CN104117093A - 一种具有生物涂层的口腔种植体及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有生物涂层的口腔种植体及其制作方法。本发明所述的口腔种植体采用仿生钙磷涂层的方法将能促进成骨的和抗感染的药物加载到钛合金表面，并利用药代动力学将其逐渐缓释到周围溶液（组织液）中，达到促进早期成骨且预防感染的效果，从而实现种植体的早期骨整合，缩短患者缺牙时间，尽早完成牙齿修复，具有制备过程简便、经济、能达到显著好于现在市面上广泛流行的种植体的成骨效果的优点。

Description

一种具有生物涂层的口腔种植体及其制作方法

技术领域

 本发明涉及一种具有生物涂层的口腔种植体及其制作方法。具体地，本发明涉及一种具有包含能够促进成骨的药物（例如辛伐他汀）和能抗感染的药物（例如甲硝唑）的生物涂层的口腔种植体及其制作方法。

背景技术

口腔种植手术中所使用的钛合金种植体具有机械强度高、生物相容性好等特点，但该金属惰性强，植入早期不易与周围组织发生骨整合，易发生植入早期感染导致种植体周围炎使种植体松动——种植手术失败！

近年来研究者多采用对钛合金种植体进行表面改性的方法来解决这一问题。

为促进早期成骨，常采用钛表面微图案、二氧化钛纳米管、聚合物分子接枝技术、离子喷涂或采用加载生长因等方法。但这些方法的制备工艺复杂、周期长、性价比低，并且现有技术难以控制生长因子的缓释情况，存在生物安全隐患。

为预防感染，国外研究者多采用万古霉素，但万古霉素属于三线抗生素，，适应症窄且存在导致耐药性的潜在危险。

发明内容

鉴于上述内容，本发明所要解决的技术问题是提供一种制备过程简便、成本低廉、具有能明显提高早期成骨效果和抗感染效果的口腔种植体及其制作方法。

在本发明的一个方面中，提供一种具有生物涂层的口腔种植体，所述口腔种植体包括：基体；和涂覆在所述基体上的生物涂层，其中所述生物涂层包含能够促进成骨的药物和能够抗感染的药物。

在一个实施方案中，所述基体为TA1钛片。

在一个实施方案中，所述生物涂层可以为钙磷涂层。

在一个实施方案中，所述能够促进成骨的药物可以为辛伐他汀，其可以以特定的浓度缓释到周围溶液中。

在一个实施方案中，所述能够抗感染的药物可以为甲硝唑，其可以以特定的浓度缓释到周围溶液中。

在一个实施方案中，优选地，所述辛伐他汀的最终缓释到周围溶液中的浓度为10^-5M数量级的浓度。在另一实施方案中，优选地，所述甲硝唑的最终缓释到周围溶液中的浓度为10^-2M数量级的浓度。

在本发明的另一方面中，提供了一种制作具有生物涂层的口腔种植体的方法，所述口腔种植体包括基体；和涂覆在所述基体上的生物涂层，其中所述生物涂层包含能够促进成骨的药物和能够抗感染的药物，所述方法包括如下步骤：

提供基体；

对所述基体进行抛光、喷砂以及酸蚀处理，然后进行清洁；

将能够促进成骨和能够抗感染的药物以溶液形式沉积到所述基体上；以及

对所述基体进行冻干以获得具有仿生钙磷涂层的口腔种植体。

在一个实施方案中，所述基体为可以为TA1钛片。

在一个实施方案中，生物涂层可以为仿生钙磷涂层。

在一个实施方案中，所述能够促进成骨的药物可以为辛伐他汀，其可以以特定的浓度缓释到周围溶液中。

在一个实施方案中，所述能够抗感染的药物可以为甲硝唑，其可以以特定的浓度缓释到周围溶液中。

在一个实施方案中，优选地，所述辛伐他汀的最终缓释到周围溶液中的浓度为10^-5M数量级的浓度。在另一个实施方案中，优选地，所述甲硝唑的最终缓释到周围溶液中的浓度为10^-2M数量级的浓度。

通过上述种植体及其制造方法，本发明获得了如下有益效果：采用生物涂层的方法将能够促进成骨和能够抗感染的药物加载到经过处理的钛合金表面，并利用药代动力学将其逐渐缓释到周围溶液（组织液）中，达到促进早期成骨且预防感染的效果，从而实现种植体的早期骨整合，缩短患者缺牙时间，尽早完成牙齿修复，具有制备过程简便、经济，能达到显著好于现在市面上广泛流行的种植体的成骨效果的优点。

附图说明

以下将结合附图对本发明进行详细描述。根据这些描述，本发明的目的、特征和优点将变得明显，也将易于被本领域的普通技术人员理解和实施。

附图中的标记分别代表如下含义：

SLA：喷砂酸蚀

Ca-P:仿生钙磷涂层 

MNZ：甲硝唑 

SIM：辛伐他汀

图1为实验实施例1制备的种植体中甲硝唑和辛伐他汀的缓释曲线，其中A为甲硝唑7天缓释曲线；B为辛伐他汀14天缓释曲线；

图2为显示钙磷涂层+甲硝唑+辛伐他汀的钛片和钙磷涂层+甲硝唑的钛片抑制牙龈卟啉单胞菌的效果图，其中A为仅含钙磷涂层的钛片；B为钙磷涂层+甲硝唑钛片；C为钙磷涂层+辛伐他汀钛片；D为钙磷涂层+甲硝唑+辛伐他汀钛片；

图3为在实施例3中人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs）和人脂肪来源间充质干细胞（hASCs）生长曲线，其中A为hBMMSCs增殖曲线；B为hASCs增殖曲线；

图4为在实施例3中的hBMMSCs ALP定量检测结果和hASCs定量检测结果的比较，其中A为hBMMSCs ALP定量检测结果；B为hASCs定量检测结果；*代表与SLA组相比有统计学差异；△代表与Ca-P/Ca-P+MNZ组相比有统计学差异；

图5为在实施例3中对于人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs）和人脂肪来源间充质干细胞（hASCs）实验组各组与对照组SLA之间的统计学差异图，其中*代表与SLA组相比有统计学差异；△代表与Ca-P/Ca-P+MNZ组相比有统计学差异；以及

图6为进行成骨诱导7和14天时hBMMSCs和hASCs成骨相关基因表达结果以及与SLA组以及Ca-P/Ca-P+MNZ组的统计学差异图，其中A为成骨诱导7天时hBMMSCs成骨相关基因表达结果；B为成骨诱导7天时hASCs成骨相关基因表达结果；C为成骨诱导14天时hBMMSCs成骨相关基因表达结果；D为成骨诱导14天时hASCs成骨相关基因表达结果；*代表与SLA组相比有统计学差异；以及△代表与Ca-P/Ca-P+MNZ组相比有统计学差异。

具体实施方式

以下实施例仅用于对本发明的技术构思进行举例说明，使本领域的普通技术人员能够更好地理解和实施本发明，但是本发明的范围不限于以下描述的各个实施方案或具体的实施例。

本发明旨在提供一种制备过程简便、成本低廉、具有能明显提高早期成骨效果和抗感染效果的口腔种植体及其制作方法。

具体而言，本发明提供了一种具有生物涂层的口腔种植体，所述口腔种植体包括：基体；和涂覆在所述基体上的生物涂层，其中所述生物涂层包含能够促进成骨的药物和能抗感染的药物。

所述基体可以为TA1钛片，所述生物涂层可以为仿生钙磷涂层。所述能够促进成骨的药物可以为辛伐他汀。所述能够抗感染的药物可以为甲硝唑。

另外，本发明还提供制作口腔种植体的方法，所述口腔种植体包括基体；和涂覆在所述基体上的生物涂层，其中所述生物涂层包含能够促进成骨的药物和/或能抗感染的药物，所述方法包括如下步骤：提供基体；对所述基体进行喷砂、酸蚀和清洁处理；将能够促进成骨和能够抗感染的药物以溶液形式沉积到所述钛片或钛合金片上；以及对所述钛片进行冻干以获得具有促成骨和抗感染效果的生物涂层的口腔种植体。

通过利用梯度溶液沉积法将两种药物即辛伐他汀和甲硝唑共同加载到处理过的TA1钛片上并使其同时发挥作用，带来了出乎意料的技术效果，即这种仿生钙磷涂层可以同时发挥促成骨和抗菌的作用，这种共同的作用是目前的现有技术中所没有实现的。另外，这些出乎意料的技术效果在以下实施例以及说明书附图中明确地体现出来。

以下将对本发明的实施例进行描述，以便于本领域的普通技术人员理解和实施本发明。应当理解，给出这些实施例的目的仅仅是为了举例说明本发明的原理，而不应理解为本发明仅限于这些实施例。

制备实施例

所述具有生物涂层的口腔种植体的制作过程如下：

1）将国标为TA1的纯钛片在P240—P400—P600目的砂纸上依次打磨抛光后，在0.6MPa的压力下每片均匀喷砂30秒后清洗；

2）把清洗后的钛片放入体积比为浓硫酸：浓盐酸=1：1的酸蚀液中反应30分钟后取出，分别用丙酮—75%乙醇—蒸馏水超声清洗15分钟，硅胶颗粒干燥，获得SLA钛片；

3）在250mlddH₂O中依次加入一定量的NaCl、Na₂HPO₄·12H₂O、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂·2H₂O，边通CO₂边加入NaHCO₃达澄清状态，获得 5×SBF；

4）将已经过SLA处理的钛片分别置于盛有5×SBF溶液的50ml离心管中，在37℃，60rpm的摇床中过夜24h后取出，干燥待用；

5）在200mlddH₂O中加入6.25ml 1mol/L HCl，分别加入一定量的Na₂HPO₄·12H₂O，CaCl₂·2H₂O，NaCl，定容至250ml，在pH计监测下，用Tris粉剂调节至pH=7.4；

6）在200mlddH₂O中加入6.25ml 1mol/L HCl及0.428g甲硝唑粉剂，分别加入一定量的Na₂HPO₄·12H₂O，CaCl₂·2H₂O，NaCl，定容至250ml，在pH计监测下，用Tris粉剂调节至pH=7.4；

7）4.5mg SIM+1.8ml 95%乙醇+2.7ml 0.1mol/L NaOH，70℃ 水浴 2h，用0.1mol/L HCl 调节pH=7.0，定容至10ml得10^-3mol/L SIM浓缩液；

8）1ml SIM浓缩液+99ml Ca-P得到10^-5 mol/LCa-P+SIM；

9）在200mlddH₂O中加入6.25ml 1mol/L HCl及0.428g甲硝唑粉剂，分别加入一定量的Na₂HPO₄·12H₂O,CaCl₂·2H₂O，NaCl，定容至250ml，在pH计监测下，用Tris粉剂调节至pH=7.4；

10）将已经过5×SBF处理的钛片分别置于盛有Ca-P溶液/ Ca-P+SIM溶液/ Ca-P+MNZ溶液 / Ca-P+MNZ+SIM溶液的50ml离心管中，在37℃，60rpm摇床中过夜（24h）后取出，干燥，冻干机内冻干24h后取出。

采用扫描电镜（SEM）和能量衍射X线（EDAX）观察分析涂层的表面形貌，晶体结构和化学组成。

效果实施例1：

1)将制备好的含甲硝唑钙磷涂层的钛片（实验组：2个钛片）和仅有钙磷涂层的钛片（对照组：2个钛片）分别置于2mlEP管内，每管预先加入1mlMili-Q水，37℃、60rpm/min摇床中振荡。

从1d到7d每隔24h取出钛片，放入新的1mlMili-Q水中，同等条件下摇床中振荡，同时将旧的Mili-Q水溶液收集储存。

将收集到的各个时间点样品（Mili-Q水溶液）在4℃、10000rpm/min条件下离心10min。弃上清，向沉淀中分别加入1mL无水乙醇，60℃水浴加热1h使沉淀完全溶解。每个EP管内吸取200μl样品液于96孔板中（每管2个复孔），313nm波长下测OD值，并按照标准曲线计算各自浓度值。

 2) 将制备好的含SIM钙磷涂层的钛片（实验组：2个钛片）和仅有钙磷涂层的钛片（对照组：2个钛片）分别置于2mlEP管内，每管预先加入1ml Mili-Q水，37℃、60rpm/min摇床中振荡。

从1d到14d每隔24h取出钛片，放入新的1ml Mili-Q水中，同等条件下摇床中振荡，同时将旧的溶液收集储存。

将收集到的各个时间点样品（Mili-Q水溶液）在25℃、8000rpm/min条件下离心5min。弃上清，向沉淀中分别加入1mL无水乙醇，60℃水浴加热1h使沉淀完全溶解。每个EP管内吸取200μl样品液于96孔板中（每管2个复孔），238nm波长下测OD值，并按照标准曲线计算各自浓度值，结果示于下表以及图1中。

表1.辛伐他汀和甲硝唑的缓释结果

	辛伐他汀10-5mol/L	甲硝唑10-2mol/L
			缓释时间点	缓释浓度（μg/ml）	缓释浓度（μg/ml）
1d	0.0386	1.512
			2d	0.0214	0.793
3d	0.0159	0.643
			4d	0.0142	0.515
5d	0.0131	0.312
			6d	0.0113	0.193
7d	0.00913	0.096
			8d	0.00622	\
9d	0.00415	\
			10d	0.00301	\
11d	0.00217	\
			12d	0.00118	\
13d	0.00105	\
			14d	0.001	\

由表1及附图1可以清楚地看出，当辛伐他汀在10^-5mol/L、甲硝唑在10^-2mol/L的浓度时，可以以相对恒定的速率在缓释溶液中可控的释放，而没有短时间内大规模的爆发性释放。

效果实施例2：

选用种植体相关感染的常见治病菌，牙龈卟啉单胞菌（Pg）为指示菌，采用Stigter M等报道的抑菌试验方法，测定不同时间点涂层样品的抑菌圈大小。其结果示于图2中。

培养基：PG琼脂培养基溶于去离子水，高温灭菌后冷却至50℃，取20ml倾倒于直径为10cm的培养皿中，冷却至凝固。菌液的制备：试验前，取经PCR鉴定的Pg106株接种于BHI-S血平板-放人厌氧培养箱．混合气(80％N₂，10%CO₂，10％H₂)。37℃培养48h，经革兰氏染色镜检鉴定后作次代堵养的纯培养物纳入实验．用生理盐水制成菌悬液，用分光光度滴定法将细菌浓度调至1.5 x 108cfu/ml。然后取0.5ml菌悬液，均匀摊布于上述PG琼脂培养基，制成试验用平板。随机选取样品，以环氧乙烷消毒，置入上述含牙龈卟啉单胞菌（Pg）的Pg琼脂平板(中心放置，涂层面对培养基)，于37℃温箱培养24h，取出，观察抑菌效果，并用游标卡尺测量抑菌圈大小。然后更换新的含有同样菌浓度的Pg琼脂平板，继续培养。以后每隔48h，取出，测量抑菌圈并更换新平板。选取未涂层的纯钛圆盘作为空白对照。

从图2中可以清楚地看出，与对照组相比，钙磷涂层+甲硝唑+辛伐他汀的钛片和钙磷涂层+甲硝唑的钛片一样，能够显著抑制牙龈卟啉单胞菌的生长（Pg），形成抑菌环。

效果实施例3：

在实施例3中，利用根据实施例1制备的种植体对人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs）和人脂肪来源间充质干细胞（hASCs）生长的影响进行了实验。其结果示于图2中。

如图2中可清楚看到，加载甲硝唑、辛伐他汀的钙磷涂层并不影响人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs）和人脂肪来源间充质干细胞（hASCs）的增殖。

进一步地，利用根据实施例1制备的种植体对人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs）和人脂肪来源间充质干细胞（hASCs）进行了成骨诱导实验，其定量检测结果示于图3中。

对于人骨髓间充质干细胞（hBMMSCs），成骨诱导14天时，对照组（SLA）及实验各组均有明显矿化结节产生，矿化结节数量关系为：喷砂酸蚀组（SLA）＜钙磷涂层组（Ca-P）＜钙磷涂层缓释甲硝唑组（Ca-P+MNZ）＜钙磷涂层缓释辛伐他汀组（Ca-P+SIM）＜钙磷涂层缓释甲硝唑及辛伐他汀组（Ca-P+MNZ+SIM）。另外，含有辛伐他汀涂层的钛片上产生的钙化结节颗粒较大。

对于人脂肪来源间充质干细胞（hASCs），成骨诱导14天时，对照组及实验各组均有明显矿化结节产生，各组矿化结节数量关系同hBMMSCs，但矿化结节数量较人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs）少。

另外，对于人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs），实验组各组与对照组SLA均有统计学差异，其中含有辛伐他汀的实验组与其余三组有统计学差异，如图4所示的。

对于人脂肪来源间充质干细胞（hASCs），实验组各组与对照组SLA均有统计学差异，其中含有辛伐他汀的实验组与其余三组有统计学差异，如图4所示的。

进一步地，在利用根据实施例1制备的种植体进行成骨诱导实验时，获得了良好的结果，如在图5中示出的。具体而言，在成骨诱导7天时，对于人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs），Runx-2和OSX的表达在含辛伐他汀的实验组与其余三组间有统计学差异；OC的表达在对照组和各实验组间有统计学差异，含辛伐他汀的实验组与其余三组间有统计学差异。对于人脂肪来源间充质细胞（hASCs），Runx-2的表达在含辛伐他汀的实验组与其余三组间有统计学差异；OSX的表达在含辛伐他汀的实验组与对照组有统计学差异；OC的表达在各组间均无统计学差异。

成骨诱导14天时，对于人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs），Runx-2、OSX、OC的表达在含辛伐他汀的实验组与其余三组间存在统计学差异。对于人脂肪来源间充质干细胞（hASCs），Runx-2、OSX、OC在各组的表达结果同人骨髓来源间充质干细胞（hBMMSCs）。

    由实验结果可知，本发明具有能达到显著好于现在市面上广泛流行的种植体的成骨效果。

本发明不限于上述最佳实施方式，本领域的普通技术人员可以在不脱离本发明构思的情况下做出各种修改和变化方案，并且这些修改和变化方案均落在由所附权利要求所限定的保护范围内。

Claims (16)

1. 一种具有生物涂层的口腔种植体，所述口腔种植体包括：基体；和涂覆在所述基体上的生物涂层，其特征在于所述生物涂层包含能够促进成骨的药物和能抗感染的药物。

2. 根据权利要求1所述的口腔种植体，其特征在于所述基体为TA1钛片。

3. 根据权利要求1所述的口腔种植体，其特征在于所述生物涂层为仿生钙磷涂层。

4. 根据权利要求1所述的口腔种植体，其特征在于所述能够促进成骨的药物为辛伐他汀。

5. 根据权利要求1所述的口腔种植体，其特征在于所述能够抗感染的药物为甲硝唑。

6. 根据权利要求3所述的口腔种植体，其特征在于，所述仿生钙磷涂层同时缓释发挥促成骨作用的辛伐他汀和抗感染作用的甲硝唑。

7. 根据权利要求6所述的口腔种植体，其特征在于，最终缓释到周围溶液中的所述辛伐他汀的浓度为10^-5M数量级的浓度。

8. 根据权利要求6所述的口腔种植体，其特征在于，最终缓释到周围溶液中的所述甲硝唑的浓度为10^-2M数量级的浓度。

9. 一种制作具有生物涂层的口腔种植体的方法，所述口腔种植体包括基体；和涂覆在所述基体上的生物涂层，其中所述生物涂层包含能够促进成骨的药物和能抗感染的药物，所述方法的特征在于包括如下步骤：

提供基体；

对所述基体进行抛光、喷砂以及酸蚀处理，然后进行清洁；

将能够促进成骨和能够抗感染的药物以溶液形式沉积到所述基体上；以及

对所述基体进行冻干以获得具有生物涂层的口腔种植体。

10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述基体为TA1钛片。

11. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述生物涂层为仿生钙磷涂层。

12. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述能够促进成骨的药物为辛伐他汀。

13. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述能够抗感染的药物为甲硝唑。

14. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述仿生钙磷涂层同时缓释发挥促成骨作用的辛伐他汀和抗感染作用的甲硝唑。

15. 根据权利要求14所述的方法，其特征在于，最终缓释到周围溶液中的所述辛伐他汀的浓度为10^-5M数量级的浓度。

16. 根据权利要求14所述的方法，其特征在于，最终缓释到周围溶液中的所述甲硝唑的浓度为10^-2M数量级的浓度。