CN104136624A - 预测微生物数的增殖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种预测饮食品中微生物数的增殖的方法。解决方案为：通过具备下述的工序的方法来解决。(1)取得健康菌和损伤菌的增殖的概率密度函数以及损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间数据的工序；(2)取得预测对象试样中的微生物的增殖数据，根据该数据拟合新逻辑模型，算出参数值，将该参数值应用于新逻辑模型，取得温度变动型增殖预测模型的工序；(3)由(1)的概率密度函数和(2)的增殖预测模型取得概率论的微生物增殖预测模型的工序；和(4)将任意的初期存在菌数、任意的温度、任意的经过时间输入(3)的模型中，通过概率论的预测方法，求出对应初期存在菌数的各自的增殖菌数，将其合计，由此得到饮食品中的增殖菌数的工序。

Description

预测微生物数的增殖的方法
技术领域
本发明涉及预测微生物数的增殖的方法。
背景技术
因饮食品中的污染微生物导致的腐败、变败的程度与污染微生物数的增殖成比例地进行，但实际上受到产品的性质、种类、微生物种、保存温度、污染后的经过时间等的影响。为了预知饮食品中的污染微生物数的增殖数，需要实施对对象产品接种微生物的保存试验。保存试验以一定的微生物种和一定的温度进行实施，因此必须针对每个对象微生物或每个对象温度实施保存试验，需要大量的时间、劳力、费用。另外，如实际的产品流通时，保存温度发生复杂的变化的情况下，难以从产品的温度履历预测对象污染微生物的增殖。因此，寻求不像保存试验那样需要大量的时间、劳力、费用，预测在实际的流通保存条件中饮食品中的微生物数的增殖的方法，进行了各种研究。
例如，在日本特开2007－312738号公报(专利文献1)中公开了一种预测饮食品中的微生物繁殖性的方法，其针对饮食品取得成分分析值作为定量数据，再取得微生物的繁殖性的有无作为微生物的增殖有或微生物的增殖无的任一个定性数据，通过鉴别分析法解析所取得的两个数据，由饮食品分析值构建预测微生物的繁殖性的预测模型，基于该预测模型，由饮食品的成分分析值预测饮食品的微生物繁殖性。通过该方法，显示能够以高精度预测含酱油饮食品等饮食品中的危害微生物的繁殖性。另外，也已知有使用大肠菌、沙门氏菌、黄色葡萄球菌等的增殖行为数据和数学模型，开发了预测各种温度条件下的微生物增殖的计算机程序的例子(非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007－312738号公报
非专利文献
非专利文献1：食品卫生学杂志47，288－292，2006
发明内容
发明所要解决的课题
目前为止的预测方法着眼于微生物繁殖的环境条件，使用由活化培养的无伤健康菌求得的增殖模型，考虑各种因子，预测微生物数的增殖。这是目前的实际情况。但是，可以认为饮食品中的微生物通过热处理、饮食品的pH等收到外部的应激，不限于描绘与健康菌同样的的增殖曲线，这是与预测的结果之间产生误差的原因。
本发明的课题在于提供一种考虑了由于外部的应激受到损伤的损伤菌的增殖速度、预测饮食品中微生物数的增殖的方法。更具体而言，其课题在于提供一种一边考虑饮食品中污染微生物因外部的应激导致的诱导期的延长时间，一边预测任意的温度和任意的经过时间的微生物数的增殖的方法。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明人研究了在由健康菌得到的现有数学模型(微生物的增殖预测模型)中考虑了损伤菌的增殖行为数据的微生物增殖的预测方法。其结果，发现如下方法，即，取得健康菌和损伤菌的增殖的概率密度函数以及损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间数据，由预测对象试样的微生物的增殖数据算出新逻辑模型的参数值，制作温度变动型增殖预测模型，由该概率密度函数和该温度变动型增殖预测模型，取得概率论的微生物增殖预测模型，将任意的初期存在菌数、任意的温度、任意的经过时间输入该概率论的微生物增殖预测模型中，通过概率论的预测方法，求出对应初期存在菌数的各自的增殖菌数，将其合计，由此预测增殖菌数的方法，从而完成了本发明。
即，本发明第一方面的发明为预测饮食品中微生物数的增殖的方法，其是考虑损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间，预测增殖的方法。
第二方面的发明为如第一方面所述的方法，其特征在于：从健康菌的增殖的概率密度函数减去损伤菌的增殖的概率密度函数，求出上述损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间。
第三方面的发明为如第二方面所述的方法，其特征在于：使用数字显微镜方式细菌检测装置，取得健康菌和损伤菌的增殖的概率密度函数。
第四方面的发明为如第一～三方面的任一方面所述的方法，其包括下述的工序：
(1)取得健康菌和损伤菌的增殖的概率密度函数以及损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间数据的工序；
(2)取得预测对象试样中的微生物的增殖数据，根据该数据拟合新逻辑模型，算出参数值，将该参数值应用于新逻辑模型，取得温度变动型增殖预测模型的工序；
(3)由(1)的概率密度函数和(2)的增殖预测模型，取得概率论的微生物增殖预测模型的工序；和
(4)将任意的初期存在菌数、任意的温度、任意的经过时间输入(3)的模型中，通过概率论的预测方法，求出对应初期存在菌数的各自的增殖菌数，将其合计，由此得到饮食品中的增殖菌数的工序。
第五方面的发明为如第四方方面的方法，其中，概率论的预测方法为蒙特卡罗模拟法。
发明效果
根据本发明，能够通过微生物各个水平定量评价因外部的应激使微生物不均匀受损的损伤程度，同时能够通过温度变动型的增殖模型预测食品中的增殖行为，因此能够进行反映实际的污染菌的性质和食品中的行动的客观菌数预测。
附图说明
图1为表示实施例1中的加热损伤菌和健康菌的菌落检测的变化的图。
图2为表示实施例2中的加热损伤菌和健康菌的菌落检测的变化的图。
具体实施方式
本发明的方法具有上述(1)至(4)的工序。
(1)的工序
在本发明的方法中，首先取得健康菌和损伤菌的增殖的概率密度函数以及损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间数据。所谓损伤菌，通常定义为受到加热、药剂等各种外部的应激而成为半致死的损伤状态的菌。考虑损伤菌污染产品时，可能表现出与健康菌不同的行为，为了进行产品的品质、安全性、保存性的评价，需要考虑损伤菌的行为。在本发明中，着眼于损伤菌的诱导期比健康菌的诱导期慢的事实。而且，将损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间数据输入预测模型。
在实际的环境下，损伤菌被赋予各种外部的应激，各个损伤菌的损伤状态不同。在本发明中，为了得到预测模型，使用人为地赋予了外部的应激的损伤菌。外部的应激，例如，作为物理的应激包括所有热处理、特别是生产线中的杀菌工序的热处理、高压处理、超声波处理等，作为化学应激，包括氯类药剂、醇、细菌素等抗菌剂等。除此以外，也包括制造环境的干燥、饥饿应激等，其特征在于对微生物赋予损伤的因素没有特别限定。另外，赋予的外部的应激可以是1个应激，也可以是多个应激。
在本发明中，所谓诱导期是指在培养开始后、直到各个细胞开始增殖的时间，在得到增殖曲线的情况下，大致相当于开始培养之后、直至对数增殖期的时间。损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间数据通过求出健康菌的诱导期(诱导时间)和损伤菌的诱导期(诱导时间)之差而得到。损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间数据的取得，例如能够使用数字显微镜方式细菌检测装置等设备来进行。
所谓数字显微镜方式细菌检测装置，是能够在显微镜水平经时地对平板培养中的菌落形成进行自动计测的装置，例如由Microbio公司作为Biomatic DMCS(商品名；注册商标)进行售卖。该装置以细菌检查的迅速测定为目的开发得到，该装置涉及的细菌检测技术是已知的技术。但是，关于损伤菌的损伤恢复所需要的时间、即关于微生物的应激损伤导致的诱导期的延长时间，在其概率论的预测中使用数字显微镜方式细菌检测装置的例子仍是未知的。
诱导期的延长作为菌体中产生的损伤恢复、开始增殖所需要的时间而被捕捉。诱导期即使为健康菌在各个细胞中也不同。另外，即使赋予一定条件的损伤，其损伤程度在各个细胞中也不同，损伤菌的诱导期在各个细胞中不同。因此，在本发明中，关于健康菌和损伤菌，分别考虑各个细胞的诱导期的偏差，求得两菌的增殖的概率密度函数(菌落形成速度曲线)。而且，由所得到的2个概率密度函数求出诱导期的延长时间，即由损伤菌的分布和健康菌的分布之差求出诱导期的延长时间。数字显微镜方式细菌检测装置对各个菌落形成进行计测，因此能够容易地求得着眼于各个细胞的诱导期。
在本发明的方法中，为了取得健康菌和损伤菌的增殖的概率密度函数，例如以一定温度进行培养，以一定的时间间隔对菌落形成经时地进行自动计测，对所得到的数据进行解析，制作每单位时间新检测到的健康菌和损伤菌的菌落数的直方图，如果利用在计算机上工作的适当的软件对其进行解析就能够得到。由健康菌和损伤菌分别制作的直方图表示各个细胞的诱导期的分布，由该分布取得增殖的概率密度函数。作为进行这样的解析的软件，例如可以列举RISK(Palisade公司)、Crystall Ball(Oracle公司)等。诱导期的延长时间(X)作为损伤菌的分布(函数)和健康菌的分布(函数)的时间差(Y)而求得。
(2)的工序
接着，在本发明的方法中，取得预测对象试样中的微生物的增殖数据，根据该数据拟合新逻辑模型，算出参数值，将该参数值应用于新逻辑模型，取得温度变动型增殖预测模型。所谓新逻辑模型，是记载在藤川等的文献(食品卫生学杂志，44，155－160，2003)中的微生物增殖模型。具体而言，使用预测对象试样，以任意的温度(希望设定3种以上的温度)培养健康菌，将得到的微生物增殖曲线的实测值为基础，通过数值解析，以4次的龙格－库塔法，对新逻辑模型的微分方程式进行分解。Nmax(最大菌数)输入稳定期的菌数的值，Nmin(最小菌数)输入开始的菌数的值，对数的斜率输入对数增殖期的近似曲线的斜率，例如通过计算机软件Excel(注册商标，Microsoft公司)的解算功能等，求出新逻辑模型的调整参数的m和n的值。速度常数k通过平方根模型，由通过增殖数据的拟合求得的各培养温度中的增殖速度进行预测。根据以上的方法，取得预测对象试样中的温度变动型增殖预测模型。
预测对象试样只要能够预测微生物的增殖即可，没有特别限定。预测对象试样例如可以为茶、果汁等清凉饮料水，可以为牛奶、酸乳酪、冰激凌等的乳产品，也可以是牛肉、猪肉、鸡肉等的肉类。
(3)的工序
在本发明的方法中，接着由健康菌和损伤菌的增殖的概率密度函数以及温度变动型增殖预测模型，取得概率论的微生物增殖预测模型。具体而言，使健康菌的概率密度函数、和损伤菌的概率密度函数、温度变动型增殖预测模型进行数学结合，由任意设定的初期存在菌，考虑诱导期的延长时间(损伤菌和健康菌的菌落检测时间之差)，例如通过蒙特卡罗模拟等的概率论的预测方法进行预测，将其值适用于温度变动型增殖预测模型，能够预测任意温度中的任意时间经过后的增殖菌数。(2)的工序中的温度变动型增殖预测模型为以使用健康菌而得到的增殖曲线为基础进行模拟的模型，为通过输入预测对象试样的初期存在菌数、任意的温度、任意的经过时间(T)，预测在该温度中保存的情况下预测对象试样中增殖的菌数的模型。但是，实际的食品中的细菌为在保存开始时已经通过加热处理等受到损伤的损伤菌，如上所述，与健康菌不同，直至开始增殖的时间延迟。(3)的工序是考虑损伤菌中直至该增殖开始的延迟的工序，在该工序中，针对健康菌，修正诱导期的延长时间之后，取得温度变动型增殖预测模型。具体而言，损伤菌与健康菌相比，只是诱导期的延长时间延迟而进行增殖，因此将从设定的任意时间(T)减去诱导期的延长时间(X)而得到的时间(t)作为健康菌的经过时间，对该经过时间所增殖的菌数进行模拟，取得概率论的微生物增殖预测模型。这里得到的概率论的微生物增殖预测模型以1个损伤菌在设定的任意时间(T)增殖为几个这样的概率论的模型表示。也就是说，1个损伤菌例如增殖为1000个、增殖为1100个、还是增殖为900个能够进行概率论预测。
(4)的工序
接着，对关于初期存在菌数分别得到的增殖预测菌数进行合计，作为任意温度和任意经过时间(T)的、饮食品中的污染微生物数的总数(预测菌数)。以上述(3)的工序得到的概率论的微生物增殖预测模型为输入1个细菌得到经过时间(T)后的增殖菌数的概率论的模型。在该模型中，初期存在菌数为1个时，作为概率论得到经过时间(T)的增殖推定菌数。因此，初期存在菌数如果为多个的情况下，按照该概率论的微生物增殖预测模型进行多次模拟，将以各模拟得到的菌数进行合计，作为预测菌数。
该结果，能够预测受到外部应激的细菌在预测对象试样中增殖的结果、增殖为何种程度的菌数。即，接受加热处理的食品、例如作为产品的乳饮料被保存的情况下，能够以更接近于实际状态的状态推定食品中残留的细菌增殖为何种程度的菌数。另外，本发明的方法的特征在于，考虑损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间，预测饮食品中的微生物数的增殖，只要是考虑损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间来预测饮食品中的微生物数的增殖的方法即可，对上述的预测方法没有特别限定。
以下，基于实施例，更详细地对本发明进行说明。另外，该实施例不对本发明进行限定。
实施例1
〔健康菌和损伤菌的概率密度函数的定义〕
利用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TRYPTICASE SOY BROTH)(TSB)将作为供试验菌的Enterobacter cloacae(阴沟肠杆菌)B－855活化后，利用灭菌磷酸缓冲生理盐水进行清洗，制备菌液。在试验管中加入灭菌磷酸缓冲生理盐水，确认在热水浴中升温到52℃，添加菌液，保持20分钟，实施加热处理(损伤菌)。将健康菌(未加热菌)和加热处理菌涂抹在标准琼脂培养基，以DMCS S－12(Microbio公司)进行30℃培养，以30分钟间隔经时地自动计测菌落形成。
对所得到的数据进行解析，制作每单位时间新检测的健康菌和加热处理菌(加热损伤菌)的菌落的直方图(图1)。该直方图的概率密度函数作为＠RISK(Palisade公司)的函数之一，即使用现有的试样值表现连续分布的RiskGeneral函数(各点由值x和表示其概率的分量的p表示的、n个(x，p)配对由x的最小值至最大值之间定义的概率分布的一般密度函数)而得到。然后，由损伤菌的概率密度函数减去健康菌的概率密度函数，求出诱导期的延长时间。
〔温度变动型增殖预测模型的制作〕
利用与上述同样的方法制备作为供试验菌的Enterobacter cloacae B－855的菌液，在牛奶中接种，使得体系内成为100cfu/mL后，以10℃、20℃、30℃进行培养。经时地取出试样，利用标准琼脂培养基培养法测定活菌数。接着，根据所得到的增殖数据(培养时间和菌数的关系数据)拟合新逻辑模型(数学式1)，求得新逻辑模型的调整参数m和n的值。
[数学式1]
dN dt = kN { 1 - ( N N max ) m } { 1 - ( N min N ) n }
N：菌数，t：时间，k：速度常数，
Nmax：最大菌数，Nmin：最小菌数，
m和n：调整参数
此时，速度常数k通过表示微生物的增殖和温度的关系的平方根模型(数学式2)而求得。
[数学式2]
k = b ( T - T min )
K：速度常数，b：系数，
T：温度，Tmin：增殖的最低温度(理论值)
将以上的方法得到的参数值应用于新逻辑模型，制作Enterobactercloacae B－855的牛奶中的温度变动型增殖预测模型。
〔概率论的微生物增殖预测模型的制作〕
使上述得到的健康菌的概率密度函数、损伤菌的概率密度函数、和所得到的温度变动型增殖预测模型进行数学结合，制作概率论的微生物增殖预测模型。具体而言，针对任意设定的初期存在菌数，求出损伤菌和健康菌的菌落检测时间之差，将该值适用于温度变动型增殖预测模型，能够求出任意温度的任意时间经过后的增殖菌数。
〔菌数预测〕
作为菌数预测的一个例子，将牛奶中最初存在的菌数假定为10cfu/L，将保存温度设定为10℃，实施试行次数10次的蒙特卡罗模拟。结果，保存天数10天后的Enterobacter cloacae B－855的菌数预测为740000cfu/mL。
根据以上方法，预测了受到52℃、20分钟的应激损伤的Enterobacter cloacae B－855在牛奶中污染10cfu/L的情况下的、10℃、10天的菌数。
实施例2
〔健康菌和损伤菌的概率密度函数的定义〕
利用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TRYPTICASE SOY BROTH)(TSB)将作为供试验菌的Pseudomonas fluorescence(荧光假单胞菌)B－125活化后，利用灭菌磷酸缓冲生理食盐水进行清洗，制备菌液。在试验管中加入灭菌磷酸缓冲生理食盐水，确认在热水浴中升温到46℃，添加菌液，保持5分钟。将健康菌(未加热菌)和加热处理菌涂抹在标准琼脂培养基中，以DMCS S－12(Microbio公司)进行10℃培养，以3小时间隔经时地自动计测菌落形成。
对所得到的数据进行解析，制作每单位时间新检测的健康菌和加热处理菌(加热损伤菌)的菌落的直方图(图2)。该直方图的概率密度函数作为RISK(Palisade公司)的函数之一，即使用现有的试样值表现连续分布的RiskGeneral函数(各点由值x和表示其概率的分量的p表示的、n个(x，p)配对由x的最小值至最大值之间定义的概率分布的一般密度函数)而得到。然后，由损伤菌的概率密度函数减去健康菌的概率密度函数，求出诱导期的延长时间。
〔温度变动型增殖预测模型的制作〕
利用与上述同样的方法制备作为供试验菌的Pseudomonasfluorescence B－125的菌液(健康菌)，在牛奶中接种，使得体系内成为100cfu/mL后，以5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃进行培养。经时地取出试样，利用标准琼脂培养基培养法测定活菌数。接着，根据所得到的增殖数据(培养时间和菌数的关系数据)拟合新逻辑模型(数学式1)，求得新逻辑模型的调整参数m和n的值。将求得的参数值应用于新逻辑模型，制作Pseudomonas fluorescence B－125的牛奶的温度变动型增殖预测模型。
〔概率论的微生物增殖预测模型的制作〕
利用与实施例1同样的步骤，使上述得到的健康菌的概率密度函数、损伤菌的概率密度函数、和由其得到的温度变动型增殖预测模型进行数学结合，制作概率论的微生物增殖预测模型。
〔菌数预测〕
作为菌数预测的一个例子，将牛奶中最初存在的菌数假定为8cfu/L，将保存温度设定为10℃，实施试行次数8次的蒙特卡罗模拟。结果，保存天数6天后的Pseudomonas fluorescence B－125的菌数预测为12000cfu/mL。
根据以上方法，预测了受到46℃、5分钟的应激损伤的Pseudomonas fluorescence B－125在牛奶中污染8cfu/L的情况下的、10℃6天后的菌数。
在上述的各实施例中，使用肠杆菌和假单胞菌进行预测，但在本发明中，不限定于这些细菌，不只大肠菌、沙门氏菌、黄色葡萄球菌这样的有可能涉及危害健康、食品品质劣化的细菌，也可以适用于乳酸菌、双尾菌等用于益生菌这样的细菌。
产业上的可利用性
根据本发明，能够以微生物各个水平定量地评价由外部的应激使微生物不均匀地受到的损伤程度，同时通过温度变动型的增殖模型，能够预测食品中的增殖行为，因此能够进行反映实际的污染菌的性质和食品中的行为的客观的菌数预测。如果以作为对象的微生物种、损伤条件制作概率论的微生物预测模型，能够不实施对赋予外部应激的微生物的保存试验，通过模拟瞬时地预测任意的温度时间条件中的食品中的菌数，因此能够用于产品的品质设计、尝味期限的设定、验证、生产工序的品质设计、验证、工作人员的教育工具等。

Claims (5)

1.一种预测饮食品中微生物数的增殖的方法，其特征在于：
考虑损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间，预测增殖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
从健康菌的增殖的概率密度函数减去损伤菌的增殖的概率密度函数，求出所述损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
使用数字显微镜方式细菌检测装置，取得健康菌和损伤菌的增殖的概率密度函数。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，包括下述的工序：
(1)取得健康菌和损伤菌的增殖的概率密度函数以及损伤菌相对于健康菌的诱导期的延长时间数据的工序；
(2)取得预测对象试样中的微生物的增殖数据，根据该数据拟合新逻辑模型，算出参数值，将该参数值应用于新逻辑模型，取得温度变动型增殖预测模型的工序；
(3)由(1)的概率密度函数和(2)的增殖预测模型，取得概率论的微生物增殖预测模型的工序；和
(4)将任意的初期存在菌数、任意的温度、任意的经过时间输入(3)的模型中，通过概率论的预测方法，求出对应初期存在菌数的各自的增殖菌数，将其合计，由此得到饮食品中的增殖菌数的工序。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
概率论的预测方法为蒙特卡罗模拟法。
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