CN104127890A - 整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米胶体及其在新生血管生成的磁共振成像中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(αvβ3-MnOL-Gd NC)及其在新生血管生成的磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)中的应用。本发明的一种αvβ3-MnOL-Gd NC，是通过在锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子表面偶联上整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺的靶向αvβ3的特异性生物分子得到的。研究表明，αvβ3-MnOL-Gd NC对于成像新生血管生成是有效的，可以在注射2小时后产生特异性新生血管成像的高信号对比。因此，本发明公开的一种αvβ3-MnOL-Gd NC可用于新生血管生成的T1加权MR分子成像，且无明显过敏反应副作用的发生，本发明为新生血管生成的磁共振成像提供了一种新的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种整合素靶向性纳米胶体及其应用，特别涉及一种偶联了αvβ3(αvβ3-integrin)的整合素靶向性杂化锰钆纳米胶体及其在新生血管生成的磁共振成像中的应用，本发明属于医药技术领域。
背景技术
新生血管生成是动脉粥样硬化斑块发展的关键微观解剖特征，在易损斑块的扩展和斑块的破裂过程中发挥着关键性的作用。2011年发表的PROSPECT前瞻性临床试验结果证实：综合考量通过血管内超声成像依据传统预测斑块破裂的形态学指标(如菲薄的纤维帽、斑块负荷、最小管腔横截面积)不能有效预测急性血管事件的发生！由该方法成功预测未来2年中由于斑块破裂造成的急性血管事件的发生率仅占实际发生率的18％。与之相对应的是，来源于斑块增生的脆弱的新生血管引发的斑块内出血(intraplaque hemorrhage，IPH)，被认定为斑块不稳定性的重要生物预测靶点，与患有中度狭窄的颈动脉斑块病人发生脑中风高度相关。
目前非侵袭性检测血管供应改变的技术包括利用CT成像测量微血管密度(microvessel density，MVD)和动态增强磁共振成像(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI)。DCE-MRI定量结果(例如Ktrans)一直作为研究血管滋养管扩张的指标参数，可以用于筛选符合进行颈动脉内膜剥脱外科手术要求的患者。然而，在临床上识别这类血管斑块仅造成中度管腔狭窄却有高度斑块破裂危险和中风危险的患者在技术上具有很高的挑战性。以放射性核素氟18标记的氟脱氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG)为示踪剂的正电子发射断层成像/磁共振成像(position emission tomography/magnetic resonance imaging，PET/MRI)有望成为类似DCE-MRI的新型无创检测动脉粥样硬化斑块内细胞活动的技术方法，但目前还无法确定这种技术是否可以用于从颈动脉粥样硬化斑块患者中大规模筛选有高度斑块破裂风险的患者。
到目前为止，已经有文献报道利用具有较高弛豫率的顺磁性纳米粒子(nanoparticles，NPs)针对整合素αvβ3(一种异二聚体跨膜糖蛋白)进行T1加权(T1-weighted，T1w)MR分子成像来鉴别处于增殖期和静止期的血管内皮细胞，这类研究通常都是借助合成表面偶联高浓度的金属钆螯合物的NPs得以实现的。然而，最近证实作为常规MRI对比剂的线性结构钆螯合剂，能在体内能发生金属离子置换及钆离子游离，是引发肾源性系统性纤维化(nephrogenic systemic fibrosis，NSF)的主要原因。出于生物安全性的考虑，学术界正在积极开发新型MR对比剂来减少线性结构钆螯合物的使用，同时提倡使用更为安全的化学结构为大环状的金属钆螯合剂。除了金属置换和NSF，所有通过静脉注射的NPs都有潜在激活生物体免疫补体系统的可能。
功能化螯合钆剂的NPs能引起急性补体系统激活，这是生物体自体免疫反应的一个重要分支，能引起严重的副作用，包括高血压和致死。有研究结果表明在表面功能化的脂质NPs表面修饰某些功能基团可以引起补体系统激活，是通过IgM抗体引发的经典通路实现的(R.Virmani,F.D.Kolodgie,A.P.Burke,A.V.Finn,H.K.Gold,T.N.Tulenko,S.P.Wrenn,J.Narula Arterioscler Thromb Vasc Biol.2005,25,2054-2061.)(见图1)。在这个事件中，反应的强度取决于偶联在NPs脂质膜上的螯合物的化学结构，而不仅仅是NPs表面电荷那么简单。为了实现靶向分子成像应用，表面偶联钆螯合物的NPs使用钆的浓度剂量是临床批准用于人体的钆螯合物浓度的1/8左右(100,000金属离子/纳米粒子)。虽然钆-环状螯合物进一步减少了NSF的风险性，但这类螯合物仍然可能引起人体的急性补体激活反应。因此目前迫切的需要开发一种能同时实现降低NSF风险、避免补体激活免疫反应且保持高T1对比效应的新型纳米粒子的化学合成策略。
在体外和活体研究中已经证实，脂质包裹的全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)NPs或表面偶联上高浓度线性结构金属钆螯合物——二乙烯五胺乙酸钆(Gd-DTPA)的PFC NPs在补体激活反应(complement activation，CA)方面是“免疫静默”的，然而，表面偶联环状结构钆螯合剂——钆轮环藤宁四乙酸四乙酸(Gd-DOTA)，虽然能最小化金属钆离子置换反应的发生，改善NPs的弛豫率，但是会引起强烈的补体激活反应。正因为如此，本研究旨在合成一种新型的、安全性更高的、可临床转化的T1w血管整合素靶向性纳米粒子，用于在体MR分子成像新生血管的特异性标记物整合素αvβ3的表达。
锰(Mn3+/Mn2+)由于具有高自旋量子数、容易发生水分子交换、长电子弛豫时 间、高自然丰度和已知的相对安全的人体生物化学特性，一直以来都作为T1w MR对比剂进行研究。2009年Pan等人首次合成和表征了一种“软物质”型二价油酸锰(manganese oleate，MnOL)为核心的锰基纳米粒子胶体(nanocolloid，NC)，可以用于血栓的纤维素成像。然而，进一步的实验显示MnOL NC不适用于动脉粥样硬化斑块内新生血管生成时特异性表达的整合素αvβ3的在体分子成像。因此，本项目研制了一种新型杂化金属复合体——锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-Gd NC)，即在MnOL NC表面偶联低剂量亲脂性钆螯合物，用以进一步增加MnOL NC的r1弛豫率，同时减少作为镧系重金属的钆螯合物的用量，避免引起NSF风险。并且通过表面偶联整合素αvβ3的特异性结合物进一步证实：该MnOL-Gd NC可用于有效在体成像表达含量很稀疏的动脉粥样硬化新生血管生成的特异性标志物(如整合素αvβ3)，同时减少作为重金属钆螯合物的用量避免急性补体激活。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种整合素αvβ3靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(αvβ3-integrin–targeted MnOL-Gd-hybrid nanocolloids)，简称为整合素靶向性杂化锰钆纳米粒子胶体(αvβ3-MnOL-Gd-NC)。
本发明的目的之二在于提供一种制备上述整合素αvβ3靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体的方法。
本发明的目的之三在于提供上述整合素αvβ3靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体在新生血管生成的在体磁共振成像中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明一种整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的纳米粒子胶体中含有复数个整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子，所述整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子由内核层和外壳层组成，其中内核层包括油酸锰分子以及作为悬浮介质的浓缩剂，外核层包括整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺的靶向αvβ3的特异性生物分子、钆螯合物以及磷脂类化合物。
在本发明所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体中，优选的，所述的浓缩剂为聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或红花油中的一种或几种的组合，更优选的，所述的聚山梨酯为聚山梨酯80。
在本发明所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体中，优选的，所述的磷脂类化合物为磷脂酰胆碱、卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)或胆固醇。
在本发明所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体中，优选的，所述的钆螯合物为钆-二乙撑三胺五乙酸油酸双酯(Gd-DTPA-BOA)或钆-轮环藤宁四乙酸四乙酸磷脂酰乙醇胺(Gd-DOTA-PE)。
在本发明所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体中，优选的，所述的靶向αvβ3的特异性生物分子包括整合素αvβ3拮抗物、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(Arg-Gly-Asp peptide，RGD)或靶向整合素αvβ3的受体单抗。
进一步的，本发明还提出了一种制备以上任一项所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在氮气氛围下，将二价油酸锰MnOL悬浮在浓缩剂中，在100-300兆帕和0-25℃条件下加入磷脂表面活性剂，充分混合，所述的磷脂表面活性剂包括磷脂类化合物，钆螯合物，马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000的磷脂酰乙醇胺、以及靶向αvβ3的特异性生物分子；所述的马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000的磷脂酰乙醇胺与靶向αvβ3的特异性生物分子的摩尔比为1∶0.1～1∶10；
(2)混合液在25℃～55℃超声浴的条件下反应0.5h～24h，反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在氮气吹扫下封装，即得。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000的磷脂酰乙醇胺与靶向αvβ3的特异性生物分子的摩尔比为1∶1或1：2。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的磷脂表面活性剂包括0.02～5摩尔％马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺、0.002～50摩尔％的靶向αvβ3的特异性生物分子、0.1-50摩尔％的钆螯合物和0.1-99.8摩尔％的磷脂类化合物，所加入的磷脂表面活性剂的终浓度为0.015-0.025g/ml，更优选的，所述的磷脂表面活性剂包括0.1摩尔％马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺、0.1摩尔％的整合素αvβ3拮抗物、1.25摩尔％的钆螯合物和98.55摩尔％的磷脂酰胆碱，所加入的磷脂表面活性剂的终浓度为0.02g/ml。
在本发明所述的方法中，优选的，混合液在37℃～40℃超声浴的条件下反应0.5h～24h。
更进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体在制备新生血管生成的磁共振成像对比剂中的应用。
本发明的研究目标包括：1)在体外及活体实验中显示MnOL-Gd NC减少急性补体激活反应；2)在高脂饮食饲养的动脉粥样硬化兔模型主动脉上证实αvβ3-靶向性MnOL-Gd NCs成像新生血管生成的有效性；3)表征MnOL-Gd NC的生物分布及代谢途径。
用含有不同浓度(0.6,1.25和2.5mole％)的亲脂性钆螯合剂偶联油酸锰纳米胶体(MnOL-Gd NC)后制成探针，分别在离体的人血清及活体小鼠模型中检测下列各组的补体激活能力：单独使用盐水、不含钆剂的纳米粒子、表面分别含有浓度为0.6,1.25和2.5摩尔％Gd螯合剂的MnOL NC、表面含钆浓度在20-30摩尔％的NC以及阳离子NC。在高脂饮食饲养12个月的动脉粥样硬化新西兰大白兔模型中进行斑块新生血管生成的MR分子成像：其中高脂饮食兔模型16只，分成2组，每组8只，分别通过耳缘静脉注射整合素αvβ3靶向性超低浓度(1.25mol％)金属钆螯合物偶联油酸锰纳米胶体(αvβ3-integrin–targeted Gd-MnOL-hybrid nanocolloids,αvβ3-MnOL-Gd-NC)和非靶向性超低浓度(1.25mol％)金属钆螯合物偶联油酸锰纳米胶体(nontargeted(NT)-MnOL-Gd NC)；同月龄正常饮食饲养的对照组兔模型8只，通过耳缘静脉注射靶向对比剂αvβ3-MnOL-Gd-NC。各组模型注射对比剂后用3.0特斯拉(Tesla，T)MR连续成像2小时。在注射对比剂之前及之后采集血液样本进行临床血液生物化学及血清学检测。成像后对实验动物进行安乐死，采集动物重要脏器及胸主动脉血管，通过电感偶合等离子体光学发射光谱仪(inductive coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES)分析各主要脏器中Mn2+和Gd3+的浓度，进而分析纳米胶体在生物体中的分布。MRI结果同胸主动脉血管的荧光成像及免疫组织化学染色结果进行对比。
结果：体外血清学及活体动物实验均证实：与已知的阳性对照组及阴性对照组相比，Gd-MnOL NC引起急性补体激活反应可以忽略不计(p<0.05)。αvβ3-Gd-MnOLNC对于成像兔动脉粥样硬化模型斑块新生血管生成是有效的，可以在注射2小时后产生特异性新生血管成像高信号对比：注射靶向对比剂的高脂饮食饲养动物组的新生血管对比度(4950±2172)较非靶向对比剂高脂饮食饲养动物组(297±297)或靶向对比剂正常饮食饲养动物组(396±138)明显增高(p<0.05)。
免疫组织化学染色结果证实高脂饮食饲养的动脉粥样硬化兔模型胸主动脉内膜明显增厚，向管腔内突出，血管外膜及斑块内新生血管高表达整合素αvβ3，正常 饮食组兔模型胸主动脉内膜无明显增厚，其内偶见稀少新生血管。用ICP-OES方法检测成像后6小时各组动物体内Mn2+和Gd3+的生物分布，结果显示油酸锰主要通过胆汁和粪便排泄，而钆螯合剂主要通过尿液代谢。
上述研究表明：αvβ3-MnOL-Gd NC可用于新生血管生成的T1加权MR分子成像，无明显过敏反应副作用的发生，因此，有望成为可以进行临床转化的新生血管MR分子探针。
附图说明
图1为线性DTPA(图a,c)和环状DOTA(图b,d)钆对比剂的结构示意图及其相应副作用；图(e)为第一代单金属油酸锰纳米粒子胶体：二价油酸锰纳米粒子胶体(manganese(II)oleate nanocolloid，MnOL NC)的示意图；图c、d显示出Gd-DTPA-BOA具有短链化学结构，Gd-DOTA-PE有长链的化学结构；
图2为本发明的MnOL NC的示意图；
图2a说明表面整合Gd的MnOL-Gd NC(右)较单纯MnOL NC(左)有增强的r1弛豫率；图2b说明锰核心和钆放置在磷脂膜表面的两种方案：钆可以通过不同长度的偶联配体(或称短连接物或长连接物)连接到粒子表面；
图3为MnOL-Gd NC的物理化学性质表征；
图3a为1.25mol％MnOL-Gd NC的透射电镜图像；图3b为透射电镜测量粒子尺寸分布；图3c为原子力显微镜测得纳米粒子高度；图3d为固定内核层油酸锰的含量，分别改变表面螯合的Gd-DOTA-PE和Gd-DTPA-BOA的含量所得到的纳米粒子胶体粒径、多分散系数及表面电荷；图3e为相同锰浓度，不同钆浓度的MnOL-GdNC的r1弛豫率柱形图比较，磷脂膜包裹的MnOL浓度为10％v/v，粒子表面物质中整合不同浓度Gd-DTPA-BOA或Gd-DOTA-PE；金属含量用摩尔％表示，弛豫率通过回归直线的斜率±标准误表示；动态光散射法测得胶体粒径值，用纳米(nm)表示；zeta电位用毫伏(mV)表示；
图4a-b虚线箭头所指曲线代表MnOL-Gd NC浓度-信号曲线，而空心箭头所指曲线代表MnOL NC浓度-信号曲线，图4c表格列出不同样本中的金属离子和NC的弛豫率，单位为(s·mmol)-1；
图5A为体外补体激活CH50法检测，显示相对于正常人血清或对照NC，MnOL-Gd NC没有引起补体激活；而阳性对照样本(例如30mol％Gd-DOTA-PE或50mol％DOTAP-PE的PFC-NP)明显激活补体系统；图5B为C3a酶联免疫吸附试 验显示了相似的结果；相对于阴性对照组小鼠，MnOL-Gd NC几乎不引起补体激活，虽然在表面整合1.25mol％和2.5mol％Gd-DOTA-PE的MnOL-Gd NC检测组出现了小的改变，但改变具有统计学意义；这些改变相对于阳性对照组(αvβ3-靶向性20mol％Gd DOTA-PE纳米粒子和50mol％DOTAP-PE纳米粒子)很微小；
图6A为1.25mol％Gd-DOTA-PE MnOL NC的示意图，说明NC核心是由悬浮在聚山梨酯80中的高浓度MnOL小分子组成，表面由磷脂膜包裹，并偶联亲脂性螯合剂；通过高度特异性靶向内皮细胞表达的整合素αvβ3的喹诺酮类结构的多肽类似物偶联到PEG2000上，通过一种修饰后的磷脂锚定在NC表面活性物质上，从而实现NC靶向整合素αvβ3的功能化；图6B为测定水合粒径为138±10(Dav)/nm，多分散性系数为0.06；图6C为Gd-DOTA-PE MnOL NC的扫描电镜图像，图6D为原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)图像，粒径测量结果与电镜结果一致；
图7A到E为典型的高脂饮食饲养的兔经静脉注射αvβ3-MnOL-Gd NC对比剂120分钟后，胸部降主动脉管壁信号强化随时间逐渐增强(采用3D T1w脂肪抑制、黑血、自旋回波的扫描序列)；由于扫描序列的黑血功能，从基线图像到增强后的图像，胸部降主动脉管腔中始终没有血池信号的干扰，因此血管壁的信号强化特异性更强；从基线到注射对比剂2小时后过程中，新生血管的强化信号的空间分布在血管壁中逐渐范围增大，且强化信号强度逐渐增强；图7F显示在120分钟时间段内该层面横截段所有像素平均信号增强程度随时间呈单指数增加，与胸主动脉T1w信号增强映像图相一致；
图8为高脂饮食饲养兔注射靶向性或非靶向性MnOL-Gd NC，对比正常饮食饲养兔注射靶向性MnOL-Gd NC；
上排图表显示新生血管系数，下排图表显示动脉壁强化百分比的各组对比情况；定量化数据分析结构显示比较三组新生血管系数(强化像素数×信号强化百分比)和强化像素百分比，注射整合素靶向性MnOL-Gd NC的高脂饮食兔主动脉新生血管强化明显高于高脂饮食的非靶向组和正常饮食的靶向组；主要对比强化出现在主动脉壁内半部分(主要是斑块区域)；
图9A为注射αvβ3-整合素靶向性MnOL-Gd NC后的图主动脉的苏木素伊红(HE)染色结果，而图9D图显示相邻层面组织切片的荧光成像(αvβ3-整合素靶向性MnOL-Gd NC上标记有Alexafluor 594荧光染料)，纳米粒子出现在外膜、基质及增厚的内膜区；图9B和E图显示高脂饮食饲养的兔动脉粥样硬化斑块模型注射非靶向性MnOL-Gd NC后的主动脉的HE染色及荧光成像结果；纳米粒子的荧光分布与图9D 图相似，但每层主动脉切片上分布的含量远远低于高脂饮食的靶向成像组；图9C和图9F显示正常饮食饲养兔的主动脉及其外膜的HE染色及荧光成像结果，在外膜中可以观察到非常稀疏的AlexaFluor 594标记的αvβ3-整合素靶向性MnOL-Gd NC，基质和内膜层更少(——200μm，----200μm)；
图10为注射整合素靶向性MnOL-Gd NC 6小时后各种组织内Mn2+和Gd3+的含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1整合素αvβ3靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体的制备
(1)将360ml乙醇-水-正己烷混合物加入500ml圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入10g四水氯化锰(MnCl2.4H2O)以及40g油酸钠(TCI chemical)，80℃下反应14小时，随后在25℃反应4小时，经水洗、盐洗、Na2SO4干燥以及旋转蒸干除去溶剂后，制备得到二价油酸锰，其中，乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的体积比为4：5：9；
(2)在氮气氛围下，将10g二价油酸锰MnOL悬浮在20mL作为浓缩剂的失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitan sesquioleate)中，在141兆帕和4℃条件下，加入磷脂表面活性剂，使其终浓度为0.02g/ml，充分混合，所述的磷脂表面活性剂包括0.1摩尔％甲萘醌二甲嘧啶亚硫酸盐-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPB-PEG-DSPE)、0.1摩尔％的整合素αvβ3拮抗物(美国密苏里州圣路易斯市kereos公司)、1.25摩尔％的钆螯合物Gd-DOTA-PE和98.55摩尔％的磷脂酰胆碱；
(3)混合液在37℃超声浴的条件下反应10h，反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在氮气吹扫下封装，即得表面偶联0.1摩尔％整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺的整合素αvβ3拮抗物、1.25摩尔％的钆螯合物Gd-DOTA-PE以及98.65摩尔％的磷脂酰胆碱的整合素αvβ3靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体。
实施例2整合素αvβ3靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体的制备
(1)将360ml乙醇-水-正己烷混合物加入500ml圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入10g四水氯化锰(MnCl2.4H2O)以及40g油酸钠(TCI chemical)，80℃下反应14小时，随后在25℃反应4小时，经水洗、盐洗、Na2SO4干燥以及旋转蒸干除去溶剂后，制备得到二价油酸锰，其中，乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的体积比为4：5：9。
(2)在氮气氛围下，将10g二价油酸锰MnOL悬浮在20mL作为浓缩剂的聚山梨酯80中，在141兆帕和4℃条件下，加入磷脂表面活性剂，使其终浓度为0.02g/ml，充分混合，所述的磷脂表面活性剂包括1.0摩尔％氨基修饰的整合聚乙二醇2000的磷脂酰乙醇胺、2.0摩尔％的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(Arg-Gly-Asp peptide，RGD)、2.5摩尔％的钆螯合物Gd-DOTA-PE和94.5摩尔％的卵磷脂。
(3)混合液在40℃超声浴的条件下反应0.5h，反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在氮气吹扫下封装，即得表面偶联1.0摩尔％整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽、2.5摩尔％的钆螯合物Gd-DTPA-BOA以及96.5摩尔％的卵磷脂的整合素αvβ3靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，
实施例3锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子在磁共振成像中的应用
1、磁共振成像参数的优化：
为了优化磁共振成像参数，本发明前期制备了不含有靶向αvβ3的特异性生物分子的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子(MnOL-Gd)用于以下研究，MnOL-Gd的制备方法同实施例1和2，但所用的磷脂表面活性剂中不含有马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺以及靶向αvβ3的特异性生物分子。
所有MRI均在飞利浦临床用3.0T磁共振扫描仪上完成，体外实验应用标准鸟笼式线圈。按照本发明的方法制备表面偶联不同浓度及类型钆剂(Gd-DOTA-PE或Gd-DTPA-BOA)的MnOL-Gd NC，如图2(a-b)显示了两种合成方案。Gd-DTPA-BOA通过配对酰基插入脂质膜表面，将钆原子放置在水和粒子界面附近。而Gd-DOTA-PE中的Gd原子则超越粒子表面，进一步伸入到周围介质中。
实验选择和优化了顺磁性脂质螯合物，磷脂膜表面活化剂混合滴定浓度为0，0.6，1.25，2.5，5.0，10.0和30摩尔％的Gd-DOTA-PE或Gd-DTPA-BOA。在MnOL制备程序中，二价MnOL是由四水氯化锰(MnCl2.4H2O)同油酸钠在乙醇-水-正己烷混合物(乙醇、水以及正己烷的体积比为4：5：9)中反应80℃14小时和常温 下4小时制备而成的。MnOL悬浮在作为内在基质的聚山梨酯80或去水山梨糖醇二油酸酯中，在141兆帕和4℃条件下与磷脂表面活性剂充分混合。磷脂表面活性剂内含有上述不同浓度及类型的钆螯合物和不同浓度的磷脂酰胆碱(PC)，钆螯合物和磷脂酰胆碱的摩尔百分数之和为100％(图3a)。同时也制备表面含有相同浓度钆，核心由杏仁油为粒子核心的NC作为对照试剂。
NC弛豫时间测量采用Look-Locker翻转恢复序列(回波时间/重复时间/角度：1.48ms/3000ms/10°；采集矩阵：272像素×270像素；层厚：6mm；信号平均数：4；分辨率：0.4mm×0.4mm)。180°预脉冲后，采集21个梯度回波图像，相位间距53ms；所有的测量均重复3次。横向弛豫时间的测定采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列(涡流自旋回波参数TSE factor：30；回波时间/重复时间/角度：40ms/132ms/90°；采集矩阵：204像素×204像素；层厚：6mm；信号平均数：4；分辨率：0.8mm×0.8mm)。金属离子浓度和NC浓度r1和r2弛豫率均通过线性最小二乘法弛豫率回归线与锰离子、钆粒子浓度或NC浓度对应函数求得。
为进行光学成像，示踪纳米粒子胶体(NC)在组织中的位置，在上述制备得到的纳米粒子表面的磷脂膜上分别整合0.5mol％偶联AlexaFluor 594的己酰基磷脂酰乙醇胺(Life Technologies；Avanti Polar Lipids)，具体方法如下：
将偶联AlexaFluor 594的己酰基磷脂酰乙醇胺溶于DMF中，加入溶于氯仿中的磷脂分子羧基化的上述制备得到MnOL-Gd NC，在氩气气氛下反应5小时，通过TLC板检测反应进行程度，所得溶液加入氯仿溶剂进行减压蒸馏浓缩，获得的粗产物通过凝胶过滤色谱纯化，纯化后的产物真空干燥,得到在粒子表面的磷脂膜上整合0.5mol％AlexaFluor 594的复合NC。
在上述NC中，经电感偶合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，Perkin Elmer,Waltham,MA)测定核心的锰和表面钆浓度。原子力显微镜(Nanotechnology Research Facility,Washington University)测定额定粒子尺寸。Zeta Plus仪(Brookhaven Instrument Corp.,Holtsville,NY)测量粒子ζ电位。
测量结果：
图3e显示MnOL-Gd NC在整合很低浓度Gd-DOTA-PE的情况下即可达到很高的弛豫率。Gd-DTPA-BOA可以达到相似的r1弛豫率，但需要更高的钆螯合剂负荷。整合Gd-DTPA-BOA的NC可以观察到T2*效应，在表面浓度为30mol％也可以观察到。Gd-DOTA-PE NC在5mol％浓度时测量r1也早期的预示了T2*效应引起 的弛豫率的下降。超低表面浓度的Gd-DOTA-PE从0.6至5mol％产生的r1弛豫率相似，均接近峰值。
因此，作为一种典型代表，选用杂化MnOL-(1.25mol％)Gd-DOTA-PENC进行进一步研究，其动态光散射测得流体粒子直径138±10nm，(多分散性指数：0.06)，负性ζ电位(-27±2mV)(图3)。在这种NC中，经电感偶合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测得核心的锰浓度为20.2±0.02mM Mn/ml，相对应为每个NC中约含124,000个锰原子。表面钆负荷为0.36±0.02mM Gd/ml，相对应为每个NC中约含1700个钆原子。原子力显微镜观察NC的无水形态证实锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子为球形。
2、弛豫率的测定
用反转恢复序列(如Look–Locker法：D.C.Look,D.R.Locker,Rev Sci Instrum.1970,41,250-251.)在25℃条件下对样本进行3.0T MR单层扫描，计算系列浓度稀释样本的离子浓度(单位浓度金属离子)和粒子浓度(单位浓度NC)对应的r1弛豫率；同样，用多回波自旋回波法测量r2弛豫率(图4)。离子浓度和NC浓度弛豫率(r1和r2)通过线性最小二乘法测锰和钆离子浓度或NC浓度对应弛豫率的斜率测得。比较r1和r2弛豫率来确定能实现最优化r1和r1/r2比率的最小钆浓度。3.0T磁场25℃条件下MnOL-Gd NC的MR弛豫率，包括锰原子核和钆原子成分对NC弛豫率的各自贡献，均通过相应金属等摩尔浓度和相同NC浓度条件下进行测量。杂化MnOL-Gd NC的MR弛豫率比起不含钆的MnOL、只表面含钆(核心不含锰)以及将MnOL NC和只含Gd不含锰的NC按MnOL-Gd NC内Mn与Gd相应浓度比例混合的这三种NC进行比较。(图4c)。
MnOL NC与表面仅含钆核心不含锰的NC混合样本的粒子浓度弛豫率是607,504±13,578(s·mmol[MnOL+Gd-only NC])-1)，非常接近测得的MnOL NC弛豫率同表面仅含钆核心不含锰的NC的弛豫率二者之和，而杂化MnOL-Gd NC的弛豫率为748,199±30,464(s·mmol[ManOL-Gd NC])-1，较上述两种NC混合后的弛豫率提高25％以上，这表明在杂化MnOL-Gd NC表面偶联的三价钆离子和核心的二价锰离子之间存在着磁性协同作用，而这种协同作用明显的受到钆粒子的位置相对于NC表面距离的影响。将三价钆离子的位置向外伸出、略远离NC表面将在两种顺磁性金属之间产生增强的磁性相互作用，而将三价钆离子的紧贴近NC与周围水分子接触表面时，两种顺磁性金属之间的磁性相互作用明显减弱。MnOL-Gd粒子、MnOL粒子和MnOL与仅含Gd的粒子混合样本的金属离子浓度和NC浓度下的r2 弛豫率相近似。正是基于这个优化实验，我们选择表面带有1.25mole％Gd(Gd-DOTA-PE)的MnOL-Gd NC进行进一步研究。
3、MnOL-Gd NC的补体激活实验
3.1准备抗体敏感的绵羊红细胞(sheep erythrocytes，EA，方法参照2000年Morgan等人的研究)
将5ml阿尔塞弗溶液中的绵羊红细胞(Colorado Serum Company,catalog#31112)清洗三遍，并悬浮在50ml达尔贝科PBS溶液(DPBS；Sigma,St.Louis,MO)中，然后等分在两个离心管中。同时将100μl溶血素(Haemolysin,Cedar Lane Labs,catalog#CL9000)加入50ml DPBS中制备敏感抗体。细胞与抗体分别在37℃孵箱中预先孵育10分钟，然后将25ml敏感抗体分别加入到每管细胞中，轻轻震荡。将细胞-抗体混合物放入孵箱中的摇床上在37℃孵育30分钟，然后将离心细胞在50ml浓度为10mM EDTA缓冲液中洗涤两次，在含有0.1M蔗糖的明胶佛罗那缓冲液(gelatin veronal buffer,GVB2+)中洗涤两次。细胞在含有0.1M蔗糖的40ml GVB2+中悬浮，在4℃条件下储存2周。在正式检测之前，将敏感细胞洗涤2次，用4℃3-4倍体积的GVB2+中悬浮。
3.2补体激活-纳米粒子胶体依赖性C活化/50％补体溶血活性(50％complement hemolytic activity,CH50)分析
用表面偶联0.6、1.25和2.5mol％Gd-DOTA-PE的MnOL-Gd NC进行CH50溶血试验，以检测NC对补体激活的影响。为了定量化NC激活人体补体的能力，我们比较了NC处理过的血清和未处理的对照组血清溶解抗体敏感性绵羊红细胞的能力。最终NC(10％v/v)与加入到含有Mg2+和Ca2+明胶佛罗那缓冲液(GVB2+)中，其内有含量为10％混合人血清(CompTech:Tyler,TX)，总体积为150μl，在37℃条件下孵育30分钟。然后将反应混合物放入4℃冰箱中冷却，用GVB2+溶液稀释至800μl。通过一系列反应绘制滴定曲线，每个反应包含150μl不同比例稀释的上清液，其内加入体积为100μl的5×107抗体敏感的绵羊红细胞(sheep erythrocytes，EA)。反应在37℃孵箱中震荡一小时，再用667μl的GVB2+溶液稀释后进行离心(1000g，5min)。细胞裂解程度通过测量A414来确定。由EA混合水的对照反应测得完全细胞溶解的值。NC处理后血清的残余活性与仅用缓冲液处理的血清的残余补体活性进行比较。Z值是每个细胞裂解位点的平均数。所用公式为Z＝-ln(1-y)，其中y是细胞溶解分数。CH50等于导致50％细胞裂解的血清稀释因子(Z＝0.69)。
3.3活体动物C补体激活-C3a酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。
采用小鼠尾静脉注射PBS溶液(对照组)或按体重注射5μl/gMnOL-Gd NC(实验组)30分钟后采集血浆进行C3a ELISA。进行C3a ELISA的细胞培养板用抗小鼠C3a(4μg/mL)单克隆抗体(BD Pharmingen)覆盖后在4℃冰箱中过夜。用1％牛血清白蛋白封闭后，细胞培养板与样品(100μl新鲜血浆按1:100稀释)在室温下共同孵育2小时，随后加入生物素化的抗小鼠C3a(250ng/ml)单克隆抗体(BD Pharmingen)。将链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(400ng/ml；Sigma)，过氧化物-色原体溶液(R&D Systems)加入每孔中孵育，用色谱仪SpectraMax Plus reader(Molecular Devices,Sunnyvale,Calif)在450nm读数。小鼠重组C3a(BD Pharmingen)用于建立标准曲线。
4、结果
4.1新型杂化金属MnOL-Gd NC的合成、优化及特化
通过多种分析技术方法特化MnOL NC。动态光散射法检测在本实验中应用的MnOL-Gd NC粒子水合半径为138±10nm(多分散性指数(polydispersity indexes,PDI)为0.06)。基于Zeta Plus仪(Brookhaven Instrument Corp.,Holtsville,NY)测量粒子ζ电位，测得的负电势(ζ)值为(-27mV±2mV)证实粒子稳定性和磷脂膜包裹成功。纳米粒子胶体的核心是二价MnOL，浓度是2.93±0.02mM Mn/ml，等同于每个NC含有165718个Mn2+原子，NC的表面是亲脂性Gd-DOTA，浓度是0.11mM Gd/ml，等同于每个纳米粒子胶体含有1372个Gd3+原子，体积百分比是1.25mole％。
能够反映应用1.25mol％Gd螯合物酰胺偶联的MnOL NC后，每个结合位点(即单个NC)实现的信号效果，测量及计算得出MnOL-Gd的金属离子基和NC基弛豫率如下：MnOL-Gd NC r1金属离子基和NC基弛豫率分别为7.8±0.3(秒·毫摩尔[Mn+Gd])-1和955148.3±86971.9(秒·毫摩尔[MnOL-Gd NC])-1；r2金属离子基和NC基弛豫率分别为85.7±1.2秒·毫摩尔[Mn+Gd])-1,4018318.5±320493.4(秒·毫摩尔[MnOL-Gd NC])-1。
4.2人血清中补体激活检测实验：
在体外人血清中用表面整合有0.6、1.25和2.5mole％Gd(Gd-DOTA-PE)的MnOL-Gd NC分别进行50％补体溶血活性(CH50法)补体激活溶血实验[K.Whaley,Methods in complement for clinical immunologists.New York:Churchill Livingstone；1985,77-139]。在该方法中，强补体激活反应造成完整血清补体C3及其他补体成 分的裂解和清除，通过测量血清裂解绵羊抗体敏感性红细胞(erythrocyte-antibody-complement,EA)能力，来判定与纳米材料孵育过的血清中残余补体的活性。本实验合成的ManOL-Gd NC与下述的阴性和阳性对照进行比较，未经过纳米粒子孵育过的正常人血清以及与表面未经过功能修饰的NC共同孵育的血清作为两种阴性对照，表面偶联30mol％Gd-DOTA-PE的αvβ3靶向性全氟化碳纳米粒子胶体(PFC NC)以及表面偶联50％阳离子N-[1-(2,3-二油酰基氧)丙基]-N,N,N-三甲氨甲基硫酸酯NC(简称DOTAP)-磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)的PFC NC作为两种阳性对照。图5A显示，在体外，分别与表面带有0.6、1.25和2.5mole％Gd(Gd-DOTA-PE)的MnOL-Gd NC共同孵育的血清中存留补体的活性与阴性对照组相比没有明显差异(p>0.05)。与之相对照的是，表面携带30mol％Gd-DOTA-PE的PFC NC孵育的血清中补体活性与阴性对照组相比明显降低(p<0.05)，加入50mol％DOTAP‐PE的PFC NC的阳性对照引起的补体激活程度最高(p<0.01)，实际上血清中补体成分已经完全耗竭。
4.3活体小鼠补体激活实验
为了证实和进一步延伸体外实验的结果，(共计33只小鼠，每个实验组≥5只)采用C3a酶联免疫吸附实验进一步验证表面整合有0.6、1.25和2.5mole％Gd(Gd-DOTA-PE)的MnOL-Gd NC诱导补体激活的能力，即致敏性。以往的文献已经证实这种活体动物模型非常适宜检测材料的补体激活特性。按每公斤体重5μl的量分别向各组检测小鼠尾静脉注射MnOL-Gd NCs、αvβ3-靶向性Gd-DOTA-PE(20mol％)PFC NC或者50％DOTAP-PE PFC NC。这些临床前动物注射剂量是临床患者常规注射剂量(1ul/kg)的5倍以上。注射对比剂30分钟后处死动物，通过测量补体C3a的产生来判断补体激活情况(见图5B)。Pham C等已经报道了20mol％Gd-DOTA-PE PFC NC和50％DOTAP-PE PFC NC可以在小鼠体内引起强烈的补体激活，而本研究中接受表面各种低浓度钆螯合剂(0.6、1.25和2.5mole％Gd-DOTA-PE)偶联的MnOL-Gd NCs注射的小鼠引起的补体激活反应与阳性对照组相比都是可以忽略的。与阴性对照组小鼠相比，注射0.6mol％Gd-DOTA-PEMnOL-Gd NCs组小鼠没有增加C3的裂解，而1.25和2.5mol％Gd-DOTA-PEMnOL-Gd NCs组小鼠出现的C3激活出现轻度增加，虽然这种与阴性对照组的差别是有统计学意义的，该结果也说明了这种活体检查方法的敏感性和准确性。
综合上述体外人血清实验和活体小鼠实验结果，均表明表面偶联低浓度Gd-DOTA-PE以增强MnOL NC弛豫率的方法对补体激活的影响与阴性对照组相比是轻微的，可以忽略不计的，与阳性对照组相比，补体激活的强度明显减低。
实施例4整合素αvβ3靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体在新生血管成像中的应用
1、方法
在选择用于活体成像的纳米粒子(1.25mol％Gd-DOTA-NH2-PE MnOL-Gd NC)的磷脂膜表面偶联浓度为0.5mol％AlexaFluor 594标记的己酰基-磷脂酰乙醇胺(Life Technologies；Avanti Polar Lipids)，用于组织荧光显微镜成像。电感耦合等离子体光学发射光谱法(ICP OES,Perkin Elmer)证实Mn和Gd的浓度。
为实现靶向性，粒子表面偶联0.1摩尔％整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺的整合素αvβ3拮抗物(美国密苏里州圣路易斯市kereos公司)和98.65摩尔％的磷脂酰胆碱(PC)，通过实施例1方法制备，0.1mole％喹诺酮衍生的整合素αvβ3多肽类似物拮抗物通过聚乙二醇2000偶联到磷脂酰乙醇胺上，见图6。
新生血管靶向配体选用由勃列斯多·迈耶·施贵宝医学成像公司开发的αvβ3-整合素喹诺酮非肽类拮抗配体(美国专利号6,511,648和相关专利)，最初的研究曾经报道过应用铟111(111In)-DOTA共轭RP476和靛青染料Cy5.5类似物TA145。每个靶向纳米粒子上约含有300个αvβ3-整合素拮抗配体，半抑制浓度(IC50)为50皮摩尔(Kereos,Inc.,St.Louis,MO,USA)。以往的研究，利用在血管内全氟化碳纳米粒子通过活体竞争性抑制临床前动物实验、风湿性关节炎模型及应用基质胶(MatrigelTM)嵌入物的Rag1tm1Mom Tg(TIE-2-lacZ)182-Sato转基因鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)中，均研究了这种配体的靶向特异性。以往的研究也报道了具有这种配体和表面化学结构的111In-αvβ3-整合素靶向性纳米粒子的药代动力学和生物学分布研究结果。
1.1、高脂饮食饲养新西兰大白兔实验：
作为可用杂化αvβ3-MnOL-Gd NC成像新生血管生成的活体概念佐证，采用0.25％胆固醇含量的高脂饮食饲养12个月的雄性新西兰大白兔动脉(Charles River Laboratories)粥样硬化模型中进行斑块新生血管生成的MR分子成像：其中高脂饮食兔模型16只，分成两组，每组8只，分别通过耳缘静脉注射整合素αvβ3靶向性超低浓度(1.25mol％)钆剂偶联油酸锰纳米粒子胶体(αvβ3-integrin–targeted-MnOL-Gd -hybrid nanocolloids,αvβ3-MnOL-Gd-NC)和整合素αvβ3非靶向性超低浓度(1.25mol％)钆剂偶联油酸锰纳米粒子胶体(nontargeted(NT)-MnOL-Gd NC)；同月龄正常饮食对照组兔模型8只，通过耳缘静脉注射αvβ3-MnOL-Gd-NC。
兔经注射基础麻醉药后，用2％异氟醚进行维持麻醉。兔胸主动脉斑块新生血管生成的MR分子成像；各组模型在注射对比剂之前及之后30、60、90和120分钟用3.0T磁共振(magnetic resonance，MR)采用脂肪抑制、黑血、涡旋自旋回声T1w序列连续成像2小时。扫描参数如下：涡旋回波系数＝30,重复时间/回波时间＝380/11ms,分辨率＝250μm×250μm×4mm,20层,信号平均数(NSA)＝14,扫描时间约为15.6min。每只动物的扫描范围都是从左锁骨下动脉到膈肌水平的胸主动脉，共20层图像。流入的血液信号通过放置在成像采集带上部和下部的预饱和带屏蔽掉。通过频率选择衰减翻转恢复技术实现脂肪抑制。MR成像后，兔模型经安乐死后，切除主要脏器、主动脉及周围的外膜进行显微镜分析。
MR图像处理：采用半自动分段程序处理及平均化所有图像中胸主动脉的MRI增强信号。简要的说，采用基于MATLAB(The MathWorks,Inc.,MA)软件的种子区域生长算法，在每一幅2D图像中定义主动脉管腔。主动脉壁是由管腔阴影扩张之后通过自动阈值以获取覆盖整个主动脉壁的一致和客观的感兴趣区域(ROI)。当经MATLAB算法定义的ROI超出主动脉壁范围时，通过手动连接ROI，以修正范围。通常，每只兔采集图像组两端要舍弃2-4幅图像，主要是由于脂肪抑制不均，或由于线圈位置造成图像信号衰减。
每层图像的信号强度与放在图像视野内的体外参照物(离心管中密闭的浓度为25mol/l钆喷酸葡胺盐水溶液)相比较后进行标准化处理。注射对比剂2小时后的信号强度和基线信号均与肌肉信号强度相除后进行标准化处理。增强像素的阈值等于基线主动脉壁信号的平均值加2倍的标准差。计算每层图像增强像素占ROI总像素的百分比面积，并将最终选定的每只动物所扫描主动脉的图像百分比进行平均化。连续增强像素组在平面内或连续平面之间定义为簇。对比强化系数定义为各簇强化像素数乘以该簇内平均强化百分比。将全胸降主动脉对比强化系数相加，作为每只动物模型的胸降主动脉强化值进行分析。凡是没有组织病理学结果证实斑块存在的高脂饮食兔都排除出成像数据统计分析。最终纳入成像数据分析的各组动物数分别为：高脂饮食靶向组7只；高脂饮食非靶向组6只；正常饮食靶向组8只。(图像定量方法可参见文献：Winter PM,Neubauer AM et al.(2006)."Endothelial alpha(v)beta3integrin-targeted fumagillin nanoparticles inhibit angiogenesis in atherosclerosis”.Arterioscler Thromb Vasc Biol 26(9):2103-2109.)
1.2统计分析
数据统计采用统计分析系统(Statistical Analysis System，SAS,Cary,NC)进行方差分析和一般线性模型分析。三组差别p<0.05认为有统计学意义。定量数据以均数±标准差形式表示。
1.3通过电感偶合等离子体发射光谱仪体(Inductive Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer，ICP-OES)外定量分析αvβ3-Gd-MnOL-NC的生物分布
在24只参与实验的兔模型中随机抽取9只动物(每组3只)，经过量麻醉进行安乐死，切取并称重主要脏器：肝脏、脾脏、肾脏、肺、心脏、粪便、胆汁、尿液和血液；加热，并经过1:1:1H2O/HF/HNO3混合物进行消化，通过ICP-OES检测各组织中Mn2+和Gd3+浓度，单位用纳克金属/每克组织。
1.4组织病理和免疫组织化学
MR成像后，切取对应与MR成像范围的20cm胸主动脉，等分为5mm每段，在最适切割温度(Optimal Cutting Temperature,OCT)复合物(Sakura Finetek)中包埋，进行冰冻切片，每层8um，来评价双模式纳米粒子(即偶联荧光染料的整合素αvβ3靶向性1.25mol％钆剂偶联油酸锰纳米粒子胶体)的分布情况。临近层面切片分别进行苏木素-伊红(hematoxylin/eosin,HE)染色用于病理形态学检测；用LM609(Chemicon,Temecula,CA)抗体对经丙酮固定的切片进行整合素αvβ3免疫组织化学染色，这里需要考虑到注射αvβ3靶向性MnOL-Gd NC的动物血管壁整合素染色会与纳米粒子出现竞争性抑制，可能会影响到免疫组织化学染色的准确性。血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet-endothelial cell adhesion molecule，PECAM)染色采用常规内皮细胞标记物(Clone JC70A,Dako,Carpinteria,CA)。用ABC Elite试剂盒和VIP底物试剂盒(Vector Laboratories,Burlingame,CA)进行染色，并用甲基绿进行对比染色。切片均用Olympus BX61显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)进行成像，用Olympus数字图像软件进行处理。
2、结果
2.1高脂饮食饲养兔模型新生血管生成活体分子成像
作为活体概念验证，在高脂饮食饲养12个月的雄性新西兰大白兔动脉粥样硬化模型中评估αvβ3-MnOL-Gd-NC检测和定量新生血管生成的效率。其中高脂肪饮食(饲料脂肪含量达0.25％)雄性新西兰大白兔模型16只，分成两组，每组8只， 分别通过耳缘静脉按1ml/kg注射整合素αvβ3靶向性超低浓度(1.25mol％)钆剂偶联油酸锰纳米粒子胶体(αvβ3-integrin–targeted MnOL-Gd-hybrid nanocolloids,αvβ3-MnOL-Gd-NC)和整合素αvβ3非靶向性超低浓度(1.25mol％)钆剂偶联油酸锰纳米粒子胶体(nontargeted(NT)-MnOL-Gd NC)。正常饲料饲养12个月的对照组兔模型8只，通过耳缘静脉注射αvβ3-MnOL-Gd-NC。
兔胸主动脉斑块新生血管生成的MR分子成像；各组模型在在注射对比剂之前及之后30、60、90和120分钟用3.0T磁共振(magnetic resonance，MR)采用脂肪抑制、黑血、涡旋自旋回声T1w序列连续成像2小时。每只动物的扫描范围都是从左锁骨下动脉到膈肌水平的胸主动脉，共20层图像。采用以前报道过的特制的半自动分段程序处理及平均化所有图像中胸主动脉的MRI增强信号。凡是没有组织病理学结果证实斑块存在的高脂饮食兔都排除出统计分析组，最终三组实验动物的数量分别为：高脂饮食靶向组7只；高脂饮食非靶向组6只；正常饮食靶向组8只。
图7A-E显示典型的高脂饮食饲养兔在注射αvβ3-MnOL-Gd NC之前和注射后2小时后胸主动脉血管壁对比剂信号渐进性强化。主动脉管腔内对比信号在基线和随后的时间点都可以忽略不计，表明血管壁信号的改变不会受到循环血池中粒子的干扰。主动脉壁新生血管T1w对比强化表现为一种异质性方式，注射后2小时内信号强度及空间分布维度都呈渐进性增加。图7F显示在120分钟时间段内该层面横截段所有像素平均信号增强程度随时间呈单指数增加，与胸主动脉T1w信号增强映像图相一致。
在注射αvβ3-MnOL-Gd NC的高脂饮食动物组中，各层面整体平均新生血管整体面积百分比(1.8±0.6％)较高脂饮食非靶向组(0.1±0.1％)和正常饮食对照靶向组(0.2±0.1％)相比明显增高(图8，p<0.05)。进一步评估动脉壁内半部新生血管区(即斑块区)和外半部(即基质和外膜)区信号增强程度，注射αvβ3-MnOL-Gd NC的高脂饮食动物组胸主动脉壁外半部新生血管强化程度(0.5±0.2％)较高脂饮食非靶向组(0.0±0.0％)和正常饮食对照靶向组(0.0±0.0％)相比轻度增高(图8，p<0.05)。而胸主动脉壁内半部新生血管强化程度(4.3±1.9％)较高脂饮食非靶向组(0.6±0.6％)和正常饮食对照靶向组(0.0±0.0％)相比明显增高了7倍以上(图8，p<0.05)。
新生血管生成指数是信号增强的像素数与所占主动脉壁的百分比的乘积，使用新生血管生成指数作为评价指标比较实验室的三组动物，数据显示注射αvβ3-MnOL-Gd NC的高脂饮食动物组胸主动脉壁新生血管强化指数(4950±2172)较高脂饮食非靶向组(297±297)和正常饮食对照靶向组(396±138)相比明显增高(图 9，p<0.05)。主要的强化新生血管生成指数出现在动脉壁内部(αvβ3-MnOL-Gd NC/高脂饮食组:4248±2172；p<0.05；NT-MnOL-Gd NC/高脂饮食组:169±169；αvβ3-MnOL-Gd NC/正常饮食组:276±123，p<0.05)。动脉壁外部的新生血管生成指数与内壁相比更低，分布方式与内壁相似，但差别没有统计学意义(αvβ3-MnOL-Gd NC/高脂饮食组:527±296；p<0.05；NT-MnOL-Gd NC/高脂饮食组:128±128；αvβ3-MnOL-Gd NC/正常饮食组:93±68)。高脂饮食非靶向组和正常饮食对照靶向组的血管内外部的新生血管生成指数相似。
2.2组织病理学
光学显微镜显示高脂饮食饲养的兔降主动脉血管内膜中度增厚，血管滋养管扩张；而在图9显示正常饮食饲养的对照组兔血管未见内膜增厚及血管滋养管扩张的情况。高脂饮食饲养兔的动脉外膜疏松，扩张微血管有明显的血小板-内皮细胞粘附分子染色，正如以往Winter报道过的这些血管中仅有一部分呈αvβ3-染色阳性。对照组兔动脉内膜不厚、基层结构正常、外膜仅见稀疏的血管滋养管。荧光显微镜成像显示αvβ3-MnOL-Gd NC上标记的AlexaFluor 594红色荧光染料于兔主动脉壁的外膜通过基层分布于斑块内，而NT-MnOL-Gd的AlexaFluor 594红色荧光染料在基质和斑块内累积量不明显(见图9)。注射标记AlexaFluor 594的αvβ3-MnOL-Gd NCs的正常饮食饲养的兔模型动脉壁外膜仅见非常稀疏的荧光信号。在所有高脂饮食饲养兔的组别的主动脉样本中均可见一些AlexaFluor 594标记的MnOL-Gd纳米粒子的表面荧光降解物呈涂片样浑浊梯度到达内弹性膜，荧光成像结果与MR对比结果相一致。
2.3通过电感偶合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)方法体外定量分析αvβ3-MnOL-Gd-NC的生物分布
为了定量测量αvβ3-MnOL-Gd-NC的生物分布与清除，我们采用了电感偶合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)方法来定量测定每个器官中Mn2+和Gd3+的含量。如图10所示，注射MnOL-Gd 6小时后各种组织内Mn2+和Gd3+的含量。其中粪便中含【Mn2+】达78.63±2.28ng/mg(组织)，远比肝肾浓度含量高(分别为7.03±0.68ng/mg和5.15±1.01ng/mg)。
综上所述，本发明报道了一种新型的表面整合超低浓度钆的软性油酸锰纳米粒子胶体结构，可实现高r1弛豫率，从而可有效用于快速活体T1w MR成像血管内皮细胞表达的整合素αvβ3。钆剂增强r1弛豫率有效性依赖于所用脂质螯合剂的化学结 构，以及金属相对于纳米粒子表面积周围液性环境的相对位置。将浓度仅为1.25mol％的Gd-DOTA-PE偶联到MnOL纳米粒子表面就可以达到远超过预期的r1弛豫率，表明MnOL NC和Gd-DOTA产生的磁场之间存在协同作用。在活体动物实验中，这种改进的MR分子成像对比剂可用于在高脂饮食饲养兔动脉粥样硬化模型中检测斑块新生血管生成，信号强化主要出现在兔主动脉血管内部(即斑块区)，可以通过三维映射图像直观显示新生血管的空间分布。αvβ3-MnOL-Gd NC实现活体T1w对比时使用的钆剂浓度较临床血管成像批准的浓度减少300倍。除了通过更低的钆剂浓度减少NSF的安全顾虑，在细胞学实验和活体动物实验中也证实本发明的一种新型纳米粒子胶体实质上消除了补体激活副作用的发生。结合体外细胞学实验r1高弛豫率、活体对比成像有效性和改善生物安全性表明αvβ3-MnOL-Gd NC可以作为有效分子对比剂用于定量临床新生血管生成，特别对于有中风风险的中度颈动脉斑块患者。
Claims (10)
1.一种整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的纳米粒子胶体中含有复数个整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子，所述整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子由内核层和外壳层组成，其中内核层包括油酸锰分子以及作为悬浮介质的浓缩剂，外核层包括整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺的靶向αvβ3的特异性生物分子、钆螯合物以及磷脂类化合物。
2.如权利要求1所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的浓缩剂为聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或红花油中的一种或几种的组合，优选的，所述的聚山梨酯为聚山梨酯80。
3.如权利要求1所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的磷脂类化合物为磷脂酰胆碱、卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)或胆固醇。
4.如权利要求1所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的钆螯合物为钆-二乙撑三胺五乙酸油酸双酯(Gd-DTPA-BOA)或钆-轮环藤宁四乙酸四乙酸磷脂酰乙醇胺(Gd-DOTA-PE)。
5.如权利要求1所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的靶向αvβ3的特异性生物分子包括整合素αvβ3拮抗物、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(Arg-Gly-Asp peptide，RGD)或靶向整合素αvβ3的受体单抗。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在氮气氛围下，将二价油酸锰MnOL悬浮在浓缩剂中，在100-300兆帕和0-25℃条件下加入磷脂表面活性剂，充分混合，所述的磷脂表面活性剂包括磷脂类化合物，钆螯合物，马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000的磷脂酰乙醇胺、以及靶向αvβ3的特异性生物分子；所述的马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000的磷脂酰乙醇胺与靶向αvβ3的特异性生物分子的摩尔比为1∶0.1～1∶10；
(2)混合液在25℃～55℃超声浴的条件下反应0.5h～24h，反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在氮气吹扫下封装，即得。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000的磷脂酰乙醇胺与靶向αvβ3的特异性生物分子的摩尔比为1∶1或1：2。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的磷脂表面活性剂包括0.02～5摩尔％马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺、0.002～50摩尔％的靶向αvβ3的特异性生物分子、0.1-50摩尔％的钆螯合物和0.1-99.8摩尔％的磷脂类化合物，所加入的磷脂表面活性剂的终浓度为0.015-0.025g/ml，更优选的，所述的磷脂表面活性剂包括0.1摩尔％马来基、氨基、巯基或羧基修饰的整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺、0.1摩尔％的整合素αvβ3拮抗物、1.25摩尔％的钆螯合物和98.55摩尔％的磷脂酰胆碱，所加入的磷脂表面活性剂的终浓度为0.02g/ml。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于混合液在37℃～40℃超声浴的条件下反应0.5h～24h。
10.权利要求1-5任一项所述的整合素靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体在制备新生血管生成的磁共振成像对比剂中的应用。
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