CN104178544B - 一种酵母和细菌菌群利用活性污泥合成聚β-羟基丁酸酯的方法 - Google Patents
一种酵母和细菌菌群利用活性污泥合成聚β-羟基丁酸酯的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种酵母和细菌菌群利用活性污泥合成聚β‑羟基丁酸酯的方法,它涉及一种高效的聚β‑羟基丁酸酯(poly‑β‑hydroxybutyrate,PHB)合成方法,具体包括利用序批式生物反应器(SBR),以活性污泥为菌源,利用酵母与细菌菌群的共同作用,使这一菌群能够高效地合成PHB的方法,该方法是:接种时加入人工配水和酵母膏,提供菌群的营养来源,采用厌氧/好氧SBR交替运行的方式进行驯化,每循环包括进水、厌氧培养、好氧培养、沉淀、排水、闲置。在培养过程中逐步提高COD并限制氮源和磷浓度,不断提高菌群积累PHB的能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效的聚β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)合成方法,具体包括利用厌氧/好氧交替的序批式生物反应器(SBR),酵母与细菌混合菌群,通过调节营养比例驯化酵母与细菌的混合菌群,最终使这一菌群能够高效地合成PHB。
背景技术
聚β-羟基丁酸酯是微生物合成的羟基脂肪酸线性聚合物,与石油化学合成塑料相似又可生物降解,被誉为“二十一世纪绿色塑料”。PHB具有生物相容、无毒、手性单体等特性,使其在合成血管、心脏支架、缝合线、药物缓释剂和生物燃料等领域都有不可替代的应用潜力和开发价值。廉价大规模生产PHB是缓解“能源危机”和消除“白色污染”的重要举措。
现阶段PHB的合成与发酵过程多数是采用单菌纯培养发酵的方式获得,生产原料为葡萄糖、蔗糖、丙酸等价格昂贵的精致碳源,其生产价格是石化合成塑料价格的10倍左右,高昂的生产价格导致其难以规模化生产来代替传统的石化塑料。利用混合菌群法以活性污泥为底物合成PHB可以实现不灭菌的开放式培养,很大程度上降低生产成本,又能将工农业废弃物转化为重要的化工原料,不仅变废为宝地解决环境污染问题,还很大程度上缓解石化能源的危机。
至今,细菌菌群、嗜盐古菌、嗜盐细菌等微生物在开放条件下积累PHB报道很多,但未见利用酵母和细菌混合菌群合成PHB的报道。酵母细胞的体积是细菌的10倍,本身是个“化工厂”,其较大的细胞体积对胞内PHB提取精制提供便利条件。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有方法合成PHB成本高,以及需要进行灭菌等操作,造成操作复杂的问题,而提供了一种酵母和细菌菌群利用活性污泥合成聚β-羟基丁酸酯的方法。
本发明的一种酵母和细菌菌群利用活性污泥合成聚β-羟基丁酸酯的方法,它是按照以下步骤进行的:
将活性污泥接种到序批式反应器中,活性污泥与序批式反应器的体积比为(0.07~0.2):1,采用人工配水,通过逐步提高COD和限制氮和磷浓度的方式,并按照厌氧/好氧交替运行的驯化模式,经过驯化后,即得到聚β-羟基丁酸酯;
其中,所述的人工配水组分为:每1L人工配水中含有506-3108mg/L的NaAC、115-150mg/L的NH4Cl、65.28-1mg/L的KH2PO4、36-40mg/L的KCl、14.8-16.8mg/L的CaCl2、91.02-101.02mg/L的MgSO4·7H2O、5g的酵母膏和1mL的微量元素液;微量元素液组分为:每1L微量元素液中含有10000mg的EDTA、120mg的ZnSO4·7H2O、60mg的Na2MoO4·2H2O、120mg的MnCl2·4H2O、120mg的KI、30mg的CuSO4·5H2O、150mg的H3BO3和1500mg的FeCl3·6H2O;
所述的通过逐步提高COD和限制氮源和磷浓度的方式,按照厌氧/好氧交替运行的驯化模式,进行驯化具体操作步骤为:
一、污泥活性恢复阶段:初始COD浓度为300mg/L、营养物质摩尔比例为COD:N:P=100:5:1的条件下,在厌氧/好氧序批式反应器中进行驯化120~140周期;
二、富集驯化阶段:先将步骤一驯化后的发酵液COD浓度调整至600mg/L、营养摩尔比例调整为COD:N:P=600:15:6,驯化60~70周期;再将COD浓度调整至1200mg/L,营养摩尔比例调整为COD:N:P=1200:15:6,继续驯化60~70周期,即获得聚β-羟基丁酸酯;
所述的序批式反应器的厌氧/好氧交替运行周期为360min,每一周期包括以下程序:7min的进水、110min的厌氧培养、180min的好氧培养、25min的沉淀、3min的排水和25min的闲置。
本发明包含以下有益效果:
本发明采用酵母与细菌菌群混合培养合成PHB的方法。混合菌群具有利用农业废弃秸秆、造纸厂废水、活性污泥、食品工业废水、餐桌厨余等废弃物作为原料、在不灭菌条件下合成PHB及其单体的优势。与纯菌相比,不仅减少灭菌设备投资,降低高温高压灭菌程序上的能源消耗,还节省精致生产原料的投资,最大程度上降低生产成本。
目前,生物合成塑料(PHB)比石化合成塑料生产成本高10倍,价格上无法与传统塑料相竞争。采用混合菌群开放式不灭菌发酵廉价的废弃物可以最大程度上降低PHB的合成成本。
本发明的细菌和酵母混合菌群与现有合成PHB的方法相比具有两点优势:
一、该菌群由酵母和细菌组成,目前已见很多关于细菌菌群、细菌单菌、古细菌合成PHB的报道,而利用酵母和细菌混合菌群合成PHB的研究未见报道。
二、细菌和酵母混合菌群能够利用各种废弃的固体和液体合成PHB及其单体。菌群合成PHB在实际生产过程中,可以减少三方面投资:1)发酵过程中,减少高温高压灭菌设备,节约发酵设备的投资;2)生产过程中,减少原料高温高压灭菌工艺程序,省略电能和人力资源的能源动力投资;3)生产原料上,廉价工农业废弃物代替精致原材料,节约原材料的投资。通过减少设备、生产流程和原料上的资金投入,最大程度减少PHB的生产成本。
附图说明
图1为实施例2中的混合菌群胞体内PHB储存形式的15000倍放大图;
图2为实施例2中的混合菌群胞体内PHB储存形式的20000倍放大图;
图3实施例2中的混合菌群胞体内PHB储存形式的30000倍放大图;
图4为实施例3中的细菌酵母菌群及其Genbank比对的近缘种系统发育分析树。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式的一种酵母和细菌菌群利用活性污泥合成聚β-羟基丁酸酯的方法,它是按照以下步骤进行的:
将活性污泥接种到序批式反应器中,活性污泥与序批式反应器的体积比为(0.07~0.2):1,采用人工配水,通过逐步提高COD和限制氮和磷浓度的方式,并按照厌氧/好氧交替运行的驯化模式,经过驯化后,即得到聚β-羟基丁酸酯;
其中,所述的人工配水组分为:每1L人工配水中含有506-3108mg/L的NaAC、115-150mg/L的NH4Cl、65.28-1mg/L的KH2PO4、36-40mg/L的KCl、14.8-16.8mg/L的CaCl2、91.02-101.02mg/L的MgSO4·7H2O、5g的酵母膏和1mL的微量元素液;微量元素液组分为:每1L微量元素液中含有10000mg的EDTA、120mg的ZnSO4·7H2O、60mg的Na2MoO4·2H2O、120mg的MnCl2·4H2O、120mg的KI、30mg的CuSO4·5H2O、150mg的H3BO3和1500mg的FeCl3·6H2O;
所述的通过逐步提高COD和限制氮源和磷浓度的方式,按照厌氧/好氧交替运行的驯化模式,进行驯化具体操作步骤为:
一、污泥活性恢复阶段:初始COD浓度为300mg/L、营养物质摩尔比例为COD:N:P=100:5:1的条件下,在厌氧/好氧序批式反应器中进行驯化120~140周期;
二、富集驯化阶段:先将步骤一驯化后的发酵液COD浓度调整至600mg/L、营养摩尔比例调整为COD:N:P=600:15:6,驯化60~70周期;再将COD浓度调整至1200mg/L,营养摩尔比例调整为COD:N:P=1200:15:6,继续驯化60~70周期,即获得聚β-羟基丁酸酯;
所述的序批式反应器的厌氧/好氧交替运行周期为360min,每一周期包括以下程序:7min的进水、110min的厌氧培养、180min的好氧培养、25min的沉淀、3min的排水和25min的闲置,按照此程序周而复始进行循环。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:所述的人工配水组分为:每1L人工配水中含有1000~3000mg/L的NaAC、120~140mg/L的NH4Cl、5~60mg/L的KH2PO4、38~40mg/L的KCl、15~16.8mg/L的CaCl2、95~100mg/L的MgSO4·7H2O、5g的酵母膏和1mL的微量元素液;微量元素液组分为:每1L微量元素液中含有10000mg的EDTA、120mg的ZnSO4·7H2O、60mg的Na2MoO4·2H2O、120mg的MnCl2·4H2O、120mg的KI、30mg的CuSO4·5H2O、150mg的H3BO3和1500mg的FeCl3·6H2O。其它与具体实施方式一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果:
实施例1
本实施例的一种酵母和细菌菌群利用活性污泥合成聚β-羟基丁酸酯的方法,它是按照以下步骤进行的:
1)将活性污泥接种到序批式生物反应器(SBR)中,采用人工配水,以乙酸钠为唯一碳源进行驯化;
2)采用厌氧/好氧交替运行的方式进行驯化,循环的每一周期包含以下程序:进水、厌氧培养、好氧培养(曝气、搅拌)、沉淀、排水、闲置;
3)在培养过程中逐步提高COD和限制氮源和磷浓度的方式进行驯化,使混合菌群的PHB合成能力不断增强。
在步骤1)中,所述的序批式生物反应器(SBR)有效体积为15L,接种量控制在1-3L,所述的人工配水组分为:每1L人工配水中含有506-1012mg/L的NaAC、115-150mg/L的NH4Cl、65.28-1mg/L的KH2PO4、36-40mg/L的KCl、14.8-16.8mg/L的CaCl2、91.02-101.02mg/L的MgSO4·7H2O、5g的酵母膏和1mL的微量元素液;微量元素液组分为:每1L微量元素液中含有10000mg的EDTA、120mg的ZnSO4·7H2O、60mg的Na2MoO4·2H2O、120mg的MnCl2·4H2O、120mg的KI、30mg的CuSO4·5H2O、150mg的H3BO3和1500mg的FeCl3·6H2O;
在步骤1)所述的酵母膏加入量为5g/L,其主要目的是提供酵母菌。
在步骤2)中所述的每一个周期包括7min进水+110min厌氧+180min好氧+25min沉淀+3min排水+25min闲置。每周期6h,每天4个周期。
在步骤3)所述的驯化过程包括两个驯化阶段,驯化第一阶段是污泥的活性恢复阶段;第二阶段是富集驯化阶段。
所述的驯化培养过程中逐步提高COD和限制氮源和磷浓度的方式进行驯化具体操作步骤为:
一、污泥的活性恢复阶段:在初始COD浓度为300mg/L、营养比例为COD:N:P=100:5:1的条件下,驯化120~140周期;
二、富集驯化阶段:先将步骤一驯化后的污泥液COD浓度调整至600mg/L、营养比例调整为COD:N:P=600:15:6,驯化60~70周期;再将COD浓度调整至1200mg/L,营养比例调整为COD:N:P=1200:15:6,继续驯化60~70周期,即获得聚β-羟基丁酸酯(PHB)。
所述的厌氧/好氧交替运行周期的时间为6h,每一周期包括7min的进水、110min的厌氧培养、180min的好氧培养、25min的沉淀、3min的排水和25min的闲置,获得稳定的PHB高产菌群。
本实施例的细菌和酵母混合菌群与现有合成PHB的方法相比具有两点优势:
一、该菌群由酵母和细菌组成,而酵母和细菌混合菌群合成PHB在国内外文献上未见报道。目前已见很多关于细菌菌群、细菌单菌、古细菌合成PHB的报道,而利用酵母和细菌混合菌群合成PHB的研究未见报道。
二、细菌和酵母混合菌群能够利用各种废弃的固体和液体合成PHB及其单体。菌群合成PHB在实际生产过程中,可以减少三方面投资:1)高温高压灭菌的发酵设备投资;2)生产过程中原料高温灭菌的电能和人工消耗;3)廉价工农业废弃物代替精致原料的原材料的投资。通过设备和生产流程上最大程度减少PHB的生产成本。
下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
实施例2:菌群的驯化
1)活性污泥活性恢复阶段驯化
取1.5L取自哈尔滨市文昌污水处理厂二沉池的活性污泥于SBR中,初始COD为300mg/L,营养摩尔比例为COD/N/P=100/5/1,按照这一比例配置的人工配水组分如下表:
表1人工配水组成成分
驯化初始状态污泥呈黑色且结构松散沉降性好,污泥体积指数SVI较低,此时体系内无机物较多,生物活性较差。驯化60-70周期后,污泥颜色逐渐变浅,呈褐色状,SVI由最初的40ml/L上升至102mL/L。
对驯化的活性污泥COD、P、N指标进行测定,在厌氧阶段的2h内,COD由296mg/L降至168mg/L。在好氧的3h内,COD由168mg/L降至2mg/L有机质彻底耗尽。磷浓度呈单峰曲线,厌氧阶段磷浓度呈上升趋势,由初始浓度13.49mg/L上升至33.38mg/L:好氧末期呈下降趋势,从33.38mg/L降至0.46mg/L。这一数据说明此时菌群处于一个典型的聚磷菌代谢过程,可以认为此时污泥的活性已经恢复。
2)PHB积累阶段驯化
在污泥活性恢复后,将COD提高至600mg/L,营养比例调整为COD/N/P=600/15/6,随着驯化的进行颜色逐渐变黄,沉降性能良好,驯化60-70个周期后,测定COD、氮、磷指标,在厌氧阶段,聚磷菌水解体内的多聚磷酸盐颗粒和糖原,并把正磷酸盐释放到水体中,所以反应器内的磷酸盐浓度呈现上升趋势,与此同时吸收培养基中的有机物并以PHB的形式储存于胞内;在好氧阶段,聚磷菌群分解体内PHB,同时合成糖原并吸收体外磷酸盐,以多聚磷酸盐颗粒的形式储存于胞内。在这个阶段PHB和磷酸盐的含量均呈下降趋势。整个周期,菌群的释磷率为25.16%,除磷率为75.8%。氮浓度从12.81mg/L降至1.54mg/L,除氮率是87.9%。PHB的变化趋势与磷相似,厌氧阶段PHB含量逐渐增加,从最初的10.2%上升至厌氧末期的14.9%,好氧阶段PHB作为能源被菌体消耗,由14.9%降至7.65%,这一阶段菌群可以合成少量的PHB。
3)PHB富集阶段驯化
通过逐步提高碳源浓度和降低氮磷浓度的方式来提高PHB的产量。此时COD浓度由600mg/L提高到1200mg/L,COD/N由最初的20上升到80,COD/P从最初的100上升到200,通过逐步提高COD和限氮限磷的方式来提高PHB的产量,驯化出高产PHB的菌群。利用气相色谱法对菌群中PHB的含量进行了测定,经检测发现菌群合成聚合物种类为PHB。在厌氧末期,PHB的积累能力达到最大,其含量占菌体干重的74.2%,在电子显微镜下可以清楚看到菌群合成的PHB颗粒,如附图1和2所示。由图1和2可知,图中胞体内呈白色颗粒即为PHB在细胞内的储存状态;由图1可以看出,整个菌群内PHB含量很好;图2所示的为一个酵母体内所含有的PHB颗粒,在其旁边的为细菌,可以看出酵母的胞体储存的PHB远高于细菌,这也是这一混合菌群能高产PHB的原因。
由上述结果可知,与富集初期相比PHB的含量有明显的提高,从14.9%上升至74.2%,说明此时的菌群已具备高效合成PHB的能力。
实施例3:菌群的驯化
1)活性污泥活性恢复阶段驯化
本实验接种的剩余污泥取自哈尔滨市马家沟,将剩余污泥经过3天的预曝气,使原污泥中的底物彻底消耗,然后接种到SBR反应器中开始进行驯化,接种量为1.5L。初始COD为300mg/L,营养摩尔比例为COD/N/P=100/5/1,人工配水组分如实施例1。
在驯化初期,污泥呈黑色,结构松散,污泥指数SVI为50mg/L,沉降性较好,说明污泥内含无机物较多,生物活性较差,所以必须设置活性恢复阶段使菌群达到理想的混合菌群。驯化60-70周期后,污泥颜色逐渐变浅,呈浅褐色,SVI也上升到120mg/L,菌群内的黑色颗粒逐渐消失。一个典型周期内在厌氧阶段的2h内,COD由初始的297mg/L缓慢下降至260mg/L。在好氧阶段的3h内,COD由260mg/L迅速下降到70mg/L。磷浓度变化呈单峰曲线,厌氧阶段磷浓度呈上升趋势,磷由初始浓度15.34mg/L上升至22.93mg/L;好氧阶段磷呈下降趋势。
2)PHB积累阶段驯化
驯化60-70个周期后将COD浓度调整至600mg/L,培养基内营养条件不变,继续驯化30周期。第90个周期后,污泥活性恢复成功,调整驯化方案,进入富集驯化阶段。
本阶段的驯化共分四个步骤。第一步:COD为600mg/L,营养比例调为COD/N/P=600/60/15。第二步为限氮过程,营养比例调为COD/N/P=600/15/6。第三步,将COD上升到1200mg/L,氮的含量减少,营养比例调节为COD/N/P=1200/24/30。第四步,COD不变,继续降低氮的含量,营养比例调整为COD/N/P=1200/15/6。每步驯化30个周期。
当污泥的颜色逐渐有变为黄色,沉降性能良好,说明污泥的状态基本稳定。将COD提高到600mg/L,培养基基本营养配比不变,驯化30周期后,在厌氧阶段污泥释放磷酸盐,反应器内磷酸盐浓度快速上升,细胞内糖原逐步下降,同时PHB呈现积累过程;在好氧阶段,PHB被消耗,糖原则大量合成,同时磷呈现快速消耗的过程,PHB的变化趋势与磷的类似,在厌氧阶段PHB含量逐渐增加,从初期的11.2%到厌氧期末上升至13.8%,好氧阶段PHB作为菌体的能量逐渐被消耗,由13.8%下降至8.16%,可见该菌群能够形成少量的PHB,磷与PHB含量变化趋势符合PHB合成菌群的基本变化规律。
3)PHB富集阶段驯化
通过逐步提高碳源浓度和降低氮磷浓度的方式来提高PHB的产量。此时COD浓度由600mg/L提高到1200mg/L。驯化30周期后的一个典型周期内厌氧期间释磷率达51%,好氧期间的除磷率达86%,COD去除率达96.7%。氮去除率达93.02%。PHB的积累能力达最大,其含量占菌体干重的64.2%。此时,混合菌群内合成PHB的电镜照片如图3所示。由电镜照片图3可见微生物有胞内含有大量PHB;图4为用DGGE切胶条带测序以及序列在基因bank上的登陆号,由图4可以确定通过该方法驯化获得的菌群中既含有酵母还含有细菌。
Claims (2)
1.一种酵母和细菌菌群利用活性污泥合成聚β-羟基丁酸酯的方法,其特征在于它是按照以下步骤进行的:
将活性污泥接种到序批式反应器中,活性污泥与序批式反应器的体积比为(0.07~0.2):1,采用人工配水,通过逐步提高COD和限制氮和磷浓度的方式,并按照厌氧/好氧交替运行的驯化模式,进行驯化后,即得到聚β-羟基丁酸酯;
其中,所述的人工配水组分为:每1L人工配水中含有506-3108mg/L的NaAC、115-150mg/L的NH4Cl、1-65.28mg/L的KH2PO4、36-40mg/L的KCl、14.8-16.8mg/L的CaCl2、91.02-101.02mg/L的MgSO4·7H2O、5g的酵母膏和1mL的微量元素液;微量元素液组分为:每1L微量元素液中含有10000mg的EDTA、120mg的ZnSO4·7H2O、60mg的Na2MoO4·2H2O、120mg的MnCl2·4H2O、120mg的KI、30mg的CuSO4·5H2O、150mg的H3BO3和1500mg的FeCl3·6H2O;
所述的通过逐步提高COD和限制氮和磷浓度的方式,按照厌氧/好氧交替运行的驯化模式,进行驯化具体操作步骤为:
一、污泥活性恢复阶段:初始COD浓度为300mg/L、营养物质摩尔比例为COD:N:P=100:5:1的条件下,在厌氧/好氧序批式反应器中进行驯化120~140周期;
二、富集驯化阶段:先将驯化后的发酵液COD浓度调整至600mg/L、营养摩尔比例调整为COD:N:P=600:15:6,驯化60~70周期;再将COD浓度调整至1200mg/L,营养摩尔比例调整为COD:N:P=1200:15:6,继续驯化60~70周期,即获得聚β-羟基丁酸酯;
所述的序批式反应器的厌氧/好氧交替运行周期为350min,每一周期包括以下程序:7min的进水、110min的厌氧培养、180min的好氧培养、25min的沉淀、3min的排水和25min的闲置。
2.根据权利要求1所述的一种酵母和细菌菌群利用活性污泥合成聚β-羟基丁酸酯的方法,其特征在于所述的人工配水组分为:每1L人工配水中含有1000~3000mg/L的NaAC、120~140mg/L的NH4Cl、5~60mg/L的KH2PO4、38~40mg/L的KCl、15~16.8mg/L的CaCl2、95~100mg/L的MgSO4·7H2O、5g的酵母膏和1mL的微量元素液;微量元素液组分为:每1L微量元素液中含有10000mg的EDTA、120mg的ZnSO4·7H2O、60mg的Na2MoO4·2H2O、120mg的MnCl2·4H2O、120mg的KI、30mg的CuSO4·5H2O、150mg的H3BO3和1500mg的FeCl3·6H2O。
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