CN104162182B - 一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤:将埃洛石纳米管加入溶菌酶溶液,得到负载溶菌酶的埃洛石纳米管;将壳聚糖溶于乙酸水溶液中配制成壳聚糖溶液,然后加入负载溶菌酶的埃洛石纳米管,搅拌后,加入氢氧化钠溶液将pH调为7制得悬浊液,或是加入有机沉淀剂制得悬浊液,或是加入交联剂制得悬浊液;将悬浊液离心分离,所得沉淀用去离子水洗涤后,冷冻干燥,即得到所述具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。本发明制备方法简单,所制得的复合止血粉综合了壳聚糖止血材料和无机类止血材料的优点,除了能够杀灭和抑制创面的细菌,同时可以将壳聚糖降解成寡糖,促进创面的愈合。
Description
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域,具体涉及一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉及其制备方法。
背景技术
在各种外科手术中,止血是临床治疗的重要组成部分,利用止血材料妥善止血对于患者减少出血,降低创伤,缩短手术时间以及提高手术成功率的必要保障。近年来医用可吸收止血材料引起了各国医学界和产业界的高度重视。目前,止血材料只要包括应经典止血剂凝血酶、纤维蛋白原等,微球类止血材料,如沸石、微孔多聚糖止血粉等,新型止血材料已成为外科止血领域的研究热点之一,涉及到医学、材料学等多个学科。理想的医用止血材料应该在具有生物相容性好,无明显毒副反应的基础上,能够迅速止血。止血材料还应该具有使用方便,能够完全覆盖不规则创面的特性,具有良好的组织黏附性。
一般来说,创伤失血和感染总是同时发生的。由于受到创伤环境等各种因素影响,伤后感染发生率极高,在后续的治疗过程中,也有可能带来新的继发性污染和交叉感染,甚至导致伤员致残,甚至死亡。当创面出现时,尤其是大创面出现时,机体免疫性能降低下降,大量组织液滞留或渗出,创面所富集的大量负电荷使维持人体免疫功能的淋巴细胞活性大大降低,使伤口极易感染,从而创面愈合变得十分缓慢。为了控制病菌感染,人类发明并使用抗生素,但是目前抗生素的使用受到耐药性、毒副作用和治愈率越来越低等问题的巨大挑战。因此,针对目前临床使用的外科止血材料的不足,开发快速、高效、稳定、安全、方便的新型止血材料,尤其是具有抗菌活性的新型外科止血材料,对于临床应用均具有重要意义,一向都受到世界各国材料学家和医生的重视。
溶菌酶又称胞壁质酶,是一种能水解致病菌中粘多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶具有抗菌、抗病毒、免疫调节以及止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。
壳聚糖是自然界中唯一带正电荷的碱性多糖,壳聚糖具有无毒性、无刺激性、良好组织相容性,同时壳聚糖还具有抗菌、消炎、止血、减少创面渗出和促进创伤组织再生和愈合的作用,本身就是一种良好的止血材料。壳聚糖一方面可以通其所粘附的血小板来加速血纤维蛋白的聚合来形成凝块;另一方面可以刺激血管收缩,诱导红细胞聚集来封合伤口,已经成为止血材料领域的研究热点。其降解产物壳寡糖的碱性氨基基团能中和创面的酸性物质,改变创面的微环境,使局部的pH值向碱性方向移动,提高了巨噬细胞的活性,增加了巨噬细胞的数量。
无机类止血材料主要包括沸石、高岭土、蒙脱土以及介孔硅材料等,可以利用其高的比表面积快速吸收血液中的水分,从而局部浓缩凝血因子和血小板,最终达到促进凝血的效果。但是这些材料本身也存在一些问题,主要是生物安全性较差,容易引起炎症反应和一定程度的毒性反应。埃洛石是一种天然的多壁纳米管,管内径约为15-20nm,外径约为50nm,长度约为100-1500nm,具有非常高的比表面积。目前,埃洛石在生物医学领域研究引起了科学家们的关注,其具有良好的生物相容性,不但具有止血的特性,同时也是一种天然的药物缓释体系材料,尤其是其表面所携带的负电荷,可以通过物理吸附和静电相互作用吸附带正电荷的溶菌酶。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。该复合止血粉综合了壳聚糖止血材料和无机类止血材料的优点,一方面利用埃洛石纳米管的天然载药性,负载了生物抗菌剂溶菌酶,克服传统抗菌素的耐药性问题;另一方面,溶菌酶的缓慢释放,除了能够杀灭和抑制创面的细菌,同时可以将壳聚糖降解成寡糖,促进创面的愈合。
为实现上述发明目的,本发明采用如下技术方案:
一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉的制备方法,包括以下步骤:
(1)将溶菌酶溶解于pH=5~8的磷酸缓冲溶液中得到溶菌酶溶液,然后加入埃洛石纳米管,得到溶菌酶和埃洛石的复合悬液,搅拌均匀后将悬液超声处理,使埃洛石纳米管均匀分散并充分吸附溶菌酶,再将混合体系经离心沉降、洗涤和冷冻干燥,得到负载溶菌酶的埃洛石纳米管;
(2)将壳聚糖溶于乙酸水溶液中配制成壳聚糖溶液,并将pH调节为6,然后加入步骤(1)制得的负载溶菌酶的埃洛石纳米管,搅拌5~15min后,加入氢氧化钠溶液将pH调为7制得悬浊液,或是加入有机沉淀剂制得悬浊液,或是加入交联剂制得悬浊液;
(3)将步骤(2)得到的悬浊液离心分离,所得沉淀用去离子水洗涤后,重复离心分离和去离子水洗涤的操作2~5次,之后将沉淀冷冻干燥,即得到所述具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。
优选的,步骤(1)所有操作温度控制在4~25℃,所述溶菌酶溶液的质量浓度为0.1~3.0%;所述溶菌酶和埃洛石纳米管的质量比为(0.001:1.000)~(0.050:1.000)。
优选的,步骤(2)中通过加入交联剂的方式制备悬浊液时,在得到悬浊液后通过喷雾干燥的方式去除溶剂,得到所述具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。
更优选的,在进行喷雾干燥时,通过蠕动泵将悬浊液泵入喷雾干燥仪喷雾,与热气流相遇使溶剂挥发;蠕动泵的进料流量为15~50mL/h,进气温度为100~500℃;喷雾干燥仪喷嘴孔径为0.7mm,所述热气流为氮气。
优选的,步骤(2)中加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液将壳聚糖溶液pH值调节为6;所述壳聚糖的分子量为1~30万,脱乙酰度为60~98%;所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.2~3.0%。
优选的,步骤(2)所述壳聚糖与负载溶菌酶的埃洛石纳米管的质量比为1.00:(0.05~50.00)。
优选的,步骤(2)所述有机沉淀剂为无水乙醇、丙酮、乙醚和四氢呋喃中的一种;有机沉淀剂与壳聚糖溶液的质量比为2~5:1。
上述有机沉淀剂均为本领域常用的水溶性大分子的沉淀剂。
优选的,步骤(2)所述交联剂为乙二醛、戊二醛、三聚磷酸钠、四聚磷酸钠和京尼平中的一种;交联剂与壳聚糖的质量比为(0~0.1):1.0。
更优选的,所述交联剂与壳聚糖的质量比为(0.03~0.10):1.00。
优选的,步骤(3)所述离心分离的速度为3000rpm,时间为10~30min。
上述制备方法获得的具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。
与现有技术相比,本发明具有以下优点及有益效果:
本发明制备方法简单,所制得的复合止血粉综合了壳聚糖止血材料和无机类止血材料的优点,一方面利用埃洛石纳米管的天然载药性,负载了生物抗菌剂溶菌酶,克服传统抗菌素的耐药性问题;另一方面,溶菌酶的缓慢释放,除了能够杀灭和抑制创面的细菌,同时可以将壳聚糖降解成寡糖,促进创面的愈合。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉的制备方法,包括以下步骤:
(1)将溶菌酶(购自sigma公司)溶解于pH=7.4的磷酸缓冲溶液中,配成质量浓度为0.1%的溶菌酶溶液;然后加入埃洛石纳米管(溶菌酶和埃洛石纳米管质量比为1:50),得到溶菌酶和埃洛石的复合悬液,搅拌均匀后将悬液超声处理30min,使埃洛石纳米管均匀分散并充分吸附溶菌酶,所有操作温度控制在4℃;再将混合体系在3000rpm条件下离心10min后,用PBS洗涤,最后冷冻干燥(冷冻室温度为-80摄氏度,干燥腔的压力为100Pa),得到负载溶菌酶的埃洛石纳米管;测定溶菌酶负载效率为87.3%;
(2)将壳聚糖(壳聚糖分子量为10万,脱乙酰度为90%)溶于乙酸水溶液中配制成质量浓度为2%的壳聚糖溶液,加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液将壳聚糖溶液pH值调至6;然后加入步骤(1)制得的负载溶菌酶的埃洛石纳米管(壳聚糖与负载溶菌酶的埃洛石纳米管的质量比为1:1),快速搅拌10min后,加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液将pH调为7制得悬浊液;
(3)将步骤(2)得到的悬浊液在3000rpm速度下离心分离10min,所得沉淀用去离子水洗涤后,重复离心分离(3000rpm,10min)和去离子水洗涤的操作3次,之后将沉淀冷冻干燥(冷冻室温度为-80摄氏度,干燥腔的压力为100Pa),即得到所述具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。
将本实施例所得到的具有抗菌促愈合活性的复合止血粉进行抗菌实验,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为250ug/ml,对大肠杆菌的MIC为360ug/ml。兔止血试验:选取3只新西兰白兔,常规手术麻醉后,大腿的动脉被剪断,敷上该复合止血粉,记录止血时间为20.5±2.3秒。结果表明,按本发明制备的复合止血粉具有良好的抗菌和止血作用。
实施例2
一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉的制备方法,包括以下步骤:
(1)将溶菌酶溶解于pH=7.4的磷酸缓冲溶液中,配成质量浓度为1%的溶菌酶溶液;然后加入埃洛石纳米管(溶菌酶和埃洛石纳米管质量比为1:50),得到溶菌酶和埃洛石的复合悬液,搅拌均匀后将悬液超声处理30min,使埃洛石纳米管均匀分散并充分吸附溶菌酶,所有操作温度控制在4℃;再将混合体系在3000rpm条件下离心10min后,用PBS洗涤,最后冷冻干燥(冷冻室温度为-80摄氏度,干燥腔的压力为100Pa),得到负载溶菌酶的埃洛石纳米管;测定溶菌酶负载效率为87.3%;
(2)将壳聚糖(壳聚糖分子量为1万,脱乙酰度为60%)溶于乙酸水溶液中配制成质量浓度为2%的壳聚糖溶液,加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液将壳聚糖溶液pH值调至6;然后加入步骤(1)制得的负载溶菌酶的埃洛石纳米管(壳聚糖与负载溶菌酶的埃洛石纳米管的质量比为1:1),快速搅拌10min后,加入无水乙醇制得悬浊液(无水乙醇与壳聚糖溶液的质量比为3:1);
(3)将步骤(2)得到的悬浊液在3000rpm速度下离心分离30min,所得沉淀用去离子水洗涤后,重复离心分离(3000rpm,30min)和去离子水洗涤的操作3次,之后将沉淀冷冻干燥(冷冻室温度为-80摄氏度,干燥腔的压力为100Pa),即得到所述具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。
将本实施例所得到的具有抗菌促愈合活性的复合止血粉进行抗菌实验,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为220ug/ml,对大肠杆菌的MIC为350ug/ml。兔止血试验:选取3只新西兰白兔,常规手术麻醉后,大腿的动脉被剪断,敷上该复合止血粉,记录止血时间为17.8±1.2秒。结果表明,按本发明制备的复合止血粉具有良好的抗菌和止血作用。
实施例3
一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉的制备方法,包括以下步骤:
(1)将溶菌酶溶解于pH=7.4的磷酸缓冲溶液中,配成质量浓度为2%的溶菌酶溶液;然后加入埃洛石纳米管(溶菌酶和埃洛石纳米管质量比为1:50),得到溶菌酶和埃洛石的复合悬液,搅拌均匀后将悬液超声处理30min,使埃洛石纳米管均匀分散并充分吸附溶菌酶,所有操作温度控制在4℃;再将混合体系在3000rpm条件下离心10min后,用PBS洗涤,最后冷冻干燥(冷冻室温度为-80摄氏度,干燥腔的压力为100Pa),得到负载溶菌酶的埃洛石纳米管;测定溶菌酶负载效率为87.3%;
(2)将壳聚糖(壳聚糖分子量为30万,脱乙酰度为98%)溶于乙酸水溶液中配制成质量浓度为2%的壳聚糖溶液,加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液将壳聚糖溶液pH值调至6;然后加入步骤(1)制得的负载溶菌酶的埃洛石纳米管(壳聚糖与负载溶菌酶的埃洛石纳米管的质量比为1:1),快速搅拌10min后,加入三聚磷酸钠制得悬浊液(三聚磷酸钠和壳聚糖的质量比为0.05:1);
(3)然后使用喷雾干燥仪,通过蠕动泵,将步骤(2)制得的悬浊液喷雾,与热气流相遇,挥发溶剂,得到所述具有抗菌促愈合活性的复合止血粉;其中喷雾干燥的技术参数为:蠕动泵进料流量为30mL/h.,进气温度为150摄氏度;喷嘴孔径为0.7mm;热气流为氮气。
将本实施例所得到的具有抗菌促愈合活性的复合止血粉进行抗菌实验,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为223ug/ml,对大肠杆菌的MIC为332ug/ml。兔止血试验:选取3只新西兰白兔,常规手术麻醉后,大腿的动脉被剪断,敷上该复合止血粉,记录止血时间为18.7±2.3秒。结果表明,按本发明制备的复合止血粉具有良好的抗菌和止血作用。
实施例4
一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉的制备方法,包括以下步骤:
(1)将溶菌酶溶解于pH=7.4的磷酸缓冲溶液中,配成质量浓度为3%的溶菌酶溶液;然后加入埃洛石纳米管(溶菌酶和埃洛石纳米管质量比为1:50),得到溶菌酶和埃洛石的复合悬液,搅拌均匀后将悬液超声处理30min,使埃洛石纳米管均匀分散并充分吸附溶菌酶,所有操作温度控制在4℃;再将混合体系在3000rpm条件下离心10min后,用PBS洗涤,最后冷冻干燥(冷冻室温度为-80摄氏度,干燥腔的压力为100Pa),得到负载溶菌酶的埃洛石纳米管;测定溶菌酶负载效率为87.3%;
(2)将壳聚糖(壳聚糖分子量为10万,脱乙酰度为90%)溶于乙酸水溶液中配制成质量浓度为2%的壳聚糖溶液,加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液将壳聚糖溶液pH值调至6;然后加入步骤(1)制得的负载溶菌酶的埃洛石纳米管(壳聚糖与负载溶菌酶的埃洛石纳米管的质量比为1:1),快速搅拌10min后,加入三聚磷酸钠制得悬浊液(三聚磷酸钠和壳聚糖的质量比为0.3:1);
(3)将步骤(2)得到的悬浊液在3000rpm速度下离心分离30min,所得沉淀用去离子水洗涤后,重复离心分离(3000rpm,30min)和去离子水洗涤的操作3次,之后将沉淀冷冻干燥(冷冻室温度为-80摄氏度,干燥腔的压力为100Pa),即得到所述具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。
将本实施例所得到的具有抗菌促愈合活性的复合止血粉进行抗菌实验,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为208ug/ml,对大肠杆菌的MIC为308ug/ml。兔止血试验:选取3只新西兰白兔,常规手术麻醉后,大腿的动脉被剪断,敷上该复合止血粉,记录止血时间为16.7±1.8秒。结果表明,按本发明制备的复合止血粉具有良好的抗菌和止血作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种具有抗菌促愈合活性的复合止血粉的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将溶菌酶溶解于pH=5~8的磷酸缓冲溶液中得到溶菌酶溶液,然后加入埃洛石纳米管,得到溶菌酶和埃洛石的复合悬液,搅拌均匀后将悬液超声处理,使埃洛石纳米管均匀分散并充分吸附溶菌酶,再将混合体系经离心沉降、洗涤和冷冻干燥,得到负载溶菌酶的埃洛石纳米管;
(2)将壳聚糖溶于乙酸水溶液中配制成壳聚糖溶液,并将pH调节为6,然后加入步骤(1)制得的负载溶菌酶的埃洛石纳米管,搅拌5~15min后,加入氢氧化钠溶液将pH调为7制得悬浊液,或是加入有机沉淀剂制得悬浊液,或是加入交联剂制得悬浊液;
(3)将步骤(2)得到的悬浊液离心分离,所得沉淀用去离子水洗涤后,重复离心分离和去离子水洗涤的操作2~5次,之后将沉淀冷冻干燥,即得到所述具有抗菌促愈合活性的复合止血粉;
步骤(1)所述溶菌酶和埃洛石纳米管的质量比为(0.001:1.000)~(0.050:1.000);步骤(2)所述壳聚糖与负载溶菌酶的埃洛石纳米管的质量比为1.00:(0.05~50.00)。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所有操作温度控制在4~25℃,所述溶菌酶溶液的质量浓度为0.1~3.0%。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中通过加入交联剂的方式制备悬浊液时,在得到悬浊液后通过喷雾干燥的方式去除溶剂,得到所述具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液将壳聚糖溶液pH值调节为6;所述壳聚糖的分子量为1~30万,脱乙酰度为60~98%;所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.2~3.0%。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述有机沉淀剂为无水乙醇、丙酮、乙醚和四氢呋喃中的一种;有机沉淀剂与壳聚糖溶液的质量比为2~5:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述交联剂为乙二醛、戊二醛、三聚磷酸钠、四聚磷酸钠和京尼平中的一种;交联剂与壳聚糖的质量比为(0~0.1):1.0。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述交联剂与壳聚糖的质量比为(0.03~0.10):1.00。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述离心分离的速度为3000rpm,时间为10~30min。
9.权利要求1~8任一项所述制备方法获得的具有抗菌促愈合活性的复合止血粉。
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CN104162182A (zh) | 2014-11-26 |
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