CN104107435B - 一种整合素avβ3靶向给药载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体，结构通式为：该给药载体的制备方法是首先通过还原敏感的二硫键将PAMAM和聚乙二醇连接起来形成还原敏感的聚合物载体（PAMAM‑SS‑PEG），其次在该载体的聚乙二醇远端连接上具有整合素avβ3靶向性的功能基团，从而形成同时具有还原敏感性和整合素avβ3靶向性的PAMAM树状聚合物载体(PAMAM‑SS‑PEG‑T)。本发明的给药载体在血液中能够长效循环，并能增强具有整合素avβ3受体的肿瘤细胞对聚合物的摄取作用，从而实现对肿瘤组织的主动靶向和被动靶向。此外，该载体在肿瘤细胞内高还原环境和低pH条件下，载体中的二硫键发生断裂，同时PAMAM的内核打开，使药物能够快速有效的释放，从而达到提高抗肿瘤药物的治疗效果和降低毒副作用的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向给药载体及其制备方法，具体涉及一种基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体及其制备方法。
背景技术
据2014年全国肿瘤登记中心发布的《2013中国肿瘤登记年报》显示，我国每一年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天有8550人患病，即：每分钟就有6人被诊断为癌症，有5人死于癌症，癌症已成为除心脑血管病外的第二大严重威胁人类健康的疾病。目前临床上仍然采用化学治疗作为癌症治疗的主要方法之一，但是由于药物本身的毒害作用，体内细胞无论是否恶性肿瘤细胞，都会受到破坏。且随着治疗时间的不断延长，化疗药物的毒副作用日益明显，使患者在治疗癌症的同时，也承受着一定程度的痛苦，最终导致部分患者放弃治疗。因此，提高药物的靶向性，增加药物在肿瘤细胞中的富集，减少对正常细胞组织的损伤，减轻患者的痛苦，有着重要的现实意义与临床价值。
纳米载体可通过肿瘤组织特有的增强渗透及滞留效应（Enhanced permeabilityand retention effect，EPR）被动富集于肿瘤部位，成为癌症治疗最具潜力的药物递送系统。聚酰胺-胺树枝状大分子 (polyamidoamine dendrimer，PAMAM dendrimer)是一类目前得到广泛应用的树枝状聚合物材料，在其作为靶向递药系统载体时体现出独特的优越性，如：其内部结构的疏水性空腔，可以物理包埋疏水性药物；其表面有许多活性较强的氨基，可以连接机体中某些器官、组织和细胞特异性识别的靶向配基等。但由于高代数PAMAM会引起一定的细胞毒性和溶血毒性, 所以通常在PAMAM表面对其进行PEG化的修饰，一方面可以减少其毒副作用，另一方面可进一步提高该载药系统的亲水性，从而延长药物在血液中的循环时间，有助于药物被动靶向于肿瘤组织, 从而提高药物治疗效果。但是，经PEG化修饰后载体在一定程度上会降低药物的释放，这将大大降低药物的抗肿瘤效果。因此，我们设计一种可剪切的聚合物载体，而肿瘤部位特定的生理环境为实现这个目标提供了有利条件。研究表明，肿瘤细胞内的细胞质和细胞核中存在大量的还原性谷胱甘肽（GSH），它可以对二硫键进行剪切，使二硫键发生断裂。而且肿瘤细胞内的GSH浓度（10-20 mM）明显高于血浆中的GSH浓度(10 µM），这足以保证可剪切的二硫键聚合物在血液循环时二硫键不发生断裂，药物缓慢释放，而当被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内高浓度的GSH刺激下，二硫键发生断裂，从而快速的释放被包载的药物，达到治疗肿瘤的目的。除此之外，PAMAM本身还具有pH敏感性，即在肿瘤组织低pH的条件下，PAMAM的构象会发生变化，其疏水性的内核会打开，这将进一步加快药物的释放速度及增加释放量，从而达到还原及pH双重释药的目的。为了提高聚合物的靶向效率，增加聚合物的摄取量，目前研究最常用的方法是在PAMAM的表面连接上能与肿瘤细胞内特定受体结合的配体，从而实现主动靶向和被动靶向相结合，最大程度的提高聚合物的靶向效率。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，广泛存在于生物体内，是整合素与其配体蛋白的识别位点。整合素为细胞黏附分子重要组成成分之一, 主要介导细胞与细胞，细胞与细胞外基质(Extracenularmatrix, ECM)之间的相互黏附，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导。整合素αvβ3在多种肿瘤细胞表面和新生血管内皮细胞表面高表达，而在正常成熟组织(静止型非增殖内皮细胞)表面不表达。研究表明，在肿瘤的生长和转移过程中，新生血管起着重要作用，若没有新生血管生成，肿瘤的生长则不会超过1-2 mm。但是，由于大多数线性RGD肽在循环过程中半衰期较短，所以其治疗效果不够理想。为此，研究者将其主体或部分结构改为环形，来增加肽类化合物的稳定性与活性。研究表明，通常情况下，含有两个二硫键的环状RGD多肽对肿瘤新生血管内皮细胞的抑制力，是线性RGD多肽的20倍。因此, 本发明利用cRGDyK多肽与高表达整合素αvβ3的肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的高亲和力，将RGD连接到PAMAM-SS-PEG载体上，从而实现载药系统对肿瘤部位的主动靶向作用。
发明内容
要解决的技术问题：本发明主要解决PAMAM-SS-PEG对肿瘤细胞的靶向性低的问题，设计了一种基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体及其制备方法，以此提高药物的抗肿瘤效果。
技术方案：为了达到上述目的，本发明公开了一种基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式为：
其中，PAMAM是末端带有氨基，以乙二胺为核的0 ~ 10.0代的聚酰胺-胺树状大分子，x为20 ~ 1000，y为1 ~ 4096，z为1 ~ 4096。
其中，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中x优选为112。
其中，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中y优选为32。
其中，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中z优选为32。
其中，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中PAMAM优选为末端带有氨基，以乙二胺为核的4代的聚酰胺-胺树状大分子。
其中，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中T优选为具有整合素avβ3靶向性的cRGDyK 多肽。
一种基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的制备方法，包括下述步骤：
(1) 含二硫键的PAMAM-NH-SPDP中间体的合成
将PAMAM甲醇溶液与SPDP加入反应容器中，加入三乙胺，在30 oC下避光搅拌5 h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；反应如下：
其中，PAMAM是末端带有氨基，以乙二胺为核的0 ~ 10.0代的聚酰胺-胺树状大分子；
(2) PAMAM-SS-PEG的合成
向PAMAM-NH-SPDP中间体中加入HS-(CH2CH2O)x-COOH，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中，在水中透析两天，冷冻干燥三天得白色固体即为靶向给药载体PAMAM-SS-PEG，避光保存；反应如下：
其中x为20 ~ 1000，y为1 ~ 4096。
(3) PAMAM-SS-PEG-RGD的合成
其中z为1 ~ 4096。
其中，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中x优选为112。
其中，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中y优选为32。
其中，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中z优选为32。
其中，所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中PAMAM优选为末端带有氨基，以乙二胺为核的4代的聚酰胺-胺树状大分子。
有益效果：
本发明的一种基于PAMAM的靶向给药载体的显著效果在于：其一，通过二硫键将PAMAM与PEG连接起来，此种连接方式不仅可以降低由PAMAM引起的细胞毒性和溶血毒性等问题，而且可进一步提高该载药系统的亲水性，减少被RES系统的摄取，从而延长药物在血液中的循环时间，有助于药物通过EPR效应被动靶向于肿瘤组织。其二，在载体的聚乙二醇远端连接上具有整合素avβ3靶向性的功能基团RGD多肽，不仅可以靶向表达整合素avβ3受体的肿瘤细胞, 而且可以靶向表达整合素avβ3受体的肿瘤新生血管内皮细胞，这样可以从根源上断绝肿瘤细胞的营养供应，从而更有效的实现肿瘤细胞的靶向治疗。其三，此种可剪切的聚合物载体能在血液循环时二硫键不发生断裂，药物缓慢释放，而当被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内高浓度的GSH（10-20 mM）刺激下，二硫键发生断裂，从而快速的释放被包载的药物，达到治疗肿瘤的目的。除此之外，PAMAM本身还具有pH敏感性，即在肿瘤组织低pH的条件下，PAMAM的构象会发生变化，其内部疏水性内核会打开，这将进一步加快药物的释放速度及增加释放量，从而达到还原及pH双重敏感释药的目的。
附图说明
图1为PAMAM-SS-PEG（A）、cRGDyk（B）、PAMAM-SS-PEG-RGD（C）的1H-NMR图谱。
图2为PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX体外释放图。
图3为PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX的体外抗肿瘤实验。
图4为PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX的体外细胞摄取实验的共聚焦显微镜图。
图5为PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX的体外细胞摄取实验的流式分析图。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子：末端带有氨基，以乙二胺为核，0 ~ 10.0代(购自Sigma-Aldrich)；3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）购自圣克鲁斯生物技术上海有限公司；HS-(CH2CH2O)x-CH2COOH购自北京键凯生物有限公司；三乙胺、甲醇等购自国药集团化学试剂有限公司；水为双蒸水。
用Unity Inova 400 M超导核磁共振谱仪（1H-NMR）对PAMAM-SS-PEG-RGD进行结构确证；用Nicomp TM380 ZLS粒径/电位分析仪对PAMAM-SS-PEG-RGD进行电位和粒径表征。
实施例1
将5 mg PAMAM（4代）溶于1.5 mL的甲醇溶液中，加入3.5 mg的SPDP，在30 ℃下避光搅拌5 h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；在生成的PAMAM-NH-SPDP中间体中，PAMAM与SPDP的摩尔比例为1:32。向PAMAM-NH-SPDP中加入56 mg的HS-(CH2CH2O)112-CH2COOH，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中（MW：8000-14000），在水中透析2天，冷冻干燥3天得白色固体为PAMAM-SS-PEG32，避光保存。取20 mg的PAMAM-SS-PEG32 溶于2 ml的DMSO中，加入3.4 mg的EDC和2 mg NHS反应30 min后，随即按照两者摩尔比1:32加入2.16 mg的cRGDyK, 继续反应6 h，所得产物透析（MW：3500），冷冻干燥得白色固体即为PAMAM-SS-PEG-RGD聚合物，其产率约为81.6%，（X=112，Y=32，Z=32）。
对实施例1合成的产物进行核磁分析，结果如图1所示，通过核磁1H-NMR对合成的产物进行核磁分析，其中PSSP的特征质子峰归属如下：其中 δ = 2.25，2.45，2.65，3.05-3.15 ppm 为PAMAM上的特征质子峰；δ = 3.4 ~ 3 .6 ppm (m，CH2CH2O)为HS-(CH2CH2O)112-CH2COOH上特征质子峰；δ = 6.84，7.11 ppm为cRGDyK上的特征质子峰。从产物的核磁氢谱中可以发现其同时具有PAMAM，HS-(CH2CH2O)112-CH2COOH和cRGDyK的特征质子峰，证明cRGDyK成功的共价结合到PAMAM-SS-PEG的表面。此外根据文献计算cRGDyK的连接个数，HS-(CH2CH2O)112-CH2COOH的H的个数为455个，而cRGDyK在δ 6.84和 δ7.11处H的个数为4个，由公式PEG/cRGDyK = 可以计算出cRGDyK的连接个数为18个。
PAMAM-SS-PEG-RGD聚合物Zeta电位和粒径的测定
取5 mg的聚合物溶于5 ml 0.1M PBS溶液，终浓度为 1.0 mg/mL，用0.45 µM滤膜过滤，采用Zeta电位粒径仪进行测定，得到粒径分布图和平均粒径。每种样品平行操作三次。Zeta电位测定采用相同的仪器，样品的溶剂为 0.1M PBS（pH = 7.4），样品浓度为1.0mg/mL，每种样品平行操作三次。测得PAMAM-SS-PEG-RGD 聚合物的Zeta电位为 -0.11 ±0.02 mV，粒径为 17.1 ± 0.11 nm。
制备PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物
取PAMAM-SS-PEG-RGD聚合物 10 mg溶于2 ml甲醇中。同时按摩尔比1:20取一定量的DOXHCl溶于300 µL的甲醇中，加入10 μL三乙胺中和盐酸，使DOX游离出来。然后将DOX溶液与2 ml 聚合物甲醇溶液混合，搅拌过夜。反应完成后用旋转蒸发仪将甲醇旋干，随后加入一定量的蒸馏水将PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX溶解，并将复合物在4000 rpm/min的条件下离心10 min，除去未被包封的DOX，即得PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物。以相同的方法制备对照物PAMAM-SS-PEG/DOX复合物。
PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物体外释放考察
复合物的体外释放行为通过四种释放条件来考察，分别为 (1)含有10 μM GSH 的PBS 缓冲液 (0.1 M, pH 7.4), (2) 含有10 mM GSH 的PBS 缓冲液(0.1 M, pH 7.4),(3) 含有10 μM GSH的醋酸缓冲液 (0.1 M, pH 5.0), 以及 (4) 含有10 mM GSH的醋酸缓冲液(0.1 M, pH 5.0)。具体操作为：称取一定量的PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物溶于8 mlpH = 7.4, GSH = 10 µM的缓冲液中；随即转入4个透析袋（MW = 3500）中，每个透析袋里加入2 ml复合物溶液，透析袋两端采用包装线系紧。然后将透析袋放入50 ml的锥形瓶中，每个锥形瓶中加入20 ml相应的缓冲溶液。将锥形瓶放入摇床中，在37°C，100 rpm条件下孵育，于固定的时间点（0.5、1、2、4、6、8、12、24 h）取样1 ml，并补充1 ml新鲜缓冲液，采用荧光分光光度计(FLS920, 激发波长为480 nm)测定外液中DOX的浓度，并计算累计释放百分数。从图中可以看出，PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物在GSH = 10 mM的条件比在GSH = 10 μM条件下释放快，主要原因是由于二硫键在高浓度GSH的刺激下会发生断裂，使原本覆盖在PAMAM表面的PEG外壳脱落，从而减小了DOX从PAMAM内核转移至外面释放介质中的阻力，进而加快药物的释放；同时还可以看出复合物在pH = 5.0的条件下比pH = 7.4条件下释放快，这主要是因为PAMAM在酸性条件下其构象会发生改变，其内核会打开，从而有助于药物的快速释放。除此之外，我们发现，在同时具有高浓度GSH和酸性环境的介质中(GSH = 10mM , pH = 5.0)，药物的释放率明显高于其单一在高GSH条件或者酸性条件下的药物释放率，其原因主要是由于在这种条件下，不仅PAMAM外表面连接的PEG能够脱落，而且其表面的树状分支也会打开，这样就大大降低了DOX释放时的阻力，从而明显提高了药物的释放，有助于增加药物的抗肿瘤效果。
PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物体外抗肿瘤实验
取处于对数生长期的B16细胞，分别以 104个/孔接种于96孔板， 在37 ℃培养24h后，分别加入不同浓度的PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物，继续培养48 h后，吸去含药培养液，每孔加入0.1 mL含0.5 mg/mL MTT的无血清培养液，于37 ℃ 继续孵育4 h，吸去含有MTT的培养液，每孔加入0.1mL DMSO，待溶解均匀后用酶标仪测定吸光度值（λ= 570 nm)，并计算细胞活力抑制50%时的浓度(IC50)。用同样的方法考察PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物对HUVEC细胞的毒性，孵育时间为48 h。
从图3中可以看出，PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX的对B16细胞的细胞毒性明显高于PAMAM-SS-PEG/DOX，其IC50值为0.24±0.03 μg/ml，比PAMAM-SS-PEG/DOX的IC50低约两倍（0.45±0.13 μg/ml），说明连接上RGD靶头后能明显增加复合物的抗肿瘤效果，主要原因是由于RGD能增加细胞对复合物的摄取量，从而增加细胞内的DOX浓度，增强其抗肿瘤作用。另外，我们还可以看出，PAMAM-SS-PEG/DOX的抗肿瘤效果要强于PAMAM-PEG/DOX，主要是因为二硫键的断裂能够明显增加药物的释放，从而增强其抗肿瘤效果，这与体外的释放结果是相一致的。同样，PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物对HUVEC的抗肿瘤效果与B16细胞类似，说明该复合物不仅能靶向肿瘤细胞，而且能够靶向肿瘤新生血管细胞，从根源上杀死肿瘤细胞，这将进一步增加复合物的抗肿瘤效果。
PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物的细胞摄取考察
考察PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX对三种不同细胞的摄取情况，其中B16和HUVEC为整合素αvβ3高表达细胞，而MCF-7为整合素αvβ3低表达细胞。将三种细胞株按一定密度接种至卡氏培养瓶中，置于37℃，5% CO2 (相对湿度90%)细胞培养箱中培养。待细胞长至对数生长期，用胰酶将细胞消化后，细胞计数，加入培养基，调整细胞浓度为1.5 ×105细胞/孔，加入6孔板中 ，置于37℃，5% CO2 条件下培养12 h。 将PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX用紫外分光光度计定量后，稀释至含DOX 5 μg/ml，随后加入6孔板中，在37℃，5% CO2 条件下培养2 h后，用PBS清洗3次，随即在荧光显微镜下观察摄取情况，另设一组先加入500 μg/ml的cRGDyK提前孵育 1 h后再加入PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX作为对照组。
为了对复合物的摄取情况进行定量分析，取处于对数生长期的B16、HUVEC和MCF-7细胞，以2.5× 105个/孔接种于35 mm培养皿, 培养24 h贴壁, 然后与含有PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX的无血清培养液(含有5 μg/ml DOX) 于37℃孵育2 h, 用4℃的PBS (pH 7.4)清洗并消化, 用流式细胞仪(Ex 488 nm; Em 550 nm)测定平均荧光强度，每种样品平行操作三份。
从图4中可以看出，B16和HUVEC细胞对PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物的摄取明显高于PAMAM-SS-PEG /DOX的摄取，说明RGD有助于增加细胞对复合物的摄取，而提前加入cRGDyK孵育 1 h后再加入PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX的摄取则低于PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX的摄取，说明游离的RGD会与细胞表面的整合素αvβ3受体结合，从而减少细胞对复合物的摄取，这进一步证明了复合物是通过与细胞表面的整合素αvβ3受体结合而进入细胞的。但是，MCF细胞对PAMAM-SS-PEG/DOX、PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX以及cRGDyK + PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX的摄取量基本一致，主要原因是MCF-7细胞表面的整合素受体表达量低，从而导致细胞对复合物的摄取量明显低于B16和HUVEC细胞。
从图5中流式分析结果可知，B16和HUVEC细胞对PAMAM-SS-PEG-RGD/DOX复合物的摄取明显高于对PAMAM-SS-PEG/DOX的摄取，而MCF-7细胞对两种复合物的摄取量基本一致，这与荧光显微镜观察的结果是相一致的。
实施例2
将5 mg PAMAM（10代）溶于1.5 mL的甲醇溶液中，加入0.02 mg的SPDP，在30 ℃下避光搅拌5 h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；在生成的PAMAM-NH-SPDP中间体中，PAMAM与SPDP的摩尔比例为1:1。向PAMAM-NH-SPDP中加入0.05 mg的HS-(CH2CH2O)20-CH2COOH，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中（MW：8000-14000），在水中透析2天，冷冻干燥3天得白色固体为PAMAM-SS-PEG，避光保存。取20 mg的PAMAM-SS-PEG溶于2 ml的DMSO中，加入0.03 mg的EDC和0.06 mg NHS反应30 min后，随即按照两者摩尔比1:1加入0.36 mg的cRGDyK, 继续反应6h，所得产物透析（MW：3500），冷冻干燥得白色固体即为PAMAM-SS-PEG-RGD聚合物，其产率约为78.1%，（X=20，Y=1，Z=1）。
实施例3
将5 mg PAMAM（10代）溶于1.5 mL的甲醇溶液中，加入6.8 mg的SPDP，在30 ℃下避光搅拌5 h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；在生成的PAMAM-NH-SPDP中间体中，PAMAM与SPDP的摩尔比例为1:4096。向PAMAM-NH-SPDP中加入966 mg的HS-(CH2CH2O)1000-CH2COOH，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中（MW：8000-14000），在水中透析2天，冷冻干燥3天得白色固体为PAMAM-SS-PEG4096，避光保存。取20 mg的PAMAM-SS-PEG4096 溶于2 ml的DMSO中，加入43 mg的EDC和252 mg NHS反应30 min后，随即按照两者摩尔比4096:1加入0.07 mg的cRGDyK, 继续反应6 h，所得产物透析（MW：3500），冷冻干燥得白色固体即为PAMAM-SS-PEG-RGD聚合物，其产率约为68.6%,（X=1000，Y=4096，Z=1）。
实施例4
将5 mg PAMAM（10代）溶于1.5 mL的甲醇溶液中，加入6.8 mg的SPDP，在30 ℃下避光搅拌5 h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；在生成的PAMAM-NH-SPDP中间体中，PAMAM与SPDP的摩尔比例为1:4096。向PAMAM-NH-SPDP中加入966 mg的HS-(CH2CH2O)1000-CH2COOH，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中（MW：8000-14000），在水中透析2天，冷冻干燥3天得白色固体为PAMAM-SS-PEG4096，避光保存。取20 mg的PAMAM-SS-PEG4096 溶于2 ml的DMSO中，加入43 mg的EDC和252 mg NHS反应30 min后，随即按照两者摩尔比1:1加入287 mg的cRGDyK, 继续反应6 h，所得产物透析（MW：3500），冷冻干燥得白色固体即为PAMAM-SS-PEG-RGD聚合物，其产率约为61.3%,（X=1000，Y=4096，Z=4096）。
当然上述实施例只是为说明本发明的技术构思及特点所作的例举而非穷举，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体，其特征在于所述的基于PAMAM的靶向给药载体的结构通式为：
其中，PAMAM是末端带有氨基，以乙二胺为核的第4代的聚酰胺-胺树状大分子，x为112，y为32，z为32；
所述的基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体的结构通式中T为具有整合素avβ3靶向性的cRGDyK 多肽；
所述的一种基于PAMAM的整合素avβ3靶向给药载体通过下述的制备方法制备得到：
(1) 含二硫键的PAMAM-NH-SPDP中间体的合成
将PAMAM甲醇溶液与SPDP加入反应容器中，加入三乙胺，在30 oC下避光搅拌5 h，生成PAMAM-NH-SPDP中间体；反应如下：
其中，PAMAM是末端带有氨基，以乙二胺为核的0 ~ 10.0代的聚酰胺-胺树状大分子；
(2) PAMAM-SS-PEG的合成
向PAMAM-NH-SPDP中间体中加入HS-(CH2CH2O)x-COOH，搅拌过夜，所得产物转移至透析袋中，在水中透析两天，冷冻干燥三天得白色固体即为靶向给药载体PAMAM-SS-PEG，避光保存；反应如下：
其中x为20 ~ 1000，y为1 ~ 4096；
(3) PAMAM-SS-PEG-RGD的合成
其中z为1 ~ 4096。
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