CN104190384A - 一种具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球及其制备方法与应用，具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球由内到外依次包括：聚合物包裹超顺磁性纳米颗粒构成复合纳米球的内核和含有蛋白质分子印记的聚合物外壳。利用一种改进的微乳液聚液方法，使超顺磁性纳米颗粒紧密排列在聚合物纳米球中，保留了高的饱和磁化强度。通过所述复合纳米球的内核的外围的羟基化改性层与聚合物外壳、印记的蛋白分子间形成丰富的氢键，利用两次冰浴超声处理，促进了印记的蛋白质分子在聚合物外壳中均匀、牢固的分布，有效地降低非特异性结合位点，提高了超顺磁性复合纳米球与目标蛋白质分子的选择性结合能力，实现高选择性的分离目的。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球及其制备方法与应用。
技术背景
超顺磁性纳米颗粒因其具有超顺磁性、良好的生物相容性、单分散性、粒径均一、表面易于功能化等特点，被广泛应用于磁共振显影、生物分离（细胞分离、蛋白质分离等）、药物传递系统、磁热疗及基因治疗等生物医学方面。由于超顺磁性纳米颗粒的粒径很小，在用于生物分离时，在磁场作用下产生的磁作用力也很小，需要在很强的磁场下或作用很长时间才能达到较好的分离效果。目前，有部分研究者通过将超顺磁性纳米颗粒与聚合物混合制成复合微球，来增加其在磁场磁场作用下产生的磁作用力，使分离效率得到了提高。
公开号为CN 102070864 A的中国发明专利公开了一种纳米级聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合微球及其制备方法，通过微乳液聚合方法使甲基丙烯酸甲酯包裹超顺磁性纳米颗粒制得了形状规则、大小均一、粒径分布窄、比饱和磁化强度高的复合微球，可用于蛋白质分离。
然而，目前可用于蛋白分离的复合微球与蛋白质的结合大多是依靠非特异性结合，蛋白质分离的特异性差，很难做到从混合蛋白质中用针对性的分离某种特定的蛋白质。虽然，目前也有一些在复合微球接枝特异性基团用于蛋白质的选择性吸附的研究，但其制备工艺复杂，成本高，且仅适用于某些带有特定基团和结构的蛋白质，普适性差。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种可以对混合蛋白质进行选择性吸附的具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球及其制备方法与应用。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球，包括超顺磁性纳米颗粒、聚甲基丙烯酸甲酯和聚多巴胺，所述聚甲基丙烯酸甲酯包裹超顺磁性纳米颗粒构成复合纳米球的内核，所述聚多巴胺包裹在所述内核的外围构成复合纳米球的外壳层，所述外壳层表面含有蛋白质分子印记。所述蛋白质分子印记是指与某种蛋白分子结构相匹配的空腔。所述蛋白质的种类可以灵活选择。
作为可选方式，在上述具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球中，所述聚甲基丙烯酸甲酯形成形状规整、粒径均匀、单分散性良好的纳米球，超顺磁性纳米颗粒均匀的弥散分布于所述聚甲基丙烯酸甲酯纳米球中。
作为可选方式，在上述具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球中，所述复合纳米球的内核的外围具有羟基化改性层。所述羟基化改性层中含有大量的羟基，可以与聚多巴胺外壳、模板蛋白质分子之间形成丰富的氢键，使聚多巴胺更紧密的包裹在复合纳米球内核的外围，使复合纳米球粒径更均匀，形状更规整，也使得聚多巴胺能够更紧密的包裹模板蛋白，避免模板蛋白在制备过程中从聚多巴胺外壳中漏掉，使所述外壳层表面含有更多数量的蛋白分子印记。
作为可选方式，在上述具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球中，所述超顺磁性纳米颗粒可以是四氧化三铁，伽马三氧化二铁等具有超顺磁性纳米粒子中的至少一种，还可以是掺有如锰，钴或锌等金属元素以提高饱和磁化强度的铁氧磁性纳米粒子中的至少一种。
作为可选方式，在上述具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球中，所述超顺磁性纳米颗粒为Fe3O4 磁性纳米粒子，优选粒径为4nm～20nm，比饱和磁化强度为48emu/g～65emu/g的Fe3O4 磁性纳米粒子。
作为可选方式，在上述具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球中，所述聚甲基丙烯酸甲酯包裹超顺磁性纳米颗粒构成的复合纳米球内核的粒径为20nm～100nm，比饱和磁化强度为32emu/g～46emu/g。
作为可选方式，在上述具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球中，所述具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球呈形状规整的球形，粒径均匀，单分散性良好。作为优选，其平均粒径为80~300nm，比饱和磁化强度为24emu/g～38emu/g。
本发明还提供了一种制备上述具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球（可参照公开号为CN 102070864 A的中国发明专利所述的方法）；
（2）将步骤（1）中制备的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球均匀分散于缓冲溶液中，加入蛋白质作为模板分子，在冰浴下探头超声5~15min，然后再室温下磁力搅拌0.5~3 h；
（3）加入多巴胺，在冰浴下探头超声5~15 min，然后再室温下磁力搅拌1-12 h，（时间越长，聚多巴胺外壳层越厚）多巴胺在聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球表面自聚合并包裹蛋白质模板分子，形成外壳层，得到包裹蛋白质模板分子的超顺磁性复合纳米球；
（4）在外加磁场下，利用复合纳米球的超顺磁性进行磁分离，弃去未复合成功的聚多巴胺和缓冲溶液，再用蛋白洗脱液充分洗涤上述分离步骤中得到的复合纳米球，除去蛋白质模板分子，在外壳层中形成与所述蛋白质模板分子尺寸相对应的空腔，即蛋白分子印记，然后用去离子水充分洗涤即制得所述具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球。
在上述方法中专门设计了两步超声法，且采用探头超声保证超声具有足够的强度，使得该方法制备的超顺磁性复合纳米球，粒径均匀，单分散性好，不团聚，不同纳米球之间的聚多巴胺外壳层不会相互粘连，形成形状更规整的独立的纳米球；使得模版蛋白质分子均匀、牢固的分布在聚多巴胺外壳中，有利于提高超顺磁性复合纳米球与目标蛋白质分子的选择性结合能力。同时控制超声在冰浴条件下进行，有利于保持模版蛋白质分子的活性，从而保证形成的印记与活性蛋白相匹配，还可以控制多巴胺自聚合反应的速度和程度，避免复合纳米球粒径过大或相互之间产生粘连。
本发明还提供了另一种制备上述具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球：
1）配制磁流体：将超顺磁性纳米颗粒均匀分散于正己烷中形成磁流体，
2）形成微乳液：将富羟基表面活性剂溶解于水中，与所述磁流体和甲基丙烯酸甲酯单体充分混合，超声振荡8 min以上形成微乳液，
3）聚合反应：在保护气氛下将步骤2）中的微乳液搅拌加热，加入引发剂（可选过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠或其它常用引发剂，以引发甲基丙烯酸甲酯聚合为目的）进行聚合反应，反应结束后，经磁分离、去离子水洗涤，获羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球；
（2）将步骤（1）中制备的羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球均匀分散于缓冲溶液中，加入蛋白质作为模板分子，在冰浴下探头超声5~15min，然后再室温下磁力搅拌0.5~3 h；
（3）加入多巴胺，在冰浴下探头超声5~15 min，然后再室温下磁力搅拌1-12h，多巴胺在聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球表面自聚合并包裹蛋白质模板分子，形成外壳层，得到包裹蛋白质模板分子的超顺磁性复合纳米球；
（4）在外加磁场下，利用复合纳米球的超顺磁性进行磁分离，弃去未复合成功的聚多巴胺和缓冲溶液，再用蛋白洗脱液充分洗涤上述分离步骤中得到的复合纳米球，除去蛋白质模板分子，在外壳层中形成与所述蛋白质模板分子尺寸相对应的空腔，即蛋白分子印记，然后用去离子水充分洗涤即制得所述具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球。
通过该方法可以在制备过程中使聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球表面羟基功能化，从而使所述复合纳米球的内核的外围具有羟基化改性层。
在上述制备方法中，所述富羟基表面活性剂既能提供丰富的羟基又能起到表面活性剂的作用，促进形成均匀的微乳液滴，作为可选方式，所述富羟基表面活性剂为三甘醇（TEG）、吐温-80（tween-80）、司盘（Span）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-1OO）中的至少一种。进一步的，所述富羟基表面活性剂为三甘醇（TEG）和吐温-80（tween-80），更进一步的，所述三甘醇（TEG）和吐温-80（tween-80）的体积比为8~10:1。
作为可选方式，在上述两种制备方法中，所述探头超声的强度为30-60%。高强度的探头超声可以使产品粒径更均匀，形状更规整。
作为可选方式，在上述两种制备方法中，所述聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球或羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球在所述缓冲溶液中的浓度为1~5mg/mL，所述蛋白质模板分子在所述缓冲溶液中的浓度为0.1~0.8mg/mL，所述多巴胺在所述缓冲溶液中的浓度为0.5~2mg/mL。
在上述两种制备方法中，所述蛋白洗脱液的作用是将复合纳米球上的模板蛋白洗脱从而留下空位，构成蛋白质分子印记，可以选择现有的常用的蛋白洗脱液，作为可选方式，所述蛋白洗脱液为十二烷基磺酸钠（SDS）和冰醋酸的混合溶液，进一步的，其中十二烷基磺酸钠（SDS）的质量体积浓度为1mg/ml，冰醋酸的体积浓度为3%，其余为水。
作为可选方式，在上述两种制备方法中，所述缓冲溶液可以选择不会让蛋白质变性的常用缓冲溶液，如磷酸缓冲溶液（PBS）、tris缓冲溶液等，进一步的，所述缓冲溶液为pH=8的浓度为10mM的tris缓冲溶液。
本发明还提供了一种上述具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球的应用，将其用于分离特定的蛋白质。
作为可选方式，上述应用的具体方法为：根据所要分离的目标蛋白的种类制备具有该目标蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球，将所述超顺磁性复合纳米球与被分离对象充分混合接触，使目标蛋白吸附到分子印记中，然后在外加磁场的作用下进行磁分离，得到吸附了目标蛋白的超顺磁性复合纳米球，将目标蛋白从超顺磁性复合纳米球上洗脱，得到目标蛋白。
作为可选方式，在上述应用的具体方法中，经洗脱操作后的超顺磁性复合纳米球还可以重复使用。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
1.本发明所述超顺磁性复合纳米球形状规整，粒径分布窄，比饱和磁化强度高，磁响应性好，其表面含有蛋白质分子印记可用于选择性的分离特定种类的蛋白质。
2.本发明为蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球的制备提供了一种新方法，此种方法与现有技术相比，不仅工艺简单易行，而且所制备的复合纳米球可高选择性的分离目标蛋白质。
附图说明：
图1为本发明所述具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球的制备方法示意图。
图2为本发明2、3、4中制备的部分材料的粒径、形貌表征结果图。
图3为本发明实施例2中制备的Fe3O4(图3a)、Fe3O4/PMMA（图3b）和实施例3中制备的MIPNs（图4c）的红外光谱图。
图4为本发明实施例2中制备的Fe3O4(图4a)、Fe3O4/PMMA（图4b）和实施例3中制备的MIPNs（图4c）的热重曲线图。
图5为本发明实施例2中制备的Fe3O4(图5a)、Fe3O4/PMMA（图5b）和实施例3中制备的MIPNs（图5c）的磁滞回线图。
图6为本发明实施例6所述蛋白吸附实验的结果图，其中所述吸附量为单位质量的复合纳米球上吸附的蛋白质的质量。
图7为本发明所述对比例1中制备的样品的扫描电镜照片。
图8为本发明所述对比例1中制备的样品的扫描电镜照片。
具体实施方式：
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。以下实施例中所用原料均可以从市场上购得，所述超顺磁性纳米颗粒可以从市场上购买，也可以采用高温法（见 JACS 2004,126,273-279）、共沉淀法(见Chem. Mater. 1996, 8, 2209-2211)或其它现有的方法制备。
实施例1具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球的制备
（1）参照公开号为CN 102070864 A的中国发明专利所述的方法制备聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球（其中所用的超顺磁性纳米颗粒可以是四氧化三铁，伽马三氧化二铁等具有超顺磁性纳米粒子中的至少一种，还可以是掺有如锰，钴或锌等金属元素以提高饱和磁化强度的铁氧磁性纳米粒子中的至少一种）；
（2）将步骤（1）中制备的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球均匀分散于4mL tris缓冲溶液(10 mM, pH 8)或PBS中，加入蛋白质作为模板分子，在冰浴下探头超声5~15min，然后再室温下磁力搅拌0.5~3 h；
（3）加入多巴胺，在冰浴下探头超声5~15 min，然后再室温下磁力搅拌1-12 h，多巴胺在聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球表面自聚合并包裹蛋白质模板分子，形成外壳层，得到包裹蛋白质模板分子的超顺磁性复合纳米球；
（4）在外加磁场下，利用复合纳米球的超顺磁性进行磁分离，弃去未复合成功的聚多巴胺和缓冲溶液，再用十二烷基磺酸钠（SDS）和冰醋酸的混合溶液，充分洗涤上述分离步骤中得到的复合纳米球，除去蛋白质模板分子，在外壳层中形成与所述蛋白质模板分子尺寸相对应的空腔，即蛋白分子印记，然后用去离子水充分洗涤即制得所述具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球。
作为可选方式，在上述两种制备方法中，所述聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球或羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球在所述缓冲溶液中的浓度为1~5mg/mL，所述蛋白质模板分子在所述缓冲溶液中的浓度为0.1~0.8mg/mL，所述多巴胺在所述缓冲溶液中的浓度为0.5~2mg/mL。
实施例2 采用改进的微乳液聚合法制备羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球Fe3O4/PMMA
1）按照JACS 2004,126,273-279中所述的高温分解法制备了超顺磁性Fe3O4纳米粒；
2）取69 mgFe3O4纳米粒均匀分散于正己烷中形成磁流体；
3）取130 μL三甘醇（TEG）和13 μL 吐温-80（tween-80）溶解于5 mL 水中；
4）磁流体和甲基丙烯酸甲酯单体（MMA）以1:2的比例加入上述水溶液中；
5）上述混合物探头超声10 min形成微乳液；
6）升温至80℃，加入过硫酸铵（APS）引发聚合反应。
7）在机械搅拌300 rpm，80℃下，反应5 h；
8）在外加磁场下，利用Fe3O4/PMMA复合纳米球的超顺磁性，弃去残留引发剂、单体、未复合Fe3O4纳米粒的PMMA和水；再用去离子水充分洗涤Fe3O4/PMMA复合纳米球。重复上述操作3次以上。将终产物分散于去离子水中保存。
实施例3具有溶菌酶分子印记的超顺磁性复合纳米球的制备
1）取10 mg实施例2中制备的羟基功能化的超顺磁性Fe3O4/PMMA复合纳米球均匀分散于4mL tris-buffer (10 mM, pH 8)中；
2）加入2 mg溶菌酶，作为模板蛋白；
3）上述混合物在冰浴下探头超声10 min，超声强度为30-60%，然后再室温下磁力搅拌2 h；
4）加入4 mg多巴胺；
5）上述混合物在冰浴下探头超声10 min，超声强度为30-60%，然后再室温下磁力搅拌5 h；
6）在外加磁场下，利用Fe3O4/PMMA/PDA（记为MIPNs）的超顺磁性，弃去未复合Fe3O4纳米粒的聚多巴胺和缓冲溶液；再用十二烷基磺酸钠（SDS）和冰醋酸(0.1 % w/v : 3 % v/v)的混合溶液充分洗涤Fe3O4/PMMA/PDA MIPNs，除去溶菌酶模板分子。重复上述操作3次以上。再用去离子水反复洗涤Fe3O4/PMMA/PDA （记为MIPNs）。将终产物分散于去离子水中保存。
对比例1
参照实施例3所述的方法，将步骤3）和5）中的冰浴条件改为常温条件，其余条件与实施例3相同。结果如图7所示，所得产品团聚很严重，且聚多巴胺相互粘连，产品不能形成规整的球形，分子印记无法发挥功能。
对比例2
参照实施例3所述的方法，将步骤3）和5）中的探头超声改为普通超声，（超声强度变低）或将探头超声的强度改为20%，其余条件与实施例3相同。结果如图8所示，所得产品团聚很严重，单分散性很差，产品不能形成单个的独立的微球，分子印记无法发挥功能。
实施例4制备无印迹的Fe3O4/PMMA/PDA超顺磁性复合纳米球（NIPNs）
1) 取10 mg实施例2中制备的羟基功能化的超顺磁性Fe3O4/PMMA复合纳米球均匀分散于4.5 mL tris-buffer (10 mM, pH 8)中；
2) 加入4 mg多巴胺；
3) 上述混合物在冰浴下探头超声10 min，然后再室温下磁力搅拌5 h；
4) 在外加磁场下，利用Fe3O4/PMMA/PDA（记为NIPNs）的超顺磁性，弃去未复合Fe3O4纳米粒的聚多巴胺和缓冲溶液；再用去离子水反复洗涤Fe3O4/PMMA/PDA（NIPNs）。将终产物分散于去离子水中保存。
实施例5具有其它蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球的制备
参照实施例3所述的方法，将模板蛋白分别换成细胞色素C、牛血清白蛋白、牛血红蛋白，制备出一系列具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球。
表征方法
分别利用透射电镜（TEM, JEM-2010, Japan electronic）、扫描电镜（SEM, HITACHI S4800）和动态光散射仪（DLS, Malvern Nano-ZS）观察上述各实施例中制备的材料的粒径、粒径分布和形貌。其中实施例2、3、4中制备的部分材料的表征结果如图2所示，其中实施例2中制备的超顺磁性纳米颗粒（见图2a）的粒径约为4~10纳米，成规整的球形，单分散性良好；聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球的TEM照片（图2b）和SEM照片（图2d）显示所得的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球也呈规整的球形，且粒径均一，平均粒径约为100纳米，单分散性良好，能形成单个的独立微球；实施例3中制备的具有溶菌酶分子印记的超顺磁性复合纳米球的TEM照片（图2c）和SEM照片（图2e）显示所得的复合纳米球也呈规整的球形，且粒径均一，平均粒径约为200纳米，单分散性良好，能形成单个的独立微球；DLS测试结果显示实施例3中制备的具有溶菌酶分子印记的超顺磁性复合纳米球粒径（图2f）主要分布在100~300nm，呈现良好的单分散性；实施例4中制备的无印记的超顺磁性复合纳米球粒径（图2g）也主要分布在100~300nm，呈现良好的单分散性。
利用傅立叶转变红外光谱仪(FTIR, Perkin-Elmer spectrometer)研究材料的结构。图3显示了实施例2中制备的Fe3O4(图3a)、Fe3O4/PMMA（图3b）和实施例3中制备的MIPNs（图4c）的红外光谱图，由图中可以看出 Fe3O4、PMMA、PDA已成功复合在MIPNs中了。
利用热重量分析仪(TGA, STA 449 C Jupiter, NETZSCH)定量研究材料组分含量。图4显示了实施例2中制备的Fe3O4(图4a)、Fe3O4/PMMA（图4b）和实施例3中制备的MIPNs（图4c）的热重曲线图，由图中可以看出 Fe3O4纳米颗粒表面的油酸在400oC已被分解，磁含量约为83%。对于Fe3O4/PMMA，在700oC时，Fe3O4、Fe2O3和未完全氧化的有机物的总量约为66%。对于实施例3中制备的MIPNs，磁含量约少于57%。
利用振动试样磁力计研究材料的磁性能。图5显示了实施例2中制备的Fe3O4(图5a)、Fe3O4/PMMA（图5b）和实施例3中制备的MIPNs（图5c）的磁滞回线，由图中可以看出上述三种材料都具有超顺磁性，包裹PMMA后微球的比饱和磁化强度相对于Fe3O4约降低了25%，MIPNs的比饱和磁化强度约为30emu/g，虽然相对于Fe3O4约降低了50%，但仍具有较高的比饱和磁化强度，能够满足磁分离的要求。
实施例6蛋白质吸附实验
考察材料对蛋白质的选择性吸附
溶菌酶、细胞色素C、牛血清白蛋白、牛血红蛋白分别溶解于10 mM tris-buffer (pH 8,包含0.01 % SDS)中；分别取实施例3中制备的溶菌酶印迹的Fe3O4/PMMA/PDA超顺磁性分子印迹复合纳米球或无印迹的Fe3O4/PMMA/PDA超顺磁性复合纳米球分别分散于0.5mL1.00 mg mL-1的上述不同的蛋白质溶液中；将混合物在室温下磁力搅拌2h。在外加磁场下，吸附了蛋白质的材料可在10 s内从混合溶液中分离。采用蛋白洗脱液对吸附到复合纳米球上的蛋白进行洗脱即可得到需要分离的蛋白。洗脱后的复合纳米球还可重复使用，且重复使用的复合纳米球的分离效率未见明显下降。
吸附结果如图6所示，具有溶菌酶分子印记的超顺磁性复合纳米球（MIPNs）对溶菌酶展现明显的选择性，而无印迹的超顺磁性复合纳米球（NIPNs）对蛋白的吸附则未见明显的选择性。
实施例7蛋白质吸附对比实验
选取按实施例1中所述方法制备的具有溶菌酶分子印记的超顺磁性复合纳米球与实施例2中制备的具有溶菌酶分子印记的超顺磁性复合纳米球进行蛋白质吸附对比，其余实验条件保持一致，具体方法与实施例6相同。结果显示，虽然按实施例1中所述方法制备的具有溶菌酶分子印记的超顺磁性复合纳米球对溶菌酶也具有明显的选择性吸附，但同等质量的复合纳米球对溶菌酶的吸附量明显少于实施例2中制备的具有溶菌酶分子印记的超顺磁性复合纳米球。可见羟基化改性层的存在有利于增加分子印记的数量从来提高复合纳米球对目标蛋白的吸附量。
实施例8
参照实施例6所述的方法，分别采用实施例5中制备的分别带有细胞色素C、牛血清白蛋白、牛血红蛋白分子印记的复合纳米球进行蛋白吸附实验，结果显示，三种复合纳米球分别对于其分子印记相对应的蛋白展现出选择性吸附。
实施例9
将溶菌酶、细胞色素C、牛血清白蛋白、牛血红蛋白混合溶解于10 mM tris-buffer (pH 8,包含0.01 % SDS)中，加入实施例2中制备的具有溶菌酶分子印记的超顺磁性复合纳米球，将混合物在室温下磁力搅拌2h。在外加磁场下，吸附了蛋白质的材料可在10 s内从混合溶液中分离。采用蛋白洗脱液对吸附到复合纳米球上的蛋白进行洗脱即可得到需要分离的蛋白。洗脱后的复合纳米球还可重复使用，且重复使用的复合纳米球的分离效率未见明显下降。
在洗脱得到的蛋白中溶菌酶质量百分含量在90%以上。说明本发明所述的超顺磁性复合纳米球在混合蛋白的特异性分离中具有较好的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球，其特征在于，包括超顺磁性纳米颗粒、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚多巴胺（PDA），所述聚甲基丙烯酸甲酯包裹超顺磁性纳米颗粒构成复合纳米球的内核，所述聚多巴胺包裹在所述内核的外围构成复合纳米球的外壳层，所述外壳层含有蛋白质分子印记。
2.根据权利要求1 所述的具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球，其特征在于，所述复合纳米球的内核的外围具有羟基化改性层。
3.一种如权利要求1 所述的具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球；
（2）将步骤（1）中制备的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球均匀分散于缓冲溶液中，加入蛋白质作为模板分子，在冰浴下探头超声5~15min，然后再室温下磁力搅拌0.5-3h；
（3）加入多巴胺，在冰浴下探头超声5~15 min，然后再室温下磁力搅拌1-12h，多巴胺在聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球表面自聚合并包裹蛋白质模板分子，形成外壳层，得到包裹蛋白质模板分子的超顺磁性复合纳米球；
（4）在外加磁场下，利用复合纳米球的超顺磁性进行磁分离，弃去未复合成功的聚多巴胺和缓冲溶液，再用蛋白洗脱液充分洗涤上述分离步骤中得到的复合纳米球，除去蛋白质模板分子，在外壳层中形成与所述蛋白质模板分子尺寸相对应的空腔，即蛋白分子印记，然后用去离子水充分洗涤即制得所述具有蛋白分子印记的超顺磁性复合纳米球。
4.一种如权利要求2 所述的具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球：
1）配制磁流体：将超顺磁性纳米颗粒均匀分散于正己烷中形成磁流体，
2）形成微乳液：将富羟基表面活性剂溶解于水中，与所述磁流体和甲基丙烯酸甲酯单体充分混合，超声振荡8 min以上形成微乳液，
3）聚合反应：在保护气氛下将步骤2）中的微乳液搅拌加热，加入引发剂进行聚合反应，反应结束后，经磁分离、去离子水洗涤，获羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球；
（2）将步骤（1）中制备的羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球均匀分散于缓冲溶液中，加入蛋白质作为模板分子，在冰浴下探头超声5~15min，然后再室温下磁力搅拌0.5-3h；
（3）加入多巴胺，在冰浴下探头超声5~15 min，然后再室温下磁力搅拌4~6 h，多巴胺在聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球表面自聚合并包裹蛋白质模板分子，形成外壳层，得到包裹蛋白质模板分子的超顺磁性复合纳米球；
（4）在外加磁场下，利用复合纳米球的超顺磁性进行磁分离，弃去未复合成功的聚多巴胺和缓冲溶液，再用蛋白洗脱液充分洗涤上述分离步骤中得到的复合纳米球，除去蛋白质模板分子，在外壳层中形成与所述蛋白质模板分子尺寸相对应的空腔，即蛋白质分子印记，然后用去离子水充分洗涤即制得所述具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球。
5.根据权利要求3或4 所述制备方法，其特征在于，所述探头超声的强度为30-60%。
6.根据权利要求3或4 所述制备方法，其特征在于，所述羟基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合纳米球在所述缓冲溶液中的浓度为1~5mg/mL，所述蛋白质模板分子在所述缓冲溶液中的浓度为0.1~0.8mg/mL，所述多巴胺在所述缓冲溶液中的浓度为0.5~2mg/mL。
7.根据权利要求3或4 所述制备方法，其特征在于，所述蛋白洗脱液为十二烷基磺酸钠（SDS）和冰醋酸的混合溶液，其中十二烷基磺酸钠（SDS）的质量体积浓度为1mg/ml，冰醋酸的体积浓度为3%，其余为水。
8.根据权利要求3或4 所述制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为pH=8的浓度为10mM的tris缓冲溶液。
9.一种如权利要求1或2所述的具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球的应用，其特征在于，将其用于分离特定的蛋白质。
10.根据权利要求9所述的具有蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球的应用，其特征在于，具体方法为：根据所要分离的目标蛋白的种类制备具有该目标蛋白质分子印记的超顺磁性复合纳米球，将所述超顺磁性复合纳米球与被分离对象充分混合接触，使目标蛋白质吸附到分子印记中，然后在外加磁场的作用下进行磁分离，得到吸附了目标蛋白质的超顺磁性复合纳米球，将目标蛋白质从超顺磁性复合纳米球上洗脱，得到目标蛋白质。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN108176384A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-06-19 | 四川大学 | 接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球及其制备方法与应用 |
| CN110813253A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-02-21 | 山东农业大学 | 一种亲水性金属有机框架表面双酚a分子印迹高选择性纳米复合材料的制备方法及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030082633A1 (en) * | 2000-10-03 | 2003-05-01 | Martin Mark T. | Directed microwave chemistry |
| CN102070864A (zh) * | 2010-12-18 | 2011-05-25 | 四川大学 | 一种纳米级聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合微球及其制备方法 |
| CN103424381A (zh) * | 2013-07-27 | 2013-12-04 | 南昌大学 | 基于磁性分子印迹聚合物放大效应的spr传感器构建及应用 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030082633A1 (en) * | 2000-10-03 | 2003-05-01 | Martin Mark T. | Directed microwave chemistry |
| CN102070864A (zh) * | 2010-12-18 | 2011-05-25 | 四川大学 | 一种纳米级聚甲基丙烯酸甲酯磁性复合微球及其制备方法 |
| CN103424381A (zh) * | 2013-07-27 | 2013-12-04 | 南昌大学 | 基于磁性分子印迹聚合物放大效应的spr传感器构建及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 贾晓萍: "基于磁性纳米粒子及温敏性水凝胶的蛋白质印迹技术研究与应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》, no. 4, 15 April 2014 (2014-04-15), pages 22 - 25 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108176384A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-06-19 | 四川大学 | 接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球及其制备方法与应用 |
| CN108176384B (zh) * | 2018-01-17 | 2020-08-14 | 四川大学 | 接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球及其制备方法与应用 |
| CN110813253A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-02-21 | 山东农业大学 | 一种亲水性金属有机框架表面双酚a分子印迹高选择性纳米复合材料的制备方法及应用 |
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