细胞，挑选获得单克隆的方法、荧光底物DAPI的筛选方法与获得MDCK-hMATE1细胞模型的方法相同，进行mRNA相对含量测定时，以GAPDH(引物序列见SEQ ID No：3、SEQ ID No：4)为内参进行hMATE1(mRNA引物序列见SEQ ID No：5、SEQ ID No：6)的相对含量测定时，同时测定细胞中hOCT1 mRNA(引物序列如SEQ ID No：7、SEQ ID No：8所示)的相对含量，MDCK-hOCT1/hMATE1细胞进行MPP+的摄取实验验证功能。并测定MDCK-hOCT1/hMATE1单层细胞对西咪替丁的表观渗透系数(Apparet permeability parameters,Papp)并计算净外排率(Net efflux ratio)，在costar转运板的给药池加入20μmol/L西咪替丁，每20min在接收池取100μL缓冲液进行含量测定，加入新的缓冲液补足体积，转运实验进行2hrs。西咪替丁采用液质联用法进行测定。通过公式Papp＝dQ/(dt﹒A﹒C0)计算得到MDCK-hOCT1/hMATE1单层细胞对西咪替丁的表观渗透系数并进一步计算净外排率。
本发明的目的之四是提供利用获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒构建稳定表达hMATE1的MDCK-hOCT2/hMATE1细胞模型的构建方法，通过以下步骤实现：用pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转染MDCK-hOCT2细胞，挑选获得单克隆的方法、荧光底物DAPI的筛选方法以及运用MPP+进行功能确证的方法与获得MDCK-hOCT1/hMATE1细胞模型的方法相同，以GAPDH(引物序列见SEQ ID No：3、SEQ ID No：4)为内参测定mRNA相对含量时，同时测定hMATE1 mRNA(引物序列见SEQ ID No：5、SEQ ID No：6)、hOCT1mRNA(引物序列见SEQ ID No：7、SEQ ID No：8)和hOCT2 mRNA(引物序列SEQ ID No：9、SEQ ID No：10)三种mRNA的相对含量。
本发明获得的MDCK-hOCT2/hMATE1细胞可用于hOCT2和hMATE1共同底物的肾小管排泄研究，例如测定MDCK-hOCT2/hMATE1单层细胞对西咪替丁的表观渗透系数及净外排率。测定方法也是通过在costar细胞培养板上进行西咪替丁的转运实验，每20min取100μL接收池缓冲液测定西咪替丁的含量，加入新的缓冲液补足体积，转运进行2hrs。通过公式Papp＝dQ/(dt﹒A﹒C0)计算得到MDCK-hOCT2/hMATE1单层细胞对西咪替丁的表观渗透系数并进一步计算净外排率。
本发明的积极效果是：(1)建立的MDCK-hMATE1细胞模型在MDCK细胞上稳定高表达hMATE1，可作为快速、高通量筛选hMATE1的底物和抑制剂的研究模型，实施例4和实施例5中分别研究了氯化两面针碱和倒千里光碱是否为hMATE1的底物；(2)可应用MDCK-hMATE1细胞模型预测由hMATE1介导的药物-药物相互作用；(3)可运用本发明建 立的MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1双转染细胞模型研究细胞对hOCT1/hOCT2和MATE1共同底物药物的转运，如实施例6中通过西咪替丁的转运实验评测MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1单层细胞对西咪替丁的转运能力，结果说明MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1两个双转细胞模型均可分别用于hOCT1与hMATE1和hOCT2与hMATE1共同底物的转运研究。
附图说明
图1.人cDNA文库特异性扩增产物电泳鉴定图，泳道1为人SLC47A1的特异性引物PCR产物电泳条带，泳道M为Maker D2000的电泳条带。
图2.PCR纯化产物连接T载体转化大肠杆菌扩增后的质粒经HindⅢ、Kpn Ⅰ双酶切和Sal Ⅰ单酶切的鉴定图。图中19个泳道从左到右依次为：Maker D2000,hMATE1 PCR纯化产物,1→8号单克隆菌株质粒的双酶切处理产物，Maker D15000，1→8号单克隆菌株质粒的单酶切处理产物。
图3.pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转化大肠杆菌扩增后经HindⅢ、Kpn Ⅰ双酶切和Sal Ⅰ单酶切的鉴定图。图中9个泳道从左到右依次为：Maker D2000,hMATE1 PCR纯化产物，1→3号单克隆菌株的双酶切处理产物，Maker D15000，1→3号单克隆菌株的单酶切处理产物。
图4.MDCK-3.1细胞和MDCK-hMATE1多克隆细胞对荧光底物DAPI的积聚。MDCK-3.1和MDCK-hMATE1多克隆细胞经①人工摄取缓冲液(artificial uptake buffer,AUB)预孵育25min；②添加30 mmol/L NH4Cl的AUB预孵育20min后，换成AUB继续孵育5min；③AUB预孵育20min三种不同的预孵育方法后，加入1μmol/L DAPI的AUB孵育20min。以MDCK-3.1细胞经方法②孵育后细胞内相对荧光强度为单位1。数据以mean±SD表示，n＝3。
图5.MDCK-3.1细胞、MDCK-hMATE1多克隆细胞及A、B两批单克隆细胞对荧光底物DAPI的积聚。细胞以添加30mmol/L NH4Cl的AUB孵育20min后，用AUB继续预孵育5min，然后用含1μmol/L DAPI的AUB孵育20min，并采用BCA法测定蛋白含量，计算细胞内相对荧光强度。以MDCK-3.1细胞中的相对荧光强度值为单位1，数据以mean±SD表示，n＝3。
图6.MDCK-hMATE1 A28、B12和B22三株单克隆细胞对MPP+的积聚。细胞的预孵育方法同DAPI积聚实验。30mmol/L NH4Cl预孵育完成后，用含10μmol/L MPP+的AUB孵育3min，并采用BCA法进行蛋白校正。以MDCK-3.1细胞中MPP+相对积聚量为单位1，数据以mean±SD表示，n＝3。
图7.测定MDCK-hMATE1细胞中hMATE1 mRNA的相对表达量。以GAPDH为内参，数据以mean±SD表示，n＝3。
图8.MDCK-hMATE1细胞在有或无抑制剂西咪替丁共存情况下对经典底物MPP+(A)和二甲双胍(B)的积聚。孵育方法为细胞经添加30mmol/L NH4Cl的AUB预孵育20min后，用AUB继续孵育5min，然后用含10μmol/L MPP+(二甲双胍)或10μmol/L MPP+(二甲双胍)+100μmol/L西咪替丁的AUB孵育3min，并采用BCA法进行蛋白校正。以MDCK-3.1细胞中MPP+(二甲双胍)的相对积聚量为单位1，数据以mean±SD表示，n＝3。
图9.MDCK-hOCT1/pcDNA3.1细胞、MDCK-hOCT1/hMATE1多克隆细胞及各株单克隆细胞对荧光底物DAPI的积聚。细胞孵育与MDCK-hMATE1细胞一样经过30mmol/L NH4Cl预孵育后，DAPI孵育20min。以MDCK-1/3.1细胞中的相对荧光强度为单位1，数据以mean±SD表示，n＝3。
图10.MDCK-hOCT1/hMATE1单克隆细胞在有或无西咪替丁共存情况下对MPP+的积聚。实验方法与MDCK-hMATE1细胞相同。以MDCK-hOCT1/3.1细胞中MPP+的相对积聚量为单位1，数据以mean±SD表示，n＝3。
图11.测定MDCK-hOCT1/hMATE1细胞中hMATE1和hOCT1 mRNA的相对表达量。以GAPDH为内参，数据以mean±SD表示，n＝3。
图12.MDCK-hOCT2/pcDNA3.1(2/3.1)细胞、MDCK-hOCT2/hMATE1多克隆(2/M)细胞及各株单克隆细胞对荧光底物DAPI的积聚。细胞孵育与MDCK-hMATE1细胞一样经过30mmol/L NH4Cl预孵育。以MDCK-2/3.1细胞中的相对荧光强度为单位1，数据以mean±SD表示，n＝3。
图13.MDCK-hOCT2/hMATE1单克隆细胞在有或无西咪替丁共存情况下对MPP+的积聚。实验方法与MDCK-hMATE1细胞相同。以MDCK-hOCT2/3.1细胞中MPP+的相对积聚量为单位1，数据以mean±SD表示，n＝3。
图14.测定MDCK-hOCT2/hMATE1细胞中hMATE1、hOCT1和hOCT2 mRNA的相对表达量。以GAPDH为内参，数据以mean±SD表示，n＝3。
图15.MDCK-hMATE1细胞上氯化两面针碱的动力学曲线。0.1-4μmol/L氯化两面针碱在MDCK-hMATE1和MDCK-3.1细胞上的孵育2min的积聚情况，数据以mean±SD表示，n＝3。
图16.倒千里光碱在MDCK-hMATE1细胞上的积聚。细胞对2μmol/L倒千里光碱在有或无抑制剂西咪替丁(100μmol/L)存在条件下孵育2min的积聚情况，以MDCK-3.1细胞中倒千里光碱单独给药的相对积聚量为100％，数据以mean±SD表示，n＝3。
图17.MDCK-hOCT1/3.1和MDCK-hOCT1/hMATE1细胞对西咪替丁表观渗透系数的测定。以3×105个/孔的密度种板培养，在给药池加入20μmol/L西米替丁，每20min在接收池取100μL缓冲液进行西米替丁含量测定，转运实验进行2小时。数据以mean±SD表示，n＝3。
图18.MDCK-hOCT2/3.1和MDCK-hOCT2/hMATE1细胞对西咪替丁表观渗透系数的测定。以3×105个/孔的密度种板培养，在给药池加入20μmol/L西米替丁，每20min在接收池取100μL缓冲液进行西米替丁含量测定，转运实验进行2小时。数据以mean±SD表示，n＝3。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1 pcDNA3-hMATE1重组质粒的构建
1.SLC47A1基因编码序列的获得
(1)根据人SLC47A1基因mRNA的编码序列设计两条PCR引物，并根据扩增载体pMD19-T和表达载体pcDNA3.1(+)-hgromycin在引物的两端分别设计添加一个酶切位点Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ(酶切位点用下划线标出)，序列见表1中序号为1、2的引物序列，引物均配成10μmol/L使用。
表1本发明中所使用的引物序列
(2)TRIzol法从冰冻人肾脏组织中提取总RNA，通过逆转录PCR获得cDNA文库逆转录PCR反应体系见表2。
表2逆转录反应体系(10μL)
| 试剂名称 | 理论使用量 | 实际加入体积 |
| 总RNA | Total RNA≦5μg | 1.38μL |
| Random primer | 1μL | 1μL |
| dNTP混合物 | (10mmol/L each)1μL | 4μL |
| RNA free H2O | UP to 10μL | 3.62μL |
逆转录反应条件：65℃保温5min后迅速放冰上急冷至少2min，在上述体系中加入4μL 5×primeScript buffer，0.5μL RNase Inhibtor，0.5μL PrimeScript逆转录酶，加RNase水补至20μL，30℃保温10min，转换成70℃保温15min后，冰上冷却即可得到第一链cDNA。
(3)以该cDNA文库为模板获得含有SLC47A1编码区域的目的基因片段。聚合链式反应体系见表3，反应条件见表4。
表3聚合链式反应混合物体系(50μL)
表4聚合链式反应条件
| 步骤序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 温度/℃ | 94 | 98 | 57 | 72 | 2→4 | 72 | 4 |
| 时长/s | 120 | 30 | 20 | 120 | 30cycles | 600 | hold |
(4)聚合链式反应产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到长度约1.7kb的条带(见附图1)，并将位置正确的PCR产物进行胶回收后，送公司测序，测序结果跟从Gene bank中下载的SLC47A1的编码序列通过Vector软件进行比对，比对结果显示获得了正确的SLC47A1基因的编码序列。
2.pMD19-T/hMATE1重组质粒的构建
(1)PCR产物与pMD19-T载体相连将位置正确的PCR产物胶回收后按照Takara说明书进行添A反应，产物除杂净化后配制连T载体反应体系，体系配制见表5。
表5添A反应混合物体系
| 加入试剂名称 | pMD 19-T载体 | 添A纯化产物 | ddH2O |
| 理论使用量 | 1μL | 0.1～0.3pmol | Up to 5μL |
| 实际使用量 | 1μL | 4μL | 0 |
连T载体反应混合物55℃条件下保温8min后，加入55μL Solution Ⅰ，16℃保温过夜进行连接反应。
(2)转化用热激法将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态细胞，于含氨苄的LB固体培养基上，37℃孵箱静置培养过夜。待培养基上长出菌斑后，挑取培养基上的单菌落至含氨苄的LB液体培养基中，37℃摇床培养12～16hr。提取大肠杆菌中质粒，用Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ双酶切和Sal Ⅰ单酶切(酶切体系见表6)体系酶切反应过夜后，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，存在长度约1.7kb和4.4kb的目的条带(见附图2)，初步鉴定转化成功，认为得到了pMD19-T/hMATE1质粒。
表6 pMD 19-T/hMATE1酶切反应混合物体系
(3)选取从双酶切有跟PCR纯化产物片段长度相等的单克隆中提取得到的质粒进行测序，将测序结果与SLC47A1的编码序列吻合的菌株进行扩大培养并提取获得pMD19-T/hMATE1质粒。
3.pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒的构建
(1)将实施例1下第2条中提取得到的质粒进行Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ双酶切后，胶回收获得大量目的基因片段；同时扩增pc DNA3.1(+)-hygromycin质粒，在同样的条件下用Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ进行双酶切反应。将pMD19-T/hMATE1的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离胶回收纯化得到的目的基因片段，与pc DNA3.1(+)-hygromycin质粒纯化后的产物的混合物在50℃条件下保温5min，转移至16℃恒温条件下连接过夜，连接体系见表7。
表7 hMATE1和pcDNA3.1连接反应混合物体系
(2)再次将连接产物转化入大肠杆菌中，挑单克隆菌株提取质粒，并进行酶切鉴定(见附图3)，选取含有目的片段长度的菌株进行测序。保存测序结果跟SLC47A1基因(NM_018242.2)mRNA编码区域比对全长匹配的单克隆菌株，扩增培养，抽提单克隆菌株质粒即获得重组表达质粒pcDNA3.1(+)-hMATE1。
实施例2 筛选获得过表达hMATE1的MDCK-hMATE1细胞模型
1.pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转染MDCK细胞
(1)将MDCK细胞按一定密度种到6孔板中，待细胞生长至汇合度达到80％时，将pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒和转染试剂按10μg重组质粒：8μL转染试剂的比例混合后加 入100μL DMEM高糖培养基，再滴加至无FBS的DMEM培养基培养的MDCK细胞培养孔，6hr后换成含有FBS的培DMEM养基继续培养。
(2)转染48hrs后换成含有400μg/ml潮霉素和10％FBS的DMEM培养基培养，视死亡细胞数量每天或隔天换液，持续筛选12～14天。
(3)待筛选细胞无明显死亡且生长状态良好时，用胰酶消化后离心，再用正常培养基重悬混匀后，稀释至10个/ml的细胞密度将细胞种到96孔板中，立即在显微镜下观察挑选只含有一个细胞的培养孔，并做标记。
(4)挑选标记完成后，隔天或每三天换液将单克隆细胞培养扩大至适宜规模后转移至24孔板继续培养，继续扩大培养，待细胞群数量适宜时转移至6孔板中培养，并进行细胞单克隆筛选。
2.用荧光染料DAPI筛选MDCK-hMATE1单克隆细胞株
(1)将MDCK-hMATE1多克隆细胞和转染空载的MDCK-3.1细胞按2000个/孔的密度种至黑色底透酶标板中，培养2～3天至细胞铺满整个孔板后，按①AUB(配方见表8)预孵育25min后加入1μmol/L DAPI孵育20min；②添加30mmol/L NH4Cl的AUB预孵育20min后，换成AUB继续孵育5min，加入1μmol/LDAPI孵育20min；③AUB预孵育20min后，加入1μmol/LDAPI孵育20min三种孵育方法考察MDCK-hMATE1多克隆细胞和mock细胞对DAPI的积聚能力，DAPI孵育结束后用冰PBS洗三遍后，用酶标仪在λex＝358nm，λem＝461nm条件下测定荧光强度，并采用BCA法测定蛋白浓度校正。结果见图4。
表8 AUB的配方
(2)将培养扩大的单克隆细胞株按2000个/孔的密度种至黑色底透酶标板中，培养2～3天至细胞铺满整个孔板后，弃去含有潮霉素和FBS的培养基。
(3)用添加30mmol/L NH4Cl的AUB预孵育20min后，换成AUB继续孵育5min，除去预孵育液后加入1μmol/L DAPI孵育20min，孵育结束立即用冰AUB洗三遍，用酶标仪在λ ex＝＝358nm，λem＝461nm的条件下测定荧光强度，并进行蛋白校正。结果见图5。
(4)挑选出细胞内DAPI积聚量大于MDCK-hMATE1多克隆的细胞株继续进行mRNA水平和底物转运水平筛选，未大于MDCK-hMATE1多克隆的细胞株舍弃。
3.Real-Time PCR方法验证MATE1的表达量
(1)使用含400μg/ml潮霉素的培养基按2×105个/ml的密度种于24孔板，培养3～4天，待细胞长满整个培养孔底部时弃去培养基。用冰冷的磷酸盐缓冲液洗涤之后，使用RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒(RNAsimple Total RNA Kit，天根)，提取MDCK-pcDNA3.1和MDCK-hMATE1细胞中的总RNA并测定总RNA浓度，之后用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real-Time，Takara)将总RNA逆转录为cDNA，反应体系按表9配制，剩余RNA保存于-80℃。逆转录条件为：37℃，15min；85℃，5sec；反应产物保存于-20℃。
表9 逆转录反应体系
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| 5×PrimeScript Buffer(for Real-Time) | 2μL | 1× |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I | 0.5μL | |
| Oligo dT Primer(50μmol/L) | 0.5μL | 25pmol |
| Random 6 mers(100μmol/L) | 0.5μL | 50pmol |
| Total RNA | 500ng | |
| RNase Free dH2O | up to10μL |
(2)获得细胞的cDNA后，使用hMATE1，GAPDH特异性引物进行Real-Time PCR，测定细胞中hMATE1的mRNA相对表达量，以GAPDH(引物序列见SEQ ID No：9、SEQ ID No：9)为内参基因，对不同细胞的hMATE1(引物序列见SEQ ID No：3、SEQ ID No：4)的mRNA进行相对定量。以获得的cDNA为模板(稀释10倍后使用)，用Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)在StepOne plus Real-Time PCR system上进行Real-Time PCR，反应体系配制见表10。
表10 Real-Time PCR反应体系
(3)Real-Time PCR反应条件为：95℃变性反应1min，扩增循环40次，循环参数：95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸10s。引物按照上述条件反应，融解曲线呈特异单峰图。实验结果采用2-△CT相对定量法，其中△CT＝CT target gene-Avg.CT GAPDH。
4.进行MPP+细胞内积聚，筛选积聚量最高的单克隆细胞株作为MDCK-hMATE1重组基因细胞模型(见附图6)
(1)使用含200μg/ml潮霉素的培养基按2×105个/ml的密度种于24孔板，培养3～4天，待细胞长满整个培养孔底部时弃去培养基。
(2)按添加30mmol/L NH4Cl的AUB孵育20min后，换成AUB孵育继续5min，加入10μmol/L MPP+3min，立即用冰AUB洗2遍的步骤进行细胞内积聚实验。
(3)吸尽除去残留的AUB，每个孔加入120μL 0.1％SDS裂解细胞，经2倍体积乙腈沉淀蛋白质1300r﹒min-1离心10min后取上清液使用液质联用仪进行检测，并进行总蛋白校正。
5.对挑选出的MDCK-hMATE1细胞模型进行hMATE1 mRNA相对含量测定
细胞培养的方法除了培养基中不含有潮霉素，其余方法同实施例2下第4条。提取总RNA，逆转录及进行Real-Time PCR的所有体系和条件均与实施例2下第3条相同。Real-Time PCR结果显示MDCK-hMATE1模型细胞高表达hMATE1(结果见图7)，而在MDCK-3.1细胞中，hMATE1与GAPDH的△CT大于10，说明细胞模型构建成功。
6.对挑选出的细胞模型从对MPP+和二甲双胍两种经典底物的积聚进行功能描述
细胞培养的方法除了培养基中不含有潮霉素，其余方法同实施例2下第4条，做积聚时，底物10μmol/L MPP+或10μmol/L二甲双胍在有无抑制剂(100μmol/L西咪替丁)条件下在MDCK-hMATE1和MDCK-3.1细胞中的积聚情况，积聚时间均为3min。经过于MPP+相同的前处理过程后进行液质联用仪检测。结果如图8，结果显示MDCK-hMATE1细胞对10μmol/L MPP+或10μmol/L二甲双胍均明显高于MDCK-3.1细胞，并且在MDCK-hMATE1细胞的积聚能被100μmol/L西咪替丁明显抑制，说明细胞模型构建成功，能用于hMATE1底物和抑制剂的研究。
实施例3 筛选获得过表达hMATE1的MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1细胞模型
1.筛选单克隆的方法步骤同MDCK-hMATE1单克隆筛选的实验方法。结果见附图9、10、12、13。
2.对挑选出的MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1细胞模型采用
Real-Time PCR进行hMATE1、hOCT1/hOCT2 mRNA相对含量测定。
细胞培养方法、总RNA提取方法步骤和试剂、逆转录体系条件及Real-Time PCR方法均与实施例2下第5条相同，Real-Time PCR使用的引物见表1中SEQ ID No：3～10，结果见图11、14。图11中，转染重组质粒pcDNA3.1-hMATE1的细胞相对于转染空载的细胞高表达hMATE1，双转的细胞中hOCT1表达量下降，但hOCT1表达量仍高于hMATE1表达量，仍可用于模拟肝脏中hOCT1和hMATE1两种转运体在药物外排过程中发挥协同作用。图14中，转染重组质粒pcDNA3.1-hMATE1的细胞相对于转染空载的细胞高表达hMATE1，双转的细 胞中hOCT2表达量下降，但hOCT2表达量仍高于hMATE1表达量，且细胞中hOCT1表达量相对于hOCT2和hMATE1很小，因此MDCK-hOCT2/hMATE1模型可用于模拟肾脏中hOCT2和hMATE1两种转运体在药物外排过程中发挥协同作用。
实施例4 MDCK-hMATE1细胞模型应用于氯化两面针碱外排研究
(1)氯化两面针碱属于原小檗碱类生物碱，具有抗疟、抗菌、抗炎、抗白细胞升高及镇痛的活性。也有体外研究表明氯化两面针碱能通过诱导拓扑异构酶Ⅰ抑制细胞周期及破坏DNA等机理发挥抗肿瘤作用。但抗肿瘤药物引发的严重毒性反应也可使得化合物不能成药。已有研究表明氯化两面针碱是OCT1高亲和力的底物，鉴于OCT1在肝脏细胞的基底膜侧有丰富表达，若氯化两面针碱不能顺利代谢或排出细胞，可能会引起肝损伤。因此应用本发明中的MDCK-hMATE1细胞模型考察氯化两面针碱在肝细胞中的外排。
(2)细胞培养及预摄取孵育方法同实施例2下第6条，弃除预孵育液后，加入含0.1-4μmol/L氯化两面针碱的AUB溶液，37℃孵育2min后弃孵育液，用冰冷的AUB洗3遍终止积聚。
(3)细胞裂解液同实施例2下第6条进行前处理后采用液质联用仪检测氯化两面针碱含量，并进行总蛋白含量校正。结果如图15所示，结果显示氯化两面针碱是hMATE1的底物，在MDCK-hMATE1细胞上的动力学参数Km＝0.897±0.085μmol/L，Vmax＝18.5±1.0pmol/mg protein/min。
实施例5 倒千里光碱在MDCK-hMATE1细胞上的积聚
(1)倒千里光碱是吡咯里西啶生物碱中一种肝脏毒性较强的生物碱，可由OCT1转运进入肝脏细胞。其在人体内亲电子性活性代谢产物能与DNA、蛋白等大分子结合从而产生毒性。倒千里光碱在细胞内积聚的量越大时间越长，对细胞的损伤越大，因此本实验应用本发明中的MDCK-hMATE1细胞模型研究倒千里光碱是否能由MATE1介导转运出细胞。
(2)细胞培养及预孵育方法同实施例2下第6条，2μmol/L倒千里光碱积聚时间为2min，细胞裂解液沉淀蛋白后取上清，经离心浓缩仪挥干，残渣用100μL水重悬后，进行液质检测，并进行总蛋白含量校正，积聚结果如图16，结果显示倒千里光碱不是hMATE1的底物。
实施例6 MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1细胞模型应用于西咪替丁转运研究
(1)按3×105个/孔的密度种于costar 12孔转运板中，第2、4天换液培养4～5天，至细胞铺满整个转运板插件的上表面形成单层细胞后，弃去培养基进行实验。
(2)转运实验步骤为：顶侧加入500μL pH6.5的MES缓冲液、底侧加入1500μL pH7.4的HBSS缓冲液洗三遍，在底侧加入20μg/ml荧光黄素钠，37℃30r﹒min-1转运1hr后，在λ ex＝485nm，λex＝535nm的条件下检测荧光强度，通过标曲计算荧光黄素钠的浓度，并将荧光 黄素钠表观渗透系数Papp≦0.5×10-6的孔进行后续西咪替丁的转运实验。
(3)西米替丁的转运也在37℃30r﹒min-1的条件下进行。每20min在接收池中吸取100μL接收液，并加入新的缓冲液补足体积。西咪替丁的转运持续120min。接收液用乙酸乙酯提取后，进行液质检测。
(4)跟据公式Papp＝dQ/(dt﹒A﹒C0)计算西咪替丁的表观渗透系数，式中A为多聚碳酸酯膜的面积(1.12cm2)，C0为西咪替丁在给药室的初始浓度(20μmol/L),dQ/dt为药物的转运速率。
(5)根据公式ER＝Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)计算西咪替丁的外排率。式中ER为外排率(Efflux ratio)，Papp(BL→AP)为底侧到顶侧的表观渗透系数，Papp(AP→BL)为顶侧到底侧的表观渗透系数，结果见图17、18，ER(MDCK-hOCT1/hMATE1)＝33.97，ER(MDCK-hOCT1/3.1)＝1.94，ER(MDCK-hOCT2/hMATE1)＝10.54，ER(MDCK-hOCT2/3.1)＝2.89。根据公式Net effluxratio＝ER(MDCK-hOCT1/hMATE1)/ER(MDCK-hOCT1/3.1)和Net efflux ratio＝ER(MDCK-hOCT2/hMATE1)/ER(MDCK-hOCT2/3.1)分别计算出MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1对西咪替丁的净外排率分别为17.5和3.6，净外排率均大于2，说明MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1可分别用于hOCT1与hMATE1和hOCT2与hMATE1共同底物的转运研究。
上述实施例表明，本发明建立的细胞模型可用于研究MATE1及OCTs在药物的处置过程中单独及共同的作用。
<110> 浙江大学
<120> 稳定表达人MATE1转运体的细胞模型的构建及应用
<160> 11
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hMATE1 cDNA全长特异性扩增的上游引物
<440> 1
ggg aag ctt atg gaa gct cct gag gag
210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hMATE1 cDNA全长特异性扩增的下游引物
<440> 2
ggg ggt acc gac gac tca ctg aat tct gac
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH Real-time PCR特异性扩增的上游引物
<440> 3
agg agc gag atc ccg cca aca
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH Real-time PCR特异性扩增的下游引物
<440> 4
ccg cct ttc aag tga gcc cca
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hMATE1 Real-time PCR特异性扩增的上游引物
<440> 5
cac cct cat ctc cca gac gta c
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hMATE1 Real-time PCR特异性扩增的下游引物
<440> 6
gta agc ctg gac aca tct ggg t
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT1 Real-time PCR特异性扩增的上游引物
<440> 7
ccc aca ttc gtc agg aac ctc gga
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT1 Real-time PCR特异性扩增的下游引物
<440> 8
caa gca ggc cca aca ccg ca
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT2 Real-time PCR特异性扩增的上游引物
<440> 9
ggc tac ata gca gac agg tt
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT2 Real-time PCR特异性扩增的下游引物
<440> 10
cgc cca aca aat tct gta atc agg
<210> 11
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(1713)
<223>人MATE1 cDNA 序列
<440>11
atg gaa gct cct gag gag ccc gcg cca gtg cgc gga ggc ccg gag gcc acc ctt gag gtc 60
cgt ggg tcg cgc tgc ttg cgg ctg tcc gcc ttc cga gaa gag ctg cgg gcg ctc ttg gtc 120
ctg gct ggc ccc gcg ttc ttg gtt cag ctg atg gtg ttc ctg atc agc ttc ata agc tcc 180
gtg ttc tgt ggc cac ctg ggc aag ctg gag ctg gat gca gtc acg ctg gca atc gcg gtt 240
atc aat gtc act ggt gtc tca gtg gga ttc ggc tta tct tct gcc tgt gac acc ctc atc 300
tcc cag acg tac ggg agc cag aac ctg aag cac gtg ggc gtg atc ctg cag cgg agt gcg 360
ctc gtc ctg ctc ctc tgc tgc ttc ccc tgc tgg gcg ctc ttt ctc aac acc cag cac atc 420
ctg ctg ctc ttc agg cag gac cca gat gtg tcc agg ctt acc cag acc tat gtc acg atc 480
ttc att cca gct ctt cct gca acc ttt ctt tat atg tta caa gtt aaa tat ttg ctc aac 540
cag gga att gta ctg ccc cag atc gta act gga gtt gca gcc aac ctt gtc aat gcc ctc 600
gcc aac tat ctg ttt ctc cat caa ctg cat ctt ggg gtg ata ggc tct gca ctg gca aac 660
ttg att tcc cag tac acc ctg gct cta ctc ctc ttt ctc tac atc ctc ggg aaa aaa ctg 720
cat caa gct aca tgg gga ggc tgg tcc ctc gag tgc ctg cag gac tgg gcc tcc ttc ctc 780
cgc ctg gcc atc ccc agc atg ctc atg ctg tgc atg gag tgg tgg gcc tat gag gtc ggg 840
agc ttc ctc agt ggc atc ctc ggc atg gtg gag ctg ggc gct cag tcc atc gtg tat gaa 900
ctg gcc atc att gtg tac atg gtc cct gca ggc ttc agt gtg gct gcc agt gtc cgg gta 960
gga aac gct ctg ggt gct gga gac atg gag cag gca cgg aag tcc tct acc gtt tcc ctg 1020
ctg att aca gtg ctc ttt gct gta gcc ttc agt gtc ctg ctg tta agc tgt aag gat cac 1080
gtg ggg tac att ttt act acc gac cga gac atc att aat ctg gtg gct cag gtg gtt cca 1140
att tat gct gtt tcc cac ctc ttt gaa gct ctt gct tgc acg agt ggt ggt gtt ctg agg 1200
ggg agt gga aat cag aag gtt gga gcc att gtg aat acc att ggg tac tat gtg gtt ggc 1260
ctc ccc atc ggg atc gcg ctg atg ttt gca acc aca ctt gga gtg atg ggt ctg tgg tca 1320
ggg atc atc atc tgt aca gtc ttt caa gct gtg tgt ttt cta ggc ttt att att cag cta 1380
aat tgg aaa aaa gcc tgt cag cag gct cag gta cac gcc aat ttg aaa gta aac aac gtg 1440
cct cgg agt ggg aat tct gct ctc cct cag gat ccg ctt cac cca ggg tgc cct gaa aac 1500
ctt gaa gga att tta acg aac gat gtt gga aag aca ggc gag cct cag tca gat cag cag 1560
atg cgc caa gaa gaa cct ttg ccg gaa cat cca cag gac ggc gct aaa ttg tcc agg aaa 1620
cag ctg gtg ctg cgg cga ggg ctt ctg ctc ctg ggg gtc ttc tta atc ttg ctg gtg ggg 1680
att tta gtg aga ttc tat gtc aga att cag tga
Claims (8)
1.一种构建pcDNA3.1（+）-hMATE1重组质粒的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：先从冰冻人肾脏组织中提取总RNA，经逆转录PCR获得cDNA文库，通过设计含有Hind Ⅲ和KpnⅠ两个酶切位点的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示，以该cDNA为模板特异性扩增获得人SLC47A1基因的编码区域片段，得到的目的基因片段通过Hind Ⅲ和KpnⅠ两个酶切位点连接到表达载体质粒pcDNA3.1(+)-Hygro上，构建pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒。
2.根据权利要求1所述方法获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒构建稳定表达hMATE1的MDCK-hMATE1细胞模型的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：用pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转染MDCK细胞48小时后，在培养基中加入400μg/ml的潮霉素B进行抗性筛选，持续筛选两周后，通过有限稀释法挑选培养单克隆细胞，经过荧光底物DAPI初步筛选过量表达hMATE1的单克隆，采用Real-Time PCR 法进行mRNA水平验证并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参进行hMATE1 mRNA的相对含量测定，GAPDH和hMATE1各自的上、下游引物序列如SEQ ID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：5、SEQ ID No：6所示，MDCK-hMATE1细胞模型通过对经典底物MPP+和二甲双胍在有或无阳性抑制剂西咪替丁存在下的摄取能力进行功能确证。
3.根据权利要求2所述方法构建的稳定表达hMATE1的MDCK-hMATE1细胞模型在高通量快速筛选MATE1底物和抑制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，底物筛选通过以下步骤实现：在待研究药物孵育前，先用添加30mmol/LNH4Cl的人工摄取缓冲液孵育20min，换成AUB继续孵育5min，完成前两步预孵育后方进行待研究药物的孵育，在MDCK-pcDNA3.1和MDCK-hMATE1细胞同时进行待研究药物孵育相同时间的实验，若待研究药物在MDCK-hMATE1细胞上的积聚量超过mock细胞上积聚量的2倍，则可认为待研究药物是MATE1的底物。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，抑制剂筛选通过以下步骤实现：在待研究药物孵育前，先用添加30mmol/LNH4Cl的AUB孵育20min，换成AUB继续孵育5min，完成前两步预孵育后方进行待研究药物的孵育，MPP+、二甲双胍作为MATE1的经典底物，分别与不同浓度的待研究药物共孵育，通过检测药物对细胞内MPP+或二甲双胍积聚量的影响，计算待检测药物对MPP+或二甲双胍的抑制率及IC50值，MPP+和二甲双胍都采用液质联用法进行测定。
6.根据权利要求1所述方法获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒构建稳定表达hMATE1的MDCK-hOCT1/hMATE1细胞模型的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：用pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转染MDCK-hOCT1细胞，挑选获得单克隆的方法、荧光底物DAPI的筛选方法与获得MDCK- hMATE1细胞模型的方法相同，以GAPDH为内参进行hMATE1 mRNA的相对含量测定时，同时测定细胞中hOCT1 mRNA的相对含量，GAPDH、hMATE1及hOCT1各自的上、下游引物序列如SEQ ID No：3、SEQ ID No：4，SEQ ID No：5、SEQ ID No：6及SEQ ID No：7、SEQ ID No：8所示，MDCK-hOCT1/hMATE1细胞进行MPP+的摄取实验验证功能，进行MDCK-hOCT1/hMATE1单层细胞对西咪替丁的转运能力验证实验，在costar转运板的给药池加入20μmol/L西咪替丁，每20min在接收池取100μL缓冲液进行含量测定，转运实验进行2hrs，西咪替丁采用液质联用法进行测定。
7.根据权利要求1所述方法获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒构建稳定表达hMATE1的MDCK-hOCT2/hMATE1细胞模型的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：用pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转染MDCK-hOCT2细胞，挑选获得单克隆的方法、荧光底物DAPI的筛选方法以及运用MPP+和西咪替丁两种底物进行功能确证的方法与获得MDCK-hOCT1/hMATE1细胞模型的方法相同，以GAPDH为内参测定mRNA相对含量测定时，同时测定hMATE1 mRNA、hOCT1 mRNA和hOCT2 mRNA 三种mRNA的相对含量，GAPDH、hMATE1、hOCT1及hOCT2各自的上、下游引物序列如SEQ ID No：3、SEQ ID No：4， SEQ ID No：5、SEQ ID No：6， SEQ ID No：7、SEQ ID No：8及SEQ ID No：9、SEQ ID No：10所示。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的稳定表达hMATE1的MDCK-hOCT2/hMATE1细胞模型在hOCT2和hMATE1共同底物的肾小管排泄机制研究中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| WO2021004373A1 (zh) * | 2019-07-10 | 2021-01-14 | 中山大学 | Mate1基因在治疗结直肠癌中的应用 |
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2014
- 2014-07-09 CN CN201410325014.0A patent/CN104212834A/zh active Pending
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