CN104093417A - 疟疾疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供高度变异的PfEMP1形成玫瑰花结的抗原(rosetting antigen)的抗原限制的亚类，其具有可以用于产生有效针对疟原虫、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的很多不同株和分离株的免疫应答的表位。在这方面,本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(PfEMP1)抗原或其一个或多个片段,其用于在人中产生免疫应答。

Description

疟疾疫苗
发明领域
本发明提供可以用于产生(raise)人中免疫应答的抗原。具体地,本发明提供产生对多种恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)株显示交叉反应性的免疫应答并且可以用于治疗和/或预防疟疾并且尤其是重症疟疾的抗原。
发明背景
病原体抗原的序列多样性是开发针对很多传染性疾病的干预技术的障碍。由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的疟疾中,由var基因编码的不同表面抗原的PfEMP1家族是在疟疾发病机制和临床疾病中发挥关键作用的粘附分子。PfEMP1是保护性免疫的主要靶点,然而,由于PfEMP1家族内广泛的序列多样性，开发基于PfEMP1的药物或疫苗是有困难的。
每种恶性疟原虫分离株具有50-60种不同的PfEMP1变体,并且不同分离株的PfEMP1组库大部分不重叠[3,4,5,6]。PfEMP1变体以相互排斥的方式表达,并且从一种var基因到另一种的转录转换导致恶性疟原虫感染的红细胞的抗原变异[7]。取自广泛的全球寄生虫群体的样品的PfEMP1变体显示基本上无限制的序列多样性[5,8],使PfEMP1成为非常具有挑战性的治疗靶点[9](还参见:Pierce SK,Miller LH.J Immunol2009；182:5171-7)。
如对高度多态的寄生虫抗原预期的，对天然感染后[10,11]或用重组PfEMP1结构域免疫后[11,12]出现的活的感染的红细胞上的针对PfEMP1的表面反应性抗体是主要变体特异的。然而,居住在地方病区域的儿童在生命的前几年发展出防护威胁生命的疟疾的抗体[13]，提示跨越株的抗体应答可能存在,或提示引起重症疟疾的寄生虫是限制的抗原类型的[14,15]。尚未鉴定出寄生虫表面抗原的诱导跨越株的抗体的抗原限制的亚类。
除了在免疫和免疫逃避方面的作用之外,PfEMP1变体是介导与多种人细胞类型和表面受体的相互作用的粘附蛋白[16,17]。三个主要PfEMP1家族(A,B和C,基于保守的上游序列和基因组位置)在其粘附功能方面不同[16]。类型B和C变体(每种单倍体寄生虫基因组大约40-50种变体)结合于内皮蛋白并且清除受体CD36[18,19]。相比之下,类型A变体(每种单倍体寄生虫基因组大约10种变体)不结合CD36[18,19]但的确介导形成玫瑰花结(rosetting)[11,12,20,21],其中感染的红细胞结合于未感染的红细胞的粘附表型[22]。类型A var基因的转录与多种地理环境[23,24,25,26]和实验室实验[27]中的重症疟疾相关联,然而B和C var基因的转录在引起无并发症疾病的弱毒感染下发生[23,24,25,26]。
形成玫瑰花结是重要的寄生虫毒力因子,与非洲儿童中威胁生命的疟疾[28,29,30,31,32]和灵长类动物疟疾模型中的高寄生虫负荷[33]相关。形成玫瑰花结引起对微血管血流的病理性梗阻[34]和降低恶性疟原虫形成玫瑰花结赋予针对重症疟疾的相当程度保护的能力的人红细胞多态性[35,36]。恶性疟原虫形成玫瑰花结的寄生虫可以被分为两种不同表型:来自正常人血清的结合IgM天然抗体(“非免疫”IgM)的那些[37,38]和不结合的那些。非免疫IgM结合被认为加强玫瑰花结中感染的和未感染的红细胞间的粘附相互作用[37,39,40]并还可以通过掩盖关键表位在免疫逃避中发挥作用[41]。之前对PfEMP1和形成玫瑰花结的研究集中于具有非IgM结合表型的寄生虫[11,12,20,21,42]。尽管此表型临床上重要,但是因为来自临床患病儿童的形成玫瑰花结的寄生虫主要为IgM结合型，所以至今忽略了结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的详细研究[38]。
发明概述
本发明基于高度变异的PfEMP1形成玫瑰花结的抗原的抗原限制亚类的发现。此外,发明人已发现尽管有相当程度的序列多样性,但是PfEMP1变体具有可以用于产生有效针对疟原虫(恶性疟原虫)的很多不同株和分离株的免疫应答的表位。
在第一个方面,本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(PfEMP1)抗原或其一个或多个片段,其用于产生人中免疫应答。
在第二个方面,本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(PfEMP1)抗原或其一个或多个片段用于制备用于产生人中的免疫应答的药物的用途。
在进一步的方面,本发明提供产生人中的免疫应答的方法,所述方法包括向人受试者施用免疫原性量的一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(PfEMP1)抗原或其一个或多个片段的步骤。
在一个实施方案中,在人受试者中产生的免疫应答包括系统性抗体应答,包括一种或多种抗体同种型。通过举例的方式,人中产生的免疫应答可以包括IgM,IgG,IgA,IgD和/或IgE抗体同种型。
有利地,本文描述的免疫应答是交叉反应性的；也就是说,所述免疫应答包含不仅对被本发明使用的特定PfEMP1抗原,而且对其它PfEMP1变体显示一定程度的亲和力,选择性和/或特异性的抗体。考虑到PfEMP1抗原间的序列同一性/同源性的类似的缺乏,从PfEMP1抗原的仅有限选择中产生交叉反应性抗体应答的能力是既有利，也另人惊讶的。
本文描述的免疫应答可以进一步助于缓解,减少和/或消除疟疾/重症疟疾的症状。此外或备选地,人受试者中产生的免疫应答可以减少寄生虫(疟原虫属)负荷和/或从宿主中清除或消除寄生虫。技术人员将理解此种类型的免疫应答可以被称为“保护性免疫应答”。
因此,本文描述的抗原,用途和/或方法可以用于产生人宿主中交叉反应性和/或保护性抗体,所述抗体对恶性疟原虫的PfEMP1抗原显示一定程度的亲和力,选择性和/或特异性。
在一个实施方案中,被本发明使用的PfEMP1抗原是IgM形成玫瑰花结的变体。本领域技术人员将理解IgM形成玫瑰花结的PfEMP1变体特征在于其结合来自人血清的IgM抗体的能力。因此,在更进一步的实施方案中,本发明提供PfEMP1IgM形成玫瑰花结的变体(或其一个或多个片段)，其用于提高人免疫应答；PfEMP1IgM形成玫瑰花结的变体(或其一个或多个片段)用于制备用于产生人中的免疫应答的药物的用途；和产生人中的免疫应答的方法,所述方法包括向人受试者施用免疫原性量的一种或多种PfEMP1IgM形成玫瑰花结的变体或其一个或多个片段的步骤。
在一个实施方案中,本发明的PfEMP1抗原表示特定的PfEMP1变体。在这方面，发明人发现命名为HB3var6，TM284var1和ITvar60的(IgM形成玫瑰花结的)PfEMP1变体包含能够诱导保护性和/或交叉反应性免疫应答的表位。
因此，本发明的一个实施方案提供一种或多种PfEMP1抗原或其一个或多个片段，其用于产生人受试者中的免疫应答，其中所述PfEMP1抗原选自由以下组成的组：
(i)HB3var6
(ii)TM284var1；和
(iii)ITvar60。
此外，应该理解本发明中描述的各种药物和方法还可以使用如以上(i)-(iii)列出的特定PfEMP1变体(或其一个或多个片段)。
技术人员将理解HB3var6PfEMP1抗原可以获自恶性疟原虫株HB3。类似地，TM284var1PfEMP1抗原和ITvar60PfEMP1抗原可以分别获自恶性疟原虫株TM284和IT/PAR+。
命名为HB3var6的PfEMP1变体具有以下氨基酸序列：
SEQ ID NO：1
MGNTIPKPPDPIYINESYQSTRNVLERYAESIKQQAAADAEKCEKSLKGDLTKAEFRGAHIETVGVQKYSYSNPCGLNHT
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TILDDMEDDIYYDVNDENPSVDNIPMDHNKVDVPKKVHVEMKILNNTSNGSLEQEFPISDVWNI
此外，HB3var6PfEMP1变体由以下核酸序列编码：
SEQ ID NO：2
ATGGGGAATACAATACCAAAGCCTCCGGATCCAATTTATATAAATGAAAGTTATCAAAGTACCAGAAATGTTTTGGAACG
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TACAAAACAATTAAATTACCCGAACCCATGTGAAAGCATATATGCTTCACCTCGAAGACAAAAATTCTGTGTACATGAAC
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AAACATCATGAATATAAAGACAAATATACTGTTAATCCTTGTAATGCATTGAAATATAGTTTTTACGATTATCAGCATAT
AATTCTAGGAGATGACCCGATGGAACCTGAAAAATGGGATACGGAAAGTGCATTGAAAAGAATATTTGGAAATAGAAATA
CAGAAGATGCCAAACCTCTTAGTAGAAAACGTAAAGATTTTTGGAAAGAAAACAAAGAATGCGTTTGGTCAGCAATGAAA
TGTGGTTACAACGAAGGAATAAAAAAGGGTAATAAGAGTAATAATATTCCAGAATGTAAGGACAGTATACCTACCCAATT
TGATGGTGTTCCTCAATTTTTGATGTGGTTTACTGAATGGAGTGAAGATTTTTGTAATCATAAGAAGACACATTTGAAAA
AATTGGAGCAGGGGTGTAGGGGATGTACTCTTCGTATTGATGGCACATGTGAGAAAGATGGCTCAGGATGCCAAAAATGT
TCACAAGCGTGTGAAGAATATAAAGCATGGCTTCAAAATTGGAAAGACCAATATAAGAAACAAAGCAAAAAATATAGTGG
TGATAAAAAAAAAGAGCTATATAAAACTGTTCCTAAAGTAAAAAATTCAACACATGCCTATGAATATTTACAAACACAAT
TAGAAAAACTTTGTGAAAAAGGTAAATGTGATTATACTTGTATGAAAAACCCATCGACAGAAAATAGTACTGAAAATATG
CCCGAATCATTGGACGTAAAACCCGATATAGTTAAGGATAAATGCCCTTGTCCACCACAGAAAATAGAAAAACCCGATTC
CACATTAAATTGCATAGATAGAAGTGCATTTGAATTATATGCAAAAGCAAAAAGTGATTTACATGGTGTAAAAGATAAAT
TAAAGGGTAATAATACAAAAAATATATACGAAGAAACAACTAATGGTAAAAATGATGATAATATTATCTGTAAAATTAAT
GAGAGTATTTCTAAACAAAACAATGTATGTAAAAAAAATGAAAATCTTTTTGATGATATAGACAAATGGGACTGTAAAAA
ACGAACAAATACAGTGCCCATTGAAAATATATGTATTCCTCCAAGAAGGAAACTTATGTGTGCATATCCATTAAAAAATT
TAGGAGTAAAAAAAAATACTTCAGAAGTATTGTTCAACAAAGTATTGCGTACAGCAGCATATGAAGGAAAACATATAAAG
GAATCATGGGAAAAAGCAGAAAAATCCAAGAAAAAAAAAACCCAAATATGTGATGCTATGAAATACAGTTTTGCAGATTT
AGGAGATATAATTAGAGGAAGAGATATATTGATATTTAATAATGGTAATAATGAAATTGAGAGAGACTTAAAAGCTGTTT
TTCAGTCAATATACGATAAATGGAAATCTGACAGTAATAATAATAAAGATAAATACCCCGACTTAACCTCTTTTCGTTCT
GCCTGGTGGGATGCTAATAGAAAAGATATTTGGAAAGCTATGACATGTGGTGCACCGGAAGATGCTACGCTTTTTAAAAA
ACTAGAAAAATGGGGAATTCCTAATTTAATTTTGTCACAACATAAATGTGGGCATAATGACGATCCTCCTATTGATGATT
ACATACCTCAACGGTTAAGATGGATGAAGGAATGGGGAGAATATGTTTGCAAAATATTAAATGAAAACGTGAATCATATG
AAGAACGATTGTGATAAATGTACACTAAATGATAAAAAATGTTCAGATGAAGATGATGGTAATAAATGTAGAAGTTGTAA
AGAAAAATGTAAAGAATATACTAAACTTATATACAATCTGAAATCACAATTTTATATACTAGAAAAACATTATAACGAAT
TATATACAAAAGCACAAAATAATACAACATATTTTACAAATGATAACGATAAAAAGGTTATTGAATTTTTTAAAAAAGTT
AAAAAGGATTGTGATGTGGGAACTCCTGATAAATATCTCGATAAAGCTATTCATTGTATCCATTATGATTTTACTAAAAA
TGGAACCAAATCTAAGCCATATGTCTTCAACAATCAACCAGAAAAGTATAAAAATCTTTGTAGTTGTACTATTACTAATC
ATCCGTTAGACAAATGTCCTTTACCTGATAAAACAGATGATTATTGCAAAATCATTAGACATATTAATCCGTGTATAACA
ATAAATTTGGATAATAATTTGGATACGTGGACTGGATTTGTTGTGCATAATATAAGTCACAAAAATAAAGGTGTGCTTGT
ACCTCCAAGAAGAAGACATTTATGTACAAGAGAATTAACTGGAATTAGATATCGTAAAAATGATAAAGATAATTTGAAAC
AAAATCTTATTGATTCTGCTTTTAATCAAGGAATACTTTTAGGAAAAACATTTAAAGATTACAGCGATCAAGGTTTGGAA
TATATGAAATATAGTTTTGCTGATTATGGAGATATAATTAAAGCTAAAGATATGATAGGAGGTTCAAATATTGATGATTT
CAATAATGATTTAAAAAAATGTTTCCAGAACATCATAGTGAGAATATGGGAAAAACTACTATTAGTCGTGAACAGTGGT
GGGAAGCAAATAAAACACACGTATGGCACGCTATGTTATGCGGGTATCATCAAGGAATAATTAATCCAAACTTATCAAGA
AGAAGACCAAAACCATTAGAAGAAGGAACACAATCGTCGATAGCAACTAAAACTATTCCTTCAAATTGGTGTCAATTACC
TAATGATTATAGCACTGATCAGTTTCTTCGTTGGTTTCAGGAATGGATTGAAAATTTTTGTACAAGGAAAAAAGTATTAG
AGAAAGAAGCACAAGAACAATGTAAGAATATTACATGTAATAACGATACTGGAAAAACGAACACTAAATGTACTGAAGCA
TGTAAAAATTATAGTAATTTTATTTTAATAAAAAAAAAGGAGTATGAGTCACTAAATAGTCAATACGATATGAATTATAA
AAAAATAGTAGAACATAAAAATGCCCTAGAATATTTCAAAGATAAATGTAAAAATAATTGTGAATGTCTCTCTAAACATA
TTGATAATGGAAAAAATTGGAAAGAACCATATGAAACTATCGATGACTCAGAACTCATAGGTAAATGTAAATGCAAAAAA
GTTAAACCCAAAACTCCTGACGTAATTCCTGCAGGGGCAACTGAAACAAAAGAAAAAGATACACCTCATGCACCTGAAAA
ACCTCAACAACCCCCACAACCCTTACCACCATCCGACGAACCCTTTGACCCGACCATCCTACAAACGACCATTCCTTTTG
GAATCGCTTTGGCATTAGGATCGATAGCGTTTCTTTTCATGAAAaaaaaacCgaaatctccagttgacctcttacgtgta
ctgaatatcccgaaacgagattatgaaatgcctacgttgaaatcaaaaaatcgatatataccctatgctagtgatcgata
taaaggtaaaacatacatttatatggaaggagatagcagtggagatgaaaaatatgcatttatgtctgatactactgatg
taacttcctcagaaagtgaatatgaagaattggatattaatgatatatatgtaccaggtagtcctaaatataaaacattg
atagaagtagtattggaaccatcaaaaagtaatggtaacacactaggtgatgatatggtacctaccactaatacatttac
agatgaggaatggaatgaattgaaacatgattttatatcacaatatgtacaacgtgaaccactggatgtaccacaatatg
atgaatcaacacagttaccaatgaatatagtaggtaacgttttagatgatggtatggatgaaaaaccttttattacttct
attcatgatagagatttatatactggagaagaaattagttataatattaatatgagtactaatagtatggatgatccaaa
atatgtatcaaataatgtatattctggtatagatttaattaatgatacattaagtggtgatcgtattgatatatatgatg
aattattgaaacgaaaagaaaatgaattatttggtacaaatcatgtgaaacaaacaagtatacatagtgttgccaaacta
acaaatagtgaccccatccacaaccaattagatttgttccatacatggttagatagacatagagatatgtgcaatacgtg
gaataccaaggaagaattattagataaattgaatgaacaatggaataaagataatgatggtggtgatataccaaatgata
acaaaaagttgaatacggatgtttcgtttgaaatagatatggatgaaactaaaggaaagaaggaatttagtaatatggat
actatcttggatgatatggaagatgatatatattatgatgtaaatgatgaaaacccatctgtggataatatacctatgg
atcataataaagtagatgtaccaaacaaagtacatgttgaaatgaaaatccttaataatacatccaatggatcgttgga
acaagaatttcccatatcggatgtatggaatatataa
命名为TM284var1的PfEMP1变体具有以下氨基酸序列：
SEQ ID NO：3
MTSKRGNRTVINLSVTDVLEKIALQIYKEENEKKIPHESELTGTLWKAQFSDGLSGSFGDVRSGPSNSCNLHHKYYTNIK
NGYPPARNPCDGRNEKRFSNEGEAECGSDKIRVIGKGDGTACVPFRRQNMCDKNLEYLINKNTKTTHDLLGNVLVTAKYE
GASIVAKHPHKDTSEVCTALARSFADIGDIVRGRDMFLPNKDDKVQKGLREVFKKIHDNLSSSVKPHYKDDGSGNYVKLR
EDWWAINRKEVWNALTCEAPQSVHYFIKTSHGTRGFTSQGKCGRNETNVPTNLDYVPQYLRWFDEWAEEFCRLRNHKLQN
VKKECRGENIGDKYCSGDGEDCEKIVRQDYNIRSDFLCPSCKKECTNYKKWIDTKQGEFNKQKKKYEKEIKKVESNSDTT
YDKKVYKILKEMYPLNSEFVATLKEAPYCNNNNVDGTIDFNKPDDTFSRSDYCKSCPVFGVICTRGECTEVKEDTCSKMN
VKVPKKITNKEDPINIGILVSDDRVSVIPNELENVCKDTGLFKGIRKDQRSCNYLCNLDVCDLSHNKNNTHIDKRISIRV
LFKRWLEYFFKDYSKLKKKLNSCTNNGEKSICINKCKKKCECVGKWVEEKRTEWEKVRKRYFSQYNVDDSQKSYTVKSIV
NGNVDRSDINNSLDESEDIETLKESDTCYNSDSAKKQKCEKNDVITILIDRLKKKIDDCEKQHDNRTNQICCDELPESKE
DDEDEEEEGKKKKNAKQLEVTNEKKEQEDKNLFQVCQKMKKVITDNNGERIRNQRCNEKTDRKWDCSTNEIPTNHTGACM
PPRRISLCIRPLRYLVDNGGKKSIDDYKNAFTECASIETYLLWQKYKRTNGAEDKLKDGEIPNDFLRIMYYTYGDYRDIF
LGTDISKNPNIKNISNKVKNILKFKKSMDESGKNQDENAKVQSSWDEHKRDIWKGMLCGLTYDIQNEKKDILKILNNKYN
YPCDLEVFASKPQFFRWFIEWAEDYCRKYNDEYEKLQTACSTVDCSKDPTDSEKWKCKNACDNFKTFVEGWKKQYDSQKN
KFNKIKIEANIKNTYKGIENKEAYVFLSEECKGKCDCIKYKTDYDTNANDPKGFDTPPKEQKDMCECVLRKKSACENNEV
PKGRTQSQMTCADLKNESPSKGNNNTGNNHKETITFSCNKSNLIGLGAQWKKITDDGLYASPRTRQLCLKHVIDIGRNNT
KKNNITEEEFINVLQKDAYAEGKLLYMYYNSNGKISIFQNGEKLKLDDIEKHTHEAMKRSYADYGDLIKGTTKYTQYNDY
NKISDIINWWTKKKNSASINDIYEREEFWEKYRADVWNAMLCGYKDVSNKTFDGNDDMCNLPNTDKEEEFLRWFKEWNEN
FCITQIKRAEKLKNECNNFNCSSIKSKKDDIKSKCVKAVINYKKFVKESKTQYEDQKRTYNERHNKTNKDIPTFLKDNCI
HKNCDCISIKFNHKDNWEKSFFESLDSSDIKNKCECLKLEEESNTTERYISKEDPQYHPEYKGDGKVNYKYEKGKPKALP
SIYPLNCAEKVADELRMYAENSLDTNTKLKAKISKSIDTNEQNATNDEIDCNIYNNISNGQKNTCEHNGNTFHDKDEWDC
NKGTNKLYENDICLPPRRKHMCTKQLENISTASITTTDDLLKEVLITAVNEGKRLKQQWEKTENEAQKKKHFLCDAMKYS
FADLADIIRGTDIWKGNREQQKIQERLVKIFRNIYDNLEKDEYEKYKYGTKYQNLRSAWWDAHRKKIWNAMTCSAPGDFL
FVKRGKGDGSDIEFLTFSEHKKCGHDKEPPVYDYVPQILRWITEWSEHFCELQEKNYYLLKEKCADYIQKDSKPIDDSHN
IKCNTCKTKCEEYSKFIKKWNSQYINLEKKFKELYDEANNTKSYEELYRIGKPSHRNHYEDENLIQFLQNVKSECNEPNT
VDKYLMYTSDCRRVKFSNTIDTNVNKPTADVTHNTINGPSSNLPVVTETNIKNELREYAFLETPEGYGNACKCKGPEPLD
RCPENDNISNYCNDFVSVPECTAKIYKDEIDHWNNANVKFKTSINNGVLVPPRRSHICLKNMITKNYDKKKNGMEKFKTD
LLQVAYNEGYFLCQKYDKQPRDVLEAMKYTFADIADIVKGRDMINKDISAKLRKLLDIKVEPKAPRKWWKYNKAHVWHAM
LCGYRKGGGTITNDECNVPFEEYTYQFLRWFQEWIKKGCTGQQKLYDDVWTKCSSANCNRDDGTISLPECESSCVQYKNY
ITRKRQEYRSLNHQYNMNFKEQKAQGMKATQYIDDKCNSKCDCLIKYIDREKEWTNIYDSLENNDLKNKCDCKQIKPKRH
PKEVNPEEEPANSEPDYIVPLVPQKPSTPEVPPPPPPPLPTPSDEPFNRDILEKTIPFGIALALCSIAFLFIKKKPKSSV
DLLRVIDIHKGDYDIPTLKSKNRYIPYKSAQYKGKTYIYMEGDSDSGHYYEDTTDITSSESEYEEMDINDIYVPGSPKYK
TLIEVVLEPSKRDTQNDIPSDNTPSYKLTDEEWNQLKHDFISQYLPNTEPNNNYRSGNSPTNTNNTTTSHDNMGEKPFIT
SIHDRDLYTGEEISYNINMSTNTNNDIPKYVSNNVYSGIDLINDTLSGNKHIDIYDEVLKRKENELFGTNHPKNTSNNSV
AKLTNSDPIMNQLDLLHKWLDRHRDMCDKWNTKEELLDKLNEQWNKDNDVGGDISTSNGNKTLNTNVSIEIDMDETKGKK
EFSNMDTILDNIEDDIYYDVNDENPSMDDIPMDHNKVDVPKKVHVEMKILNNTFNGSLEPEFPISDVWNI
此外，TM284var1PfEMP1变体由以下核酸序列编码：
SEQ ID NO：4
ATGACGTCAAAACGTGGAAATCGAACTGTAATTAATCTTAGTGTAACGGATGTTCTAGAAAAAATTGCATTACAAATATA
TAAAGAGGAAATGAAAAAAAGATTCCACATGAAAGTGAATTGATAGGCACATTATGGAAAGCACAATTTTCTGATGGCT
TGAGTGGTTCATTTGGTGATGTAAGGTCTGGTCCTTCAAATTCCTGCAATCTTCATCACAAATACTATACTAATATAAAG
AATGGATATCCACCCGCAAGGAATCCTTGCGATGGTAGAAATGAAAAACGTTTTTCAAACGAAGGTGAAGCAGAATGTGG
TAGTGATAAAATAAGGGTTATTGGAAAAGGTGATGGTACAGCATGTGTACCATTTAGAAGGCAAAATATGTGTGATAAAA
ATTTAGAATATTTGATTAATAAAAACACGAAAACTACTCATGATTTATTGGGAAATGTATTAGTTACAGCAAAATATGAA
GGTGCCTCTATTGTTGCAAAGCATCCACATAAAGATACTTCAGAAGTATGTACTGCACTTGCACGAAGTTTTGCAGATAT
AGGTGATATTGTAAGAGGAAGAGATATGTTTTTACCTAATAAGGATGATAAAGTACAAAAAGGTCTAAGAGAAGTTTTCA
AGAAAATACATGATAATTTGTCATCTTCCGTAAAACCACATTACAAAGATGATGGATCTGGAAATTACGTCAAATTAAGA
GAAGATTGGTGGGCAATTAATAGAAAGGAGGTATGGAATGCATTAACATGTGAAGCTCCACAAAGTGTTCATTATTTTAT
AAAAACGTCACATGGAACAAGAGGTTTTACAAGTCAAGGAAAATGTGGCCGTAATGAAACAAACGTTCCTACAAATCTTG
ACTATGTTCCTCAATATTTACGCTGGTTCGATGAATGGGCAGAAGAGTTTTGTCGATTAAGGAATCATAAGTTACAAAAC
GTTAAGAAAGAGTGTCGTGGAGAAAATATAGGTGACAAATATTGTAGTGGTGATGGTGAGGATTGTGAAAAGATTGTTCG
TCAGGATTATAATATTCGTTCGGATTTTTTATGTCCGAGCTGTAAAAAGGAATGTACAAATTATAAAAAATGGATAGACA
CAAAACAGGGAGAATTTAATAAACAGAAAAAAAAATACGAAAAAGAAATTAAAAAAGTTGAAAGTAATTCTGATACCACA
TATGATAAAAAAGTTTATAAAATTCTAAAAGAAATGTACCCTTTAAATTCAGAATTTGTAGCAACATTAAAAGAAGCTCC
CTATTGTAATAACAATAATGTAGACGGTACAATAGATTTTAATAAACCAGATGATACATTTTCTCGTTCAGACTATTGTA
AATCATGTCCTGTATTTGGTGTTATTTGTACAAGAGGTGAGTGTACTGAAGTTAAGGAAGATACATGTAGTAAAATGAAT
GTTAAGGTTCCGAAAAAAATTACAAATAAGGAAGATCCTATTAATATAGGTATTCTTGTTAGTGATGACAGAGTAAGTGT
AATTCCAAATGAATTAGAGAATGTTTGCAAAGATACAGGTCTCTTTAAAGGTATTAGAAAAGATCAACGGTCATGTAATT
ACTTATGTAATTTAGATGTATGTGACCTGAGTCATAATAAAAACAATACACATATAGATAAACGTATTTCTATTAGAGTA
TTGTTTAAACGTTGGTTAGAATATTTTTTTAAAGATTATAGTAAATTAAAAAAAAAACTGAATTCATGTACAAATAATGG
AGAAAAATCCATATGTATAAATAAATGTAAAAAAAAATGTGAATGTGTGGGAAAATGGGTAGAAGAAAAAAGGACAGAAT
GGGAAAAAGTAAGAAAGCGTTACTTCAGTCAATATAATGTTGATGATTCACAAAAATCGTATACAGTGAAAAGTATTGTA
AATGGAAATGTAGATCGTAGTGATATTAATAATTCATTGGATGAGAGCGAAGATATAGAAACGTTGAAAGAATCAGATAC
ATGTTATAATTCTGATAGCGCAAAAAAACAAAAATGTGAAAAAAACGACGTCATAACTATTTTAATTGATAGACTTAAAA
AAAAAATTGATGATTGTGAAAAGCAACATGATAATAGAACTAATCAAATTTGTTGTGATGAGTTACCTGAAAGTAAAGAA
GATGATGAAGATGAAGAGGAAGAAGGGAAAAAGAAAAAAAATGCAAAGCAATTGGAAGTAACTAATGAGAAAAAAGAACA
AGAAGACAAAAACTTGTTTCAAGTGTGCCAAAAAATGAAGAAGGTAATTACGGATAATAATGGAGAAAGAATCAGAAACC
AGCGTTGCAATGAAAAAACTGATAGAAAATGGGATTGTAGTACTAATGAAATTCCTACAAATCATACTGGAGCTTGTATG
CCACCAAGAAGAATATCATTATGTATTCGGCCTTTACGATATTTGGTAGATAACGGAGGAAAAAAAAGCATAGATGATTA
TAAAAATGCGTTTACTGAATGTGCATCAATAGAAACGTATTTGTTATGGCAAAAATACAAAAGAACTAATGGAGCAGAAG
ATAAATTAAAAGATGGAGAGATTCCAAATGATTTTCTAAGAATAATGTATTATACATATGGAGATTATAGAGATATATTT
TTGGGAACAGATATTTCTAAAAATCCTAATATTAAAAAATATATCAAATAAGGTTAAAAATATATTGAAATTCAAAAAGAG
CATGGACGAATCAGGTAAAAATCAGGATGAAAATGCGAAAGTTCAATCTTCGTGGGATGAACATAAAAGGGACATATGGA
AAGGAATGTTATGTGGATTAACCTATGATATCCAAAATGAAAAGAAAGATATTCTCAAAATTCTCAATAACAAGTACAAT
TACCCATGCGATCTTGAAGTGTTTGCATCTAAACCACAATTTTTTCGTTGGTTTATTGAATGGGCAGAAGATTATTGTAG
AAAATACAATGATGAGTATGAAAAATTACAGACGGCGTGTAGTACGGTAGATTGTAGTAAAGACCCTACTGATTCTGAAA
AACAAAAATGTAAAAACGCTTGTGATAATTTCAAAACATTCGTTGAAGGTTGGAAAAAACAATATGATAGTCAAAAAAAT
AAATTTAATAAGATAAAAATTGAAGCTAATATAAAGAATACATATAAAGGTATAGAAAAATAAAGAAGCTTATGTATTTTT
AAGTGAAGAATGTAAAGGAAAATGTGACTGTATAAAATATAAAACAGACTATGATACAAATGCAAATGATCCTAAAGGTT
TCGATACACCACCGAAAGAACAAAAAGATAATTGTGAATGTGTGTTGAGAAAAAAATCGGCATGTGAAAATAATGAAGTA
CCTAAAGGTCGAACACAATCTCAAATGACATGTGCTGATCTAAAAAATGAATCTCCTAGTAAAGGAAATAATAATACTGG
GAACAATCATAAAGAAACCATTACATTCTCGTGCAATAAAAGCAATTTAATTGGCTTAGGAGCACAATGGAAAAAAATAA
CTGATGATGGTTTATATGCTTCTCCAAGAACTCGACAATTATGTTTGAAACACGTAATAGACATAGGAAGGAATAATACT
AAAAAAAACAATATAACAGAAGAAGAGTTCATTAATGTATTACAAAAAGATGCATATGCTGAAGGTAAATTACTTTATAT
GTACTACAACAGTAATGGTAAAATATCTATATTTCAAAATGGCGAAAAGTTAAAATTGGATGACATAGAAAAACATACAC
ATGAAGCCATGAAAGATCATATGCTGATTATGGTGATTTAATTAAAGGAACAACAAAATATACACAATACAATGATTAT
AACAAAATTAGCGATATTATAAACGTTGTGACTAAAAAGAAAAATTCCGCTTCAATTAATGATATTTATGAGCGTGAAGA
ATTTTGGGAAAAATATAGAGCTGATGTATGGAATGCTATGTTATGTGGTTACAAAGATGTATCAAATAAAACATTTGATG
GAAACGATGATATGTGTAACTTACCAAATACTGATAAGGAGGAAGAATTTCTCAGATGGTTTAAGGAATGGAATGAAAAT
TTTTGTATTACACAAATAAAACGCGCAGAGAAATTAAAAAATGAATCCAATAATTTTAACTGTTCTTCCATTAAGAGTAA
AAAGGACGATATTAAATCTAAATGTGTAAAAGCATGTATAAATTATAAAAAGTTTGTAAAGGAATCAAAAACGCAATATG
AAGATCAAAAGAGAACATACAATGAAAGACATAATAAGACAAATAAGGATATTCCTACTTTTTTGAAAGATAATTGTATT
CATAAAAACTGTGATTGTATTTCTATAAAATTTAATCATAAAGATAATTGGGAAAAAATCTTTTTTTGAGAGTTTAGATAG
TTCCGATATTAAAAATAAGTGTGAATGTTTAAAACTTGAAGAAGAGTCAAATACTACAGAACGATATATTTCTAAAGAAG
ACCCACAATATCATCCAGAATATAAAGGTGATGGAAAGGTTAATTATAAATATGAGAAAGGAAAACCAAAAGCTCTTCCT
TCTATATACCCTTTGAACTGTGCTGAAAAGGTTGCTGACGAGTTACGAATGTATGCTGAAAATTCTTTGGATACTAATAC
TAAATTGAAGGCAAAAATATCAAAAAGTATAGATACAAATGAACAAAATGCTACGAATGATGAGATTGATTGCAATATTT
ACAATAATATATCTAATGGACAGAAAAATACTTGTGAACATAATGGAAACACTTTTCATGATAAGGATGAATGGGATTGT
AACAAAGGAACAAATAAATTATATGAAAATGATATTTGTTTACCTCCAAGAAGAAAACATATGTGTACAAAACAACTAGA
AAATATCAGCACGGCATCAATTACAACTACGGATGATTTACTGAAAGAAGTGTTAATTACAGCTGTAAATGAAGGAAAGC
GTTTAAAACAGCAATGGGAGAAAACAGAAAATGAAGCACAAAAAAAGAAACACTTTTTATGTGATGCTATGAAATATAGT
TTTGCTGATTTAGCTGATATTATAAGAGGAACAGACATATGGAAAGGAAATAGAGAGCAACAAAAAATACAAGAAAGATT
AGTAAAAATCTTCAGAAATATATATGATAACTTAGAGAAGGATGAATATGAGAAATATAAATATGGTACAAAATATCAAA
ATTTAAGATCGGCTTGGTGGGATGCACATAGAAAGAAAATATGGAATGCTATGACATGTTCAGCACCAGGTGATTTCCTT
TTTGTAAAAAGAGGAAAAGGAGATGGAAGTGACATCGAATTTTTAACTTTTTCAGAACATAAAAAATGTGGACATGATAA
AGAACCACCTGTTTATGATTATGTGCCTCAAATACTTAGATGGATTACAGAATGGTCTGAACATTTTTGTGAATTGCAAG
AAAAAAATTATTATCTTCTAAAAGAAAAATGTGCTGATTATATACAAAAGGATTCCAAACCTATTGATGATTCACATAAT
ATAAAATGTAATACTTGTAAGACGAAATGTGAAGAATATAGTAAATTTATTAAGAAATGGAACTCTCAGTATATAAATCT
GGAAAAAAAATTTAAAGAATTATATGACGAGGCAAATAATACTAAAAGTTATGAAGAACTTTACAGAATTGGGAAGCCTT
CACACAGAAACCACTATGAAGATGAAAACCTGATTCAGTTCTTACAAAATGTAAAATCTGAGTGTAACGAACCTAACACT
GTTGATAAATATCTTATGTATACAAGTGATTGTAGAAGAGTTAAATTTTCTAATACTATCGATACAAATGTTAACAAACC
TACTGCGGATGTTACTCATAATACTATTAATGGTCCTAGTAGTAACCTCCCAGTTGTTACTGAAACAAATATTAAAAATG
AACTAAGAGAATATGCTTTCTTAGAAACACCAGAAGGATATGGTAATGCTTGTAAATGTAAGGGTCCTGAACCATTAGAT
CGTTGCCCTGAAAATGATAATATTAGTAATTACTGTAACGATTTTGTTAGTGTTCCTGAATGCACAGCAAAAATATATAA
AGATGAAATTGATCATTGGAATAATGCAAATGTAAAATTTAAGACATCAATAAATAACGGTGTGTTAGTTCCTCCAAGAA
GAAGTCATATATGTCTTAAGAATATGATAACAAAAAACTATGATAAAAAGAAAAATGGGATGGAAAAATTTAAAACTGAT
CTTCTACAGGTTGCATACAATGAAGGTTATTTCCTATGTCAAAAATATGATAAGCAACCTAGAGACGTATTGGAAGCGAT
GAAATACACATTTGCAGATATTGCTGATATAGTAAAAGGTAGAGATATGATTAACAAAGATATATCCGCAAAACTACGAA
AATTATTGGATATTAAGGTTGAACCCAAAGCTCCTAGAAAATGGTGGAAATACAATAAAGCACATGTATGGCACGCTATG
TTATGTGGATATAGAAAAGGTGGAGGAACAATTACGAATGATGAGTGTAATGTTCCAGATGAAGAGTACACTTATCAATT
TCTTCGATGGTTTCAAGAATGGATTAAAAAATTTTGTACTGGACAACAAAAATTATATGACGACGTACAAACGAAATGTT
CATCTGCCAATTGTAATAGAGATGATGGGACGATTAGCCTACCTGAATGTGAAAGTTCTTGTGTTCAATATAAGAATTAC
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GGACAAACATATATGACTCATTGGAAAATAATGATCTGAAAAATAAATGTGATTGTAAGCAAATTAAACCCAAACGTCAT
CCAAAAGAAGTAAATCCTGAGGAAGAACCTGCTAATTCTGAACCCGATTACATTGTTCCCCTTGTACCACAAAAACCTTC
AACACCAGAGGTACCCCCACCTCCTCCTCCACCTTTACCAACCCCTTCGGACGAACCATTCAATCGTGACATTCTGGAAA
AAACCATTCCTTTTGGAATTGCATTGGCATTATGTTCGATAGCTTTTCTCTTCATAAAGaaaaaacctaaatcatctgtt
gacctcttgcgagtaattgacatccacaaaggagattatgatatacctacattgaaatccaaaaataggtacataccata
taaaagtgctcaatataaaggtaaaacatacatttatatggaaggagatagtgatagtggacactactacgaagatacaa
ctgatattacttcctccgaaagtgaatatgaagagatggatattaatgatatatatgttcctggtagtccaaaatacaaa
acgttgatagaagttgttctggagccatcaaaaagagatacacaaaatgatatacctagtgataatacacctagttataa
acttacagatgaggaatggaatcaattgaaacatgattttatatcacaatatttaccaaatacagaaccaaataataatt
atagaagtggaaatagtccaacaaataccaataatactaccacgtcacatgataatatgggagaaaaaccttttattact
tctattcatgatagggatttatatactggagaagaaattagttataatattaatatgagtactaacactaataatgatat
tccaaaatatgtatcaaataatgtatattctggtatagatttaattaatgacacattaagtggtaacaaacatattgata
tatatgatgaagtgctaaaaagaaaagaaaatgaattatttggaacaaatcatccgaaaaatacatcaaacaatagtgta
gctaaattaacaaatagtgatccaattatgaaccaattagatttgttacataaatggttagatagacatagagatatgtg
cgataaatggaataccaaggaagaattgttagataaattaaatgaacaatggaataaagataatgatgttggtggtgata
tttccactagtaatggtaataaaacgttgaatactaatgtttcgattgaaatagatatggatgaaactaaaggaaagaag
gaatttagtaatatggatactatcttggataatatagaagatgatatatattatgatgtaaatgatgaaaacccatctat
ggatgatatacctatggatcataataaagtagatgtacctaagaaagtacatgttgaaatgaaaatccttaataatacat
tcaatggatccttggaaccagaatttcccatatcggatgtatggaatatataa
命名为ITvar60的PfEMP1变体具有以下氨基酸序列：
SEQ ID NO：5
MAPKGRSTNEIELSARDVLENIGIGIYNQEKIKKNPYEQQLKGTLSNARFHDGLHKAADLGVIPGPSHFSQLYYKKHTNN
TKYYKDDRHPCHGRQGKRFDEGQKFECGNDKIIGNSDKYGSCAPPRRRHICDQNLEFLDNNHTDTIHDVLGNVLVTAKYE
GESIVNDHPDKKNNGNKSGICTSLARSFADIGDIVRGRDMFKPNDKDAVRHGLKVVFKKIYDKLSPKVQEHYKDVDGSGN
YYKLREDWWTANRDQVWKAITYKAPQDANYFRNVSGTTNAFTSAGKCRHNDNSVPTNLDYVPQFLRWYDEWADDFCRIRN
HKLQKVKDTCQGYNNSGYRIYCSGDGEDCTNILKQNFNIVSDFFCPSCKTECTNYKKWINKKQGEFNKQKKKYEKEINNI
ASNSDNTYDKKVYKTLKSMYPLDTKFVATLKEAPFCNNNNVDGIIDFNKPDDTFSSSTYCDSCPAFGVICENGTCTKVNE
DTCSKMNVQVPKIITNKEDPTNIGILVSDDRVNVIPNELENVCKNTGIFKGIRKDEWSCKYLCNLDVCDLSHNKNNTHID
KRISIRVLFKRWLEYFLKDYSKLKKKLNSCTNNGKESICINECKKKCECVGKWAEEKRKEWEKVRKRFFNQYNVDDSLKS
YEVKTFVNGNVDRSDIKNALNEGENLEALQDSDECIKPHNSKKDTCVKNDVVNILINRLKKKIDDCKIQHDNRTNQICCD
ELPESKEDNEDEEEEGEKKKNSKHLEETKEKKELDDNNFLDLCNNVKKYIEDNNKQISIQHKCNTKGDGNWNDSTKKIDI
QHTGAHMPPRRKSLCIRELRYLVEIGGDKNIDDYKNAFTKCASIETYLLWQKYKKSNRSEEDKLKGGEIPEDFRGIMYYT
FGDYRDIFLGTDISSDGNIKNISNKIKDLMKEKYSKATGHKGENHNSNLQSSWDEHKRTIWKGMLCGLTYGISNEQQKKN
IRKMLNNKYKYPCDLETFSKKPQFLRWFNEWSEDFCKNYKNAIDILKKDCTEADCMNKLVNNREKNKKCKEACEHFKEWI
KGWKNQYEQQRKKFNIDKNVEQKETAYINVNGLEPYEFFQNQYFVGTCECMKNKSESSANNDENIPEAFDEKPKEFKDKC
PCTYDIPEPSETMSCIEKAAFKLRYASEDKIHSKISSKLKGNGSAFSCTNSASDNIFDETSCYKNEFNKTENINSVKASN
MNRFDTNIIWDCDGKTKYEQINLCVPPRRENMCIKGLEHLNRTKHSDNKTLLKELQEIASTEGKGISKNFKQMDRENDDG
ICDAMKYSFADLADIVRGTDNYKNSNGNNNKVEENLKKIFEKIHNINSLKKEYSKDKPDYQRLRSDWWDTNRKEIWKALT
CSARDNNKIYKKGQKNTNNGKNKCGNEEDPPDDDYIPQPFRWLQEWSEHFCRVQYDNLNKLKEECGECNENKNGLACMMN
SNIKDTKCMNCKDACKDYRNMINTWNSQWKKQQEIYKELYNTKNKININKCKVIEFLDKTNDTCHYKHGSAEKFLKESSH
CTDLTFDKTKNSNNIPYAFENPPDGYKVLCGTTYRKSCKKLKKLGMNYTSENKIDLSGENAKWEKLNDLIYVPPRTQQLC
LQPLQTLISRTNKTTKVTEYDFSRALQICAYNEANSLHNYYSKYGKDFVFSAGKSQDTKDEIKTHILENMKRSFADYGNL
IKGKTQYEYNGLNKKLQDYIKTNLKYNGTDRKTGEDLWNKHKSDIWNSMLVGYNEENPSEPLHDKDIRCKLPDNDSEDEF
LRWFQEWFEDFCVIKGILIQNVKDACNFNNCRDANNKSIRSCQKPCVKYKTWVEQRKIEYENQIQKYKNLNNNSNEGKES
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此外，ITvar60PfEMP1变体由以下核酸序列编码：
SEQ ID NO：6
ATGGCACCAAAGGGTAGAAGTACAAATGAAATTGAACTTAGCGCAAGACATGTTTTGGAAAAAATTGGAATAGGAATATA
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据此,本发明涉及由以上述SEQ ID NOS1,2,3,4,5或6给出的序列编码或具有以上述SEQ ID NOS1,2,3,4,5或6给出的序列的PfEMP1抗原。技术人员将理解由显示与本文提供的序列一定程度的同源性或同一性的序列编码的PfEMP1抗原也在本发明的范围内。尤其,由与SEQ ID NOS；1,2,3,4,5或6中任一个显示至少40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,90％,91％,92％,93％,94％,095％,96％,97％,98％或99％同源性/同一性的序列编码的PfEMP1抗原被认为是本发明中具有潜在实用性的PfEMP1抗原。本发明进一步涉及重组或合成产生的由与以SEQ IDNOS:1,2,3,4,5或6给出的那些具有同源性和/或同一性的序列编码的或具有与以SEQ ID NOS:1,2,3,4,5或6给出的那些具有同源性和/或同一性的序列的PfEMP1抗原。
在所有情况下,本发明包括PfEMP1抗原，所述PfEMP1抗原与由以SEQ ID NOS:1,2,3,4,5或6给出的序列编码的或具有以SEQ ID NOS:1,2,3,4,5或6给出的序列的那些相比,包含(i)一种或多种突变–表征为氨基酸/核酸缺失,添加,取代和/或插入的突变和(ii)关于SEQ ID NOS:2,4和/或6的一种或多种保守氨基酸取代–术语“保守取代”包括以具有类似性质的并基本不改变天然(或野生型)蛋白的物理化学性质和/或结构或功能的替代氨基酸取代蛋白或肽的一种或多种氨基酸的行为。当然,技术人员将理解遗传密码子的简并性允许密码子中的一种或多种碱基的取代而不改变一级氨基酸序列。因此,尽管SEQ ID NOS:1,3和5编码特定PfEMP1抗原,但是密码子的兼并性可以用于获得编码相同一级氨基酸序列的变体核酸序列。
技术人员将理解可以使用表达载体和/或系统重组生产本文描述的PfEMP1抗原。在这方面,本发明提供载体,例如包含编码本发明的PfEMP1抗原的核酸序列的细菌表达载体(例如pET或pGEX系统载体)。技术人员将理解编码本发明的PfEMP1抗原的核酸序列可以被密码子优化以保证在特定表达系统中的最大表达。本发明进一步提供转化有本发明的载体的宿主细胞(例如细菌细胞(大肠杆菌))。
在其它实施方案中,本发明提供用于产生人中的免疫应答的药物–所述药物包括选自由HB3var6；TM284var1；和ITvar60组成的组的一个或多个PfEMP1抗原(或其一个或多个片段)。此外,本发明提供产生人中的免疫应答的方法,所述方法包括向人受试者施用免疫原性量的一种或多种PfEMP1抗原(或其片段),所述PfEMP1抗原选自由HB3var6；TM284var1；和ITvar60组成的组。
技术人员将理解术语“片段”包括本文描述的PfEMP1抗原的免疫原性和/或抗原性片段–包括由SEQ ID NOS1,2,3,4,5或6编码的那些。在一个实施方案中,片段可以包含PfEMP1抗原的完整结构域或区域–包括例如,一种或多种Duffy结合样(DBL)结构域。在其它实施方案中,合适的片段可以包含介于约10和n-1个氨基酸–其中“n”是完整PfEMP1抗原的氨基酸总数(HB3var6:n＝3424；TM284var1:n＝2790；ITvar60:n＝2716)。通过举例的方式,PfEMP1抗原性片段可以包含约10,20,50,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2100,2200,2300,2400,2500,2700,2800,2900,3000,3100,3200,3300或3400(相邻的)PfEMP1氨基酸或由约10,20,50,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2100,2200,2300,2400,2500,2700,2800,2900,3000,3100,3200,3300或3400(相邻的)PfEMP1氨基酸组成。在其它实施方案中,适于用于本发明的PfEMP1抗原性片段可以包含能够产生交叉反应性/保护性免疫应答的至少一种表位。
除了鉴定适于产生人中交叉反应性和/或保护性免疫应答的PfEMP1抗原外,本发明人已经进一步鉴定也适于产生人中交叉反应性和/或保护性免疫应答的PfEMP1抗原的特定片段,区域和/或结构域。
因此,在第四个方面,本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(PfEMP1)的Duffy结合样(DBL)结构域，其用于产生人中的免疫应答。
在第五个方面,本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(PfEMP1)的Duffy结合样(DBL)结构域用于制备用于产生人中的免疫应答的药物的用途。
在第六个方面,本发明提供产生人中的免疫应答的方法,所述方法包括向人受试者施用一定量的恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(PfEMP1)的一种或多种Duffy结合样(DBL)结构域的步骤。
如本发明的第一，第二和/或第三个方面中使用的PfEMP1抗原所具有的,第四，第五和第六个方面使用的DBL结构域适于产生交叉反应性和/或保护性免疫应答/抗体。也就是说,由本发明提供的针对PfEMP1DBL结构域产生的免疫应答可以包含对很多不同恶性疟原虫株的PfEMP1抗原显示一定程度的特异性,选择性和/或亲和力的抗体。
在一个实施方案中,用于本发明的第四，第五和/或第六个方面的DBL结构域是选自由以下组成的组中的一种或多种:
(i)NTS-DBL1α结构域；
(ii)DBL4ε结构域；和
(iii)(i)和/或(ii)的(免疫原性/抗原性)片段。
在一个实施方案中,本发明的第四，第五和/或第六个方面的NTS-DBL1α结构域源自PfEMP1变体HB3var6,TM284var1和/或ITvar60。在一个实施方案中,用于本发明的第四，第五和/或第六个方面的NTS-DBL1α结构域源自HB3var6,和/或TM284var1。
在其它实施方案中,DBL4ε结构域获自PfEMP1变体ITvar60。
鉴于上述情况,本发明提供包含选自由以下组成的组的一种或多种PfEMP1DBL结构域的用于用途的抗原,用途和方法:
(i)PfEMP1变体HB3var6的NTS-DBL1α结构域；
(ii)PfEMP1变体TM284var1的NTS-DBL1α结构域；
(iii)PfEMP1变体ITvar60的DBL4ε结构域；和
(iv)上述(i)-(iii)中任一个的(免疫原性/抗原性)片段。
应该理解，所有对DBL结构域的引用包括DBL结构域片段。如上文定义的,用于本发明的DBL片段可以是免疫原性的和/或抗原性的，并且因此能够产生人中保护性/交叉反应性免疫应答。换句话说,DBL片段可以能够产生(raising)(或产生(generating))与当宿主被施用完整DBL抗原时产生的免疫应答基本上类似或相同的宿主免疫应答。适于使用的DBL结构域片段可以包括包含完整DBL序列的10,20,30,40或50个(优选相邻的)氨基酸或由完整DBL序列的10,20,30,40或50个(优选相邻的)氨基酸组成的那些。在一个实施方案中所述片段可以包含从约10个氨基酸到约n-1个氨基酸的任意数量的DBL结构域氨基酸或由从约10个氨基酸到约n-1个氨基酸的任意数量的DBL结构域氨基酸组成,其中n是相关DBL结构域的氨基酸总数。
为了方便起见,本说明书中描述的不同PfEMP1抗原,其突变体/变体,片段和结构域应该共同被称为“PfEMP1抗原”。具体来说,以下被视为根据本发明的PfEMP1抗原:
(i)PfEMP1(包括如上文定义的突变体或其序列变体)；
(ii)结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMP1；
(iii)PfEMP1变体HB3var6；
(iv)PfEMP1变体TM284var1；
(v)PfEMP1变体ITvar60；
(vi)PfEMP1DBL结构域；
(vii)NTS-DBL1α结构域；
(viii)DBL4ε结构域；
(ix)PfEMP1变体HB3var6的NTS-DBL1α结构域；
(x)PfEMP1变体TM284var1的NTS-DBL1α结构域；
(xi)PfEMP1变体ITvar60的DBL4ε结构域；和
(x)(i)-(ix)中任一个的(免疫原性/抗原性)片段。
技术人员将理解，PfEMP1抗原,片段和/或结构域可以找到特别的应用，如用于产生免疫应答的疫苗。虽然对疟疾的免疫性可以天然形成,但需要对疟疾寄生虫(例如,恶性疟原虫)的重复暴露。实际上，不希望受理论限制，本发明部分基于以下发现：在从重症(脑)疟疾中恢复的儿童中检测到针对PfEMP1抗原的抗体–此外本发明人注意到这些抗体对本文描述的特定PfEMP1抗原(即PfEMP1变体,HB3var6；TM284var1和ITvar60)显示一定程度的特异性。因此,PfEMP1变体HB3var6；TM284var1和ITvar60可以代表典型的疫苗候选物。
当然,来自世界上疟疾不是问题的区域(例如欧洲)的年轻人和人中,天然免疫的水平低，因为存在对疟原虫的暴露不足。此外，在对疟原虫属(例如恶性疟原虫)的低免疫性/无免疫性的人中,感染可以造成重症疟疾。本领域技术人员将理解，重症疟疾的情况可以导致继发性并发症，包括死亡，昏迷(脑疟疾),呼吸困难,低血糖和严重贫血。因此,不经常暴露于疟疾寄生虫的儿童和/或旅客易于发展疟疾和/或重症疟疾。
由本发明提供的疫苗可以用于产生儿童中免疫应答,其中所述免疫应答针对疟疾和重症疟疾的发展给予保护。在其它实施方案中,本发明提供可以用于在很少暴露于疟疾或未曾暴露于疟疾的人(这可以包括,例如来自世界上不存在疟疾的那些区域的旅客)中产生免疫应答的疫苗。同上,通过使用本发明提供的疫苗产生的免疫应答可以针对疟疾和重症疟疾的发展提供保护。
在第七个方面,本发明提供作为组合物的本发明的PfEMP1抗原，所述组合物包含药学上可接受的稀释剂,载体和/或赋形剂。在一个实施方案中,本发明的组合物可以是无菌的。
可以配制或制备组合物用于肠胃外施用–包括,例如通过皮下,皮内，肌肉内和/或静脉内注射。在一个实施方案中，本发明的组合物可以包含根据已知的工艺使用合适的分散、润湿和/或悬浮剂配制的含水的或含油的悬液。在这方面,技术人员将理解可接受的载体，稀释剂和/或赋形剂可以包含1,3-丁二醇,水,林格溶液,和等渗氯化钠溶液。此外，常规使用无菌的，不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单酸甘油脂或甘油二酯。此外,脂肪酸(如油酸)用于制备根据本发明的可注射组合物。
在一个实施方案中,由本发明提供的组合物和疫苗可以进一步包含一种或多种佐剂。技术人员将理解术语“佐剂”可以包括任何增强或促进免疫的宿主对疫苗或免疫原性组合物的抗原的免疫应答的试剂。合适的佐剂可以包括明矾和/或弗氏佐剂。
由本发明提供的组合物和/或疫苗可以通过单个或多个剂量的有效量施用。优选将两个或更多个剂量施用预定的时期。
通过举例的方式,可以在施用初始疫苗剂量(初次免疫)之后，在初次免疫后的2,3,4,5,6,7,8,9和/或10周间隔给予一次或更多次加强剂量(二次免疫)。
本发明考虑了其它施用模式并且包括鼻内，腹膜内,鞘内，直肠，输注和肺内施用。施用还可以通过滴鼻剂，气溶胶，通过皮肤或膜表面的输注或摄取。
在第八个方面,本发明提供包含PfEMP1抗原的疫苗,其用于治疗或预防疟疾或重症疟疾。在一个实施方案中,本发明的疫苗可以预防，限制或抑制重症疟疾的发展。技术人员将理解可以预防地施用疫苗以在易感群体中预防疟疾或重症疟疾的发展。易感人群可以包含儿童或青少年和/或不常规，经常暴露于疟疾寄生虫的那些(例如欧洲游客)。
在第九个方面,本发明提供包含PfEMP1抗原的疫苗在制备用于治疗或预防疟疾和/或重症疟疾的药物中的用途。
由本发明提供的PfEMP1抗原可以与其它抗原,例如其它疟原虫(恶性疟原虫)抗原和/或其它细菌或病毒抗原组合以获得组合疫苗以使用。
在第十个方面,本发明提供治疗或预防疟疾/重症疟疾的方法,所述方法包括向人受试者施用疫苗,所述疫苗包含免疫原性量的PfEMP1抗原。
在第十一个方面,本发明提供本文描述的一种或多种PfEMP1抗原,其用于诊断或检测人受试者–尤其儿童(即年轻人或青少年人受试者)中的疟疾和/或重症疟疾。由本发明第十一个方面提供的诊断过程可以包括检测由被怀疑患有疟疾/重症疟疾，或被疟原虫(例如恶性疟原虫)感染的受试者提供的样品中PfEMP1抗原水平的步骤。技术人员将理解可以通过以下方式检测PfEMP1抗原的水平：免疫学技术，如ELISA(使用对预定的PfEMP1抗原显示亲和力,特异性和/或选择性的抗体),免疫印迹,SDSPAGE和/或基于PCR的技术(其探测样品的恶性疟原虫核酸–尤其,编码PfEMP1抗原的那些序列的水平)。
在第十二个方面,本发明提供对本文描述的PfEMP1抗原中的一种或多种显示一定程度的亲和力,特异性和/或选择性的抗体。不希望受理论限制,破坏玫瑰花结的干预可以是对重症疟疾的有价值的辅助治疗。通过举例的方式,对本文描述的PfEMP1抗原中的一种或多种显示亲和力,特异性和/或选择性的抗体,可以用于疏通微血管中阻塞的血流(其是由形成玫瑰花结的寄生虫引起的主要病理事件)。此种类型的“破坏玫瑰花结”干预可以类似于卒中和心脏病发作后使用的破坏凝块的药物,以移除由形成玫瑰花结的细胞引起的对微血管血流的梗阻,并恢复正常组织氧合。
术语“抗体”包括多克隆抗体以及单克隆抗体并包括结合抗原和/或表位的抗体片段，比如,例如,Fab,Fab2,scFv,VH结构域和/或VL结构域片段。对蛋白/肽序列特异的多克隆/单克隆抗体的生产和分离是本领域中常规的,并且进一步信息可以在例如“Basic methods in Antibody productionand characterisation”Howard&Bethell,2000,Taylor&Francis Ltd中找到。本文描述的抗体可以缀合于可检测部分，比如,例如,化学发光和/或荧光部分。本文描述的抗体可以用于诊断过程，例如,检测样品中恶性疟原虫,或诊断人中疟疾或重症疟疾(如由恶性疟原虫引起的)。任何诊断过程可以包括将由人受试者提供的样品与本发明的抗体接触–检测到结合于PfEMP1抗原的抗体表示样品由感染有恶性疟原虫寄生虫的人提供。术语“样品”可以指由人受试者提供的任何生物材料和/或流体并且可以包括,例如,血液,血清,血浆,汗液,唾液和/或组织活检的样品或细胞样品。
由本发明提供的抗体可以进一步用于被动免疫方案以治疗或预防疟疾和/或重症疟疾。因此,本发明的一个实施方案提供根据本发明的第十二个方面的一种或多种抗体，其用于治疗和/或预防疟疾/重症疟疾。
因此,本发明的第十三个方面提供对本文描述的PfEMP1抗原显示特异性,选择性和/或亲和力的抗体,其用于治疗或预防疟疾和/或重症疟疾。本发明进一步提供对PfEMP1抗原显示特异性,选择性和/或亲和力的抗体在制备用于治疗或预防疟疾的药物中的用途。在更进一步的方面,本发明提供治疗或预防疟疾的方法,所述方法包括向需要其的人受试者施用治疗有效量的对PfEMP1抗原显示特异性,选择性和/或亲和力的抗体。
在第十四个方面,本发明提供能够识别PfEMP1和未感染的红细胞间相互作用的一种或多种化合物,其用于治疗和/或预防疟疾/重症疟疾。通过举例的方式,所述化合物可以包含小分子(例如蛋白/肽,核酸碳水化合物,有机/无机分子)或对由本发明提供的PfEMP1抗原,片段,表位和/或结构域中的一种或多种显示亲和力,选择性和/或特异性的抗体。此外,本发明可以延伸至提供小分子，所述小分子可以用在用于治疗或预防玫瑰花结形成的方法和药物中。
详细描述
现在将参考下图详细描述本发明，所述图显示:
图1:恶性疟原虫形成玫瑰花结的寄生虫的关键表面抗原(类型APfEMP1变体)的鉴定和用于免疫的重组蛋白的生产。a)来自恶性疟原虫形成玫瑰花结的实验室株的显著表达的变体的PfEMP1结构域结构。显示先前描述的形成玫瑰花结的变体ITvar9[12,20]用于比较。结构域类型基于保守基序[6,45]。NTS:N-末端部分；DBL:Duffy结合样；CIDR:富半胱氨酸结构域间(InterDomain)区域；ATS:酸性末端部分；TM:跨膜区域。*IT分离株最初来自巴西,然而在20世纪80年代初期的交叉污染之后,现在的IT/FCR3株被认为是源自东南亚的[65]。b)来自同基因型的形成玫瑰花结的(R+)和不形成玫瑰花结的(R-)寄生虫的RNA的RNA印记，其用对于各个株的来自玫瑰花结-特异性变体的PfEMP1结构域(R+DBL探针,高严格度)和用外显子II探针(中等严格度)(其检测所有var基因)探测[44]。箭头指示主要的玫瑰花结-特异性变体。通过用溴化乙锭(Et Br)染色确认R+和R-RNA的相等上样量。c)在大肠杆菌中生产重组NTS-DBLα结构域以免疫兔。1:TM180var1,2:Muz12var1,3:TM284var1,4:ITvar60,5:HB3var6。M:分子量标记；R:还原的；NR:非还原的。
图2:针对PfEMP1的抗体识别活的感染的红细胞表面,并且显示恶性疟原虫形成玫瑰花结的实验室株之间的交叉反应性。a)用针对ITvar60的抗体(25μg/ml)就同源寄生虫(IT/PAR+)测试的免疫荧光测定(IFA)。左图:显示感染的红细胞位置的DAPI染色。右图:活的感染的红细胞表面上的点状荧光。b)显示与未免疫的兔IgG对照相比，ITvar60的抗体针对IT/PAR+寄生虫的滴定的流式细胞术。滴定终点(end titre)(这里定义为通过IFA/流式细胞术，感染的红细胞中多于50％是阳性的最低浓度)为0.1μg/ml。c)针对如表明的具有各种不同粘附表型的恶性疟原虫实验室株测试PfEMP1抗体(从400μg/ml开始总IgG的四倍稀释)。各个抗体:寄生虫组合的滴定终点(如上文定义的)在每个矩形内显示。同源抗体:寄生虫组合以粗体标出。阴性对照是未免疫的兔IgG,和针对来自不形成玫瑰花结的类型A PfEMP1变体(HB3var3,由选择用于结合人脑内皮细胞的不形成玫瑰花结的寄生虫HB3-HBEC表达)的NTS-DBLα的抗体。*The HB3R+寄生虫包含不同于表达HB3var6的细胞的表达HB3var3的感染的红细胞的亚群,表S1)。
图3:针对PfEMP1的抗体在恶性疟原虫形成玫瑰花结的实验室株中玫瑰花结抑制和诱导吞噬作用中显示交叉反应性。a)玫瑰花结抑制测定以确定PfEMP1抗体对同源和异源的形成玫瑰花结的实验室株的剂量依赖型效果。将数据与无加入的抗体,在玫瑰花结中包含感染的至少40％的红细胞的对照相比较。显示一式三份的值的平均和标准偏差。IC50:产生50％玫瑰花结抑制的抗体浓度。b)除由0.1mg/ml的各个抗体(针对HB3var6,TM284var1,ITvar60,Muz12var1,TM180var1和ITvar9)的混合物组成的抗-Ros汇集体之外，用1mg/ml的抗体的如上文的玫瑰花结抑制测定。对照为如对于图2c的。c)与单核细胞系Thp-1共孵育的调理的IT/PAR+感染的红细胞的吞噬作用测定[12]。数据显示为以兔抗-人红细胞抗体调理的阳性对照的百分数。
图4:针对PfEMP1的抗体在恶性疟原虫临床分离株的表面识别和玫瑰花结抑制中显示交叉反应性。a)以0.4mg/ml的来自未免疫的兔的总IgG(阴性对照,左图)和针对TM284var1的抗体(中图)的临床分离株MAL43的流式细胞术。以Hoescht染色的感染的红细胞在右半部分,并且以AlexaFluor488染色的抗体-阳性的感染的红细胞在右上象限。直方图的重叠(右图)显示染色的感染的红细胞的明确群体。b)以PfEMP1抗体测试新鲜临床分离株表面反应性(以0.4mg/ml的IFA和流式细胞术)和玫瑰花结抑制(1mg/ml)。玫瑰花结抑制百分数显示于对于所有分离株:抗体组合的每个矩形中，具有>25％的玫瑰花结抑制。对照为如对于图2c的,并且抗-Ros汇集体为如对于图3b的。仅测试抗-Ros汇集体的玫瑰花结抑制。c)对于五种临床分离株的显示阴性对照,抗-PfEMP1阳性和IgM-阳性的感染的红细胞的流式细胞术直方图。仅通过IFA测试其它分离株。“阴性PfEMP1Ab”为针对TM180var1的抗体并且IgM阴性对照为小鼠IgG1同种型对照。
图5:交叉反应性PfEMP1抗体不识别人IgM。a)用于识别人IgM的ELISA。阳性对照为抗-人IgM抗体。显示来自一式三份的孔的光密度(OD)值的平均值和SD。b)在有和无人IgM的情况下生长的并且以抗-TM284var1抗体染色的IT/PAR+寄生虫的流式细胞术。
图6:对IgM的选择获得与PfEMP1抗体交叉反应的形成玫瑰花结的感染的红细胞。a)用抗-人IgM包被的Dynabeads选择适应培养的肯尼亚分离株9197三次。通过流式细胞术比较未选择的和选择的系显示：IgM-选择的寄生虫被针对HB3var6的交叉反应性PfEMP1抗体识别。b)双染(检测PfEMP1抗体的AlexaFluor488抗-兔IgG和检测抗-人IgM的AlexaFluor594抗-小鼠IgG)的IFA显示相同的感染的红细胞亚群既结合IgM也结合HB3var6抗体。
图7.通过PfEMP1抗体调理和诱导吞噬作用。在与单核细胞系Thp-1孵育之前，用溴化乙锭染色并用PfEMP1抗体调理感染的红细胞。通过流式细胞术检测吞噬感染的红细胞的Thp-1细胞。a)寄生虫株TM284b)寄生虫株HB3R+c)寄生虫株IT/R29d)寄生虫株TM180。数据显示为以兔抗-人红细胞抗体调理的阳性对照的百分数。“非Ros类型A”阴性对照由针对HB3var3(不参与形成玫瑰花结的PfEMP1变体)的抗体组成。HB3R+寄生虫培养物包括表达HB3var3的感染的红细胞亚群(参见表S1)，其解释了为何在此种情况下诱导了吞噬作用。“对照兔IgG”为由来自未免疫的兔的纯化的IgG组成的阴性对照。
图8:来自ITvar60变体的DBL结构域。下划线的区域表明产生的重组蛋白。缩略形式如对于图1a的。
图9:通过抗-DBL抗体抑制形成玫瑰花结。玫瑰花结抑制测定以确定各种ITvar60PfEMP1抗体对IT/PAR+寄生虫的剂量依赖性效果。将数据与无加入的抗体，在玫瑰花结中包含至少40％的感染的红细胞的对照相比较。显示一式三份值的平均值和标准偏差。
图10:通过ITvar60抗体的感染的红细胞的调理和吞噬作用。在与单核细胞系Thp-1孵育之前，将感染的红细胞用溴化乙锭染色和用PfEMP1抗体调理。通过流式细胞术检测吞噬感染的红细胞的Thp-1细胞。
图11:针对结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫(株HB3R+第1列,株TM284第2列,株9197IgM+第3列)测试的针对ITvar60的不同结构域的抗体。通过流式细胞术评估表面反应性,其中每个点图的右上象限为检测的阳性的感染细胞。阳性对照是针对各个寄生虫株的变体-特异的抗体(首行)。阴性对照是未免疫的兔IgG(底行)和针对来自不结合IgM的变体(ITvar9)的结构域的抗体。抗-ITvar60的DBL4ε识别全部三株,而抗-ITvar60的DBL5ε和抗-ITvar60的DBL2γ仅识别株TM284。
图12:针对不结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫(株TM180第1列,株SA075第2列,株IT/R29第3列,株Muz12第4列)测试的针对ITvar60的不同结构域的抗体。通过流式细胞术评估表面反应性,其中每个点图的右上象限为检测的阳性的感染细胞。阳性对照是针对各个寄生虫株的变体-特异的抗体(首行)。阴性对照是未免疫的兔IgG(底行)。针对ITvar60结构域的抗体不识别这些寄生虫株中的任一个。
图13:通过与年龄和入院时间匹配的对照(CM-对照)相比较的来自患有重症(脑)疟疾(CM-病例)年轻肯尼亚儿童的血浆样品识别活的IT/PAR+感染的红细胞(表达ITvar60抗原)的病例对照研究。数据来自流式细胞术；MFI:平均荧光强度。
图14:通过与年龄和入院时间匹配的对照(CM-对照)相比较的来自患有重症(脑)疟疾(CM-病例)年轻肯尼亚儿童的血浆样品识别活的IT/R29感染的红细胞的病例对照研究。数据来自流式细胞术；MFI:平均荧光强度。
图15:通过与年龄和入院时间匹配的对照(CM-对照)相比较的来自患有重症(脑)疟疾(CM-病例)年轻肯尼亚儿童的血浆样品识别活的SA075R+感染的红细胞的病例对照研究。数据来自流式细胞术；MFI:平均荧光强度。
图16:A:来自对表达HB3var6的寄生虫测试的重症疟疾病例的血浆；B:来自对表达HB3var6的寄生虫测试的无并发症疟疾对照的血浆。
图17:A:来自对表达SA075var1的寄生虫测试的重症疟疾病例的血浆；B:来自对表达SA075var1的寄生虫测试的无并发症疟疾对照的血浆。
图18:显示在用TM284var1免疫的小鼠中多克隆抗体应答的ELISA。
实施例1
材料和方法。
寄生虫和寄生虫培养物
将恶性疟原虫实验室株(HB3,Muz12,IT/R29,IT/PAR+,TM180和TM284)在补充的RPMI中培养[59]并如描述的关于形成玫瑰花结进行选择[60]。常规检查所有培养物以排除支原体污染[61]。将寄生虫用针对MSP1,MSP-2和GLURP的引物基因分型[62]并且与共享相同基因型但转录不同PfEMP1变体的IT/PAR+和IT/R29在遗传上区分开。使用的其它寄生虫株是未选择的HB3和3D7(结合CD36),IT/A4(结合CD36和ICAM-1)和对结合人脑内皮细胞进行选择的三株(HB3-HBEC,3D7-HBEC和IT-HBEC,Claessens等人,在排版中)。临床分离株来自喀麦隆(CAM1),肯尼亚(KEN7,KEN14,KEN17,9197,SA075),马里(MAL27,MAL34,MAL43,MAL81,MAL103)和冈比亚(GAM627)。马里的分离株和KEN7,KEN14和KEN17为从之前的研究中冷藏保存的[30,46]。在第一周期的体外生长中，检测除KEN7,KEN14和KEN17(第三周期)和9197和SA075(其已在3-4个月的体外生长期间适于培养、克隆和对形成玫瑰花结进行选择)之外的所有临床分离株。如描述的，通过用抗-人IgM单克隆抗体(Serotec MCA1662)的免疫荧光测定(IFA)确定形成玫瑰花结的株的结合IgM的表型[38,44]。
道德声明
依照赫尔辛基宣言进行来自疟疾患者的临床分离株(血液样品)的收集。知情同意书获自患者的父母或监护人并且经洛锡安地区伦理审查委员会(Lothian Regional Ethical Review Committee)(LREC//2002/4/34),KEMRI伦理审查委员会(KEMRI Ethical Review Committee),冈比亚政府/MRC实验室联合伦理委员会(Gambia Government/MRC Laboratories JointEthics Committee),喀麦隆公共卫生部区域伦理委员会(Cameroon Ministryof Public Health regional Ethics committee)和巴马科大学的机构审查委员会(University of Bamako Institutional Review Board)批准。由BioGenes GmbH(柏林,德国)根据对于保护用于科学目的的动物的1986年11月24日的欧盟准则(European Union guidelines)86/609/EWG和1996年3月18日的欧洲协定(European Agreement)商业上进行动物免疫。
Var基因表达图谱和var基因测序。
如之前描述的[24]和表S1中描述的进行RNA提取和var基因表达分析。各个优势的玫瑰花结-特异的var基因的全长序列源自来自以下的序列标签:a)从寄生虫基因组数据库提取(在http://www.broadinstitute.org的HB3和在www.sanger.ac.uk的IT)b)使用针对上游和下游PfEMP1区域的简并引物，对Muz12var1的PCR-步移,克隆和测序[63]。c)使用小载体文库对TM284var1和TM180var1的PCR-步移,克隆和测序[20]。
RNA印记
如描述的[44]，以地高辛标记的RNA探针进行寄生虫的同基因型的形成玫瑰花结和不形成玫瑰花结对的RNA提取和RNA印记。将来自各个寄生虫株的RNA与代表来自同源玫瑰花结-特异var基因的一个DBL结构域的特异探针,以及用以检测所有var基因的外显子II探针杂交。
重组蛋白和多克隆抗体.
如之前描述的生产重组蛋白[12]。对于各个玫瑰花结-特异的变体的NTS-DBL1α重组蛋白的结构域边界如下:HB3var6Met1-Pro473；TM284var1Met1-Pro457；ITvar60Met1-Pro464；Muz12var1Met1-Pro458；TM180var1Met1-Pro485。不形成玫瑰花结的类型A PfEMP1变体HB3var3(Met1-Pro468)用作对照。将各个蛋白用于免疫两只兔，所述兔已经被预筛选以避免具有已有的针对人红细胞或疟原虫的天然抗体的动物。由BioGenes GmBH(柏林,德国)进行免疫，血清收集和总IgG纯化。
免疫荧光测定(IFA).
如描述的，用活的感染的红细胞以IFA测试免疫和免疫前血清[12,44]。每一对免疫的兔中,选择产生最亮的荧光信号并具有最低的背景的血清用于纯化总IgG。在所有情况下,两种兔血清都产生阳性PfEMP1-染色,仅在染色强度上具有较小差异。
流式细胞术。
如用于IFA的，进行用于流式细胞术的染色[12,44],只是使用Hoescht(1.25μg/ml)替代DAPI以染色感染的红细胞并且在第二次孵育洗涤后加入50μg/ml岩藻多糖以破坏玫瑰花结。用0.5％多聚甲醛固定细胞,加入50μg/ml岩藻多糖以阻止玫瑰花结再形成,并且将每个样品500,000个事件(events)在Becton-Dickinson LSRII流式细胞仪上分析。
玫瑰花结抑制实验。
将在环形期的恶性疟原虫培养物与不同稀释度的抗体和对照孵育过夜,并且如描述的在次日通过显微镜评价玫瑰花结形成[12]。
吞噬作用测定。
使用Thp-1细胞的吞噬作用实验是如之前描述的[12]，只是使用岩藻多糖(200μg/ml)用于纯化寄生虫和破坏玫瑰花结。阳性对照是用兔抗-人红细胞抗体(ab34858,ABCAM,Cambridge,UK)调理的寄生虫培养物。Muz12var1抗体不包括在吞噬作用测定中，因为它们显示一些结合于未感染的红细胞的背景。
IgM ELISA。
使用4℃过夜包被于ELISA平板的纯化的人IgM(5μg/ml,Rockland)测试PfEMP1抗体与人IgM交叉反应的能力。在包含0.05％吐温20(PBST)和5％牛奶的PBS中封闭1小时后,将孔与在包含1％牛奶的PBST(PBSTM)中的10,1和0.1μg/ml的兔抗-NTS DBL1抗体孵育。室温孵育1小时后，用PBST洗涤孔并与在PBSTM中的1:10,000抗-兔IgG-HRP(Sigma)再孵育一小时。如上述的洗涤之后,通过根据制造商的使用说明将孔与底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸(Sigma)孵育显色并且在450nm波长测量吸光度。作为阳性对照,以1:100(10μg/ml),1:1000(1μg/ml)和1:10000(0.1μg/ml)使用兔抗-人IgM F(ab’)2-HRP(DAKO)。
在缺乏IgM时PfEMP1抗体的表面交叉反应性。
将汇集的人血清通过三个连续轮次的在具有等量的抗-人IgM(μ-链特异的)-琼脂糖(Sigma A9935)的旋转轮(15rpm)上室温孵育45分钟耗尽IgM。通过使用抗-人IgM单克隆抗体的蛋白质印迹确认吸收的血清中IgM的缺乏。IT/PAR+寄生虫在具有10％耗尽IgM的血清的补充RPMI中从环形期生长过夜,并且将等分部分(阳性对照培养物)与1mg/ml的人IgM(Calbiochem)在37℃孵育1小时。随后洗涤IgM-阴性和IgM-阳性培养物并通过如上文描述的流式细胞术测试交叉反应性PfEMP1抗体对TM284var1NTS-DBL1α的表面反应性。
对IgM-阳性的感染的红细胞的选择。
如描述的使用包被有小鼠抗-人IgM抗体(Serotec MCA1662)的M-450Epoxy Dynabeads(Dynal)对IgM-阳性的感染的红细胞选择寄生虫[64]。
软件。
使用FlowJo软件(Tree Star Inc.)分析流式细胞术数据,使用DNAstarLasergene(DNAstar Inc.)进行DNA序列分析并且使用Prism(GraphPad软件)进行图像和统计分析。
治疗性mAbs。
已经生产了对PfEMP1变体,TM284var1的表位具有特异性的单克隆抗体。这些抗体将被用于研究开发治疗性单克隆抗体混合物以反转玫瑰花结形成的可能性。
结果
鉴定由形成玫瑰花结的寄生虫转录的PfEMP1变体
为了鉴定形成玫瑰花结的寄生虫的关键表面抗原,体外培养源自不同国家的五种恶性疟原虫实验室株(三种结合IgM,两种不结合IgM)，选择形成玫瑰花结的表型。对于各个株,平行选择同基因型的玫瑰花结阳性(R+)和玫瑰花结阴性(R-)的群体[20],并且通过分析短PfEMP1序列标签检查它们的var基因转录图谱[24]。各个株中的玫瑰花结-特异的变体被鉴定为由形成玫瑰花结的群体(包括所有检测的var基因序列中的三分之一到二分之一)转录的优势var基因，其在不形成玫瑰花结的群体中缺乏/罕见(表S1中显示实例)。各个优势玫瑰花结-特异的var基因的全长序列获自如在方法中描述的序列标签。形成玫瑰花结的变体大多数是类型A(图1a),其由保守的上游序列(UpsA)和与重症疟疾相关的特有的N-末端结构域类型(称为DBLα1或“Cys2”)的存在限定[18,24,26]。来自结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的变体形成明显的共享罕见的PfEMP1结构的亚类,其包含在PfEMP1(DBLε和DBLζ)中很少发生的结构域的三联体(triplet)[6]。对于非免疫IgM的结合位点位于这些DBLε/ζ结构域之间[43,44](AG和JAR,未发表的数据)。结合IgM的结构域三联体通过至少一个其它结构域(DBLγ)连接于典型的类型A PfEMP1头部结构[16,18,45](图1a)。来自类型A PfEMP1变体的DBLα结构域落在基于序列同源性的八个亚类(DBLα1.1至DBLα1.8)中[6]。之前描述的形成玫瑰花结的变体(ITvar9,Palo Alto varO和PF13_0003)[11,20,21]都是DBLα1.6亚类的。在此鉴定的玫瑰花结-特异的变体是DBLα1.5(HB3var6和Muz12var1),DBLα1.8(TM284和ITvar60)或DBLα2(非类型A的类型,TM180var1)之一[6]。
尽管有观察到的PfEMP1结构的相似性,但是在来自不同寄生虫株的,具有显示介于38.9％(ITvar60:TM180var1)和62.6％(ITvar60:TM284var1)之间的成对的氨基酸同一性的介导玫瑰花结的结构域(NTS-DBLα)[11,20,21]的玫瑰花结-特异的变体间存在相当多的序列多样性(表S2)。除了TM284var1和ITvar60的第一CIDR结构域(82.2％)和HB3var6和Muz12var1的第一CIDR结构域(81.1％；参见对于所有结构域类型的成对的氨基酸同一性的表S2-S7)外，来自形成玫瑰花结的变体的其它细胞外结构域不显示高水平的氨基酸同一性。
通过RNA印记证实玫瑰花结-特异变体的正确鉴定(图1b；之前对TM284显示的[44])。对于各个寄生虫株,玫瑰花结-特异的PfEMP1探针在形成玫瑰花结的寄生虫(箭头标出的)中检测到转录物，所述转录物在同基因型的不形成玫瑰花结的寄生虫中是缺乏/弱的。使用鉴定所有var基因的外显子II探针显示不形成玫瑰花结的寄生虫中其它转录的var基因的存在(图1b)。
为了引起针对形成玫瑰花结的PfEMP1变体的抗体,将各个玫瑰花结-特异变体的N-末端NTS-DBLα区域在大肠杆菌中表达为重组蛋白[12],重组蛋白在还原条件下迁移率的改变显示在这些富半胱氨酸的蛋白中存在二硫键(图1c)。选择NTS-DBLα是因为在之前的研究中，它是结合红细胞以造成形成玫瑰花结的结构域[20,21],并且针对此区域的变体-特异的抗体在抑制形成玫瑰花结方面最有效[12,21]。
PfEMP1抗体针对实验室-适应的恶性疟原虫株的功能活性和交叉反应性
使用重组蛋白免疫兔[12],以诱导抗体以确定来自不同恶性疟原虫株的玫瑰花结-特异的PfEMP1变体是否共享共有表位。免疫荧光测定(IFA)显示，针对五种变体中的每个的抗血清产生点状的荧光，其表征具有同源寄生虫株的活的感染的红细胞表面上的PfEMP1抗体(图2a中显示带有ITvar60抗体的IT/PAR+寄生虫)。通过IFA，兔免疫前血清和未免疫的兔对照血清是阴性。来自各个抗血清的纯化的总IgG的滴定度显示一直到低浓度针对同源寄生虫的特异表面反应性(滴定终点为0.02-1.56μg/ml的总IgG,图2b和图2c,加粗的矩形)。
重要的是,PfEMP1抗体也显示与异源的形成玫瑰花结的株的表面反应性。这在结合IgM的形成玫瑰花结的株(HB3R+,TM284和IT/PAR+)和它们的抗体(分别针对变体HB3var6,TM284var1和ITvar60)之间是尤其显著的,对于异源的抗体:寄生虫组合具有<10μg/ml的表面反应性(图2c)。不结合IgM的形成玫瑰花结的株(Muz12,TM180和IT/R29)也被针对结合IgM的形成玫瑰花结的变体的抗体识别,尽管需要更高的浓度(100-400μg/ml的总IgG,图2c)。尽管这些浓度高，但它们仍然表现相当大的全血清的稀释度(相当于1/100至1/25的稀释度)，因此，它们在体内是可能达到的。
针对形成玫瑰花结的PfEMP1变体的抗体不识别对其它粘附表型进行选择的寄生虫(图2c),所述表型包括结合CD36或ICAM-1(表达类型B和C var基因的寄生虫)或结合脑内皮细胞(表达类型A和B/A var基因的替代亚群的寄生虫)。因此,仅具有共享的粘附表型的寄生虫共享由针对PfEMP1的交叉反应性抗体识别的表位。
通过抗体体内表面识别活的感染的红细胞很有可能导致通过效应子机理比如吞噬作用或补体介导的细胞溶解的寄生虫清除[13]。玫瑰花结-抑制也可以是防止病理的微血管阻塞而在体内所需的。我们因此检查图2中显示的由PfEMP1抗体导致的交叉反应性表面识别,是否转化为效应子功能中的交叉反应性。除了尽管有良好的表面反应性(图2c)，但不被抑制的TM180(图3a,褐色曲线)之外，PfEMP1抗体显示针对同源寄生虫株的有效的玫瑰花结-抑制(图3a,红色曲线)，对形成玫瑰花结的50％抑制浓度(IC50)为介于0.8-8μg/ml之间。寄生虫株TM284,IT/PAR+和TM180都显示通过异源抗体的玫瑰花结抑制(图3a,蓝色曲线)。在更高的浓度(1mg/ml的总IgG)，玫瑰花结抑制中的交叉反应性甚至更显著,其中由针对结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMP1变体中的至少一个的抗体抑制所有株(图3b)。
还显示针对来自结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的PfEMP1变体的抗体通过诱导同源和异源的感染的红细胞的吞噬作用而具有交叉反应性调理效果(图3c和图7a和b)。相比之下,针对来自不结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的PfEMP1变体的抗体，仅有效调理同源寄生虫(图7c和d)。
针对恶性疟原虫临床分离株的抗-PfEMP1抗体的功能活性和交叉反应性
已经显示在恶性疟原虫实验室株中交叉反应性PfEMP1抗体的表面识别和生物效应子功能,我们使用来自喀麦隆，肯尼亚，马里和冈比亚的新鲜临床分离株探究交叉反应性的地理范围。临床分离株中形成玫瑰花结的感染的红细胞的比例在分离株之间有变化(15-40％),没有如经历对形成玫瑰花结进行重复选择的实验室株那么高。选择临床分离株是因为它们在玫瑰花结中包含至少15％的感染的红细胞，并且显示所有的测试分离株。解冻十株新鲜的临床分离株,并且发现除一个之外的全部都为结合IgM的形成玫瑰花结的表型(通过用IFA检测感染的红细胞表面的IgM测试)。这与之前的显示来自肯尼亚儿童的临床分离株中玫瑰花结频率和IgM结合的强的正相关的数据一致[38]。
通过用IFA的活的感染的红细胞的点状荧光(类似于图2a)和通过流式细胞术(图4a)检测所述组的PfEMP1抗体的表面反应性。引人注意的是,针对两种PfEMP1变体(HB3var6和TM284var1)的抗体足以提供针对所有地理位置上多样的结合IgM的形成玫瑰花结的分离株的表面反应性(图4b和c)。在各个分离株中抗-PfEMP1阳性和IgM阳性细胞的比例紧密相配(皮尔森相关性(Pearson Correlation)r＝0.934,P＝0.006；图4c,将IgM阳性细胞与阳性PfEMP1抗体染色的细胞相比较)。在四株分离株中也观察到玫瑰花结抑制,当使用抗-PfEMP1抗体的组合(pool)时，增加到六株分离株(图4b)。不结合IgM的临床分离株(MAL103)和两株最近适应培养的选择玫瑰花结的不结合IgM的肯尼亚株(9197和SA075)不被PfEMP1抗体识别(图4b)。因此，在临床分离株中，仅在显示结合IgM的形成玫瑰花结的表型的寄生虫中看到PfEMP1抗体的交叉反应性。
我们考虑了上述结果可以由PfEMP1抗体与人IgM(其结合来自培养基的感染的红细胞表面)交叉反应而不是由于PfEMP1自身内共享的表位解释的可能性。然而,在ELISA中，所述PfEMP1抗体不识别人IgM(图5a),并且当寄生虫在IgM缺乏的情况下生长时，异源寄生虫株的表面反应性得以维持(例如,如在图5b中显示的，在IgM缺乏的情况下，IT/PAR+寄生虫显示与TM284var1抗体的表面反应性)。
进一步通过采用最近适应培养的显示不结合IgM的形成玫瑰花结的肯尼亚株9197和SA075(图4b),使用包被有抗-人IgM抗体的磁珠选择它们对IgM的结合，显示在不同寄生虫分离株中，存在结合IgM的形成玫瑰花结的变体。三轮选择后,获得结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫群体,其被针对HB3var6的抗体(9197IgM-选择的,图6)或针对TM284var1的抗体(SA075IgM-选择的,数据未显示)识别。双染显示感染的红细胞的相同的亚群既结合IgM也结合HB3var6抗体(图6b)。
讨论
在此工作中，研究了由代表两种主要的形成玫瑰花结表型的恶性疟原虫株表达的PfEMP1变体。发现结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫表达独特亚类的类型A PfEMP1变体，所述变体的特征为DBLα1.5或DBLα1.8N-末端结构域和紧邻跨膜区的DBLε/DBLζ结构域的三联体。当针对同源寄生虫测试时，针对结合IgM的形成玫瑰花结的变体的N-末端区域产生的抗体是玫瑰花结形成的有效抑制剂(对于玫瑰花结的抑制IC50≤1μg/ml的总IgG,图3a),证实这些变体在玫瑰花结形成中的作用。此外,针对结合IgM的形成玫瑰花结的变体的抗体是交叉反应性的,显示全世界范围内共享相同粘附表型的不同寄生虫分离株的活的感染的红细胞的表面识别和玫瑰花结抑制。相比之下,如之前描述的，针对来自不结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的类型A PfEMP1变体产生的抗体是变体特异的[11,20,21]。这些数据表明不是所有类型A PfEMP1变体诱导交叉反应性抗体,并且类型A变体的某些亚类可以是特别有交叉反应性的。据我们所知,这是第一次报道描述成功诱导针对严重儿童期疟疾中涉及的PfEMP1变体的广泛交叉反应性表面识别抗体。已经描述针对孕期疟疾中涉及的var2CSA的广泛交叉反应性抗体[47,48],然而,var2CSA是比在非跨越菌株的类型A PfEMP1变体中看到的具有更多限制的序列多样性的跨越株的var基因的独特例子[49]。
这里详细表征了三种来自结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的PfEMP1变体:来自株HB3的HB3var6,来自株TM284的TM284var1和来自株IT/PAR+的ITvar60。之前，已经在两种其它源自IT/FCR3的寄生虫系中将ITvar60与形成玫瑰花结联系起来[50,51],并且这里被证实为结合IgM的形成玫瑰花结的变体。如对PfEMP1预期的,尽管在PfEMP1结构方面有它们的相似性(图1)，但是三种不同的结合IgM的形成玫瑰花结的变体显示氨基酸序列方面相当大的多样性(表S2-S7)。在近期测序的恶性疟原虫株IGH的基因组(IGHvar12,IGHvar22和IGHvar24[6])中可以看到具有相同的“形成玫瑰花结的IgM”类型的结构域结构的其它变体。此外,ITvar60样变体存在于测序的来自巴布亚新几内亚的恶性疟原虫株D10(http://www.broadinstitute.org)中。总合在一起,这些数据提示具有形成玫瑰花结的IgM类型的PfEMP1结构的变体普遍存在于地理位置上不同的恶性疟原虫分离株中。目前的研究的一个局限是没有充足的来自临床分离株的材料用以鉴定和测序由形成玫瑰花结的寄生虫转录的PfEMP1变体，以允许与实验室株比较。来自两个适应培养的临床分离株的结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的选择(图6)将允许我们进一步详细研究它们的var基因。玫瑰花结-特异的变体的正确鉴定(表S1)和全长var基因的测序对于不具有可用的全基因组序列的分离株仍然是费力和耗时的过程。然而,来自形成玫瑰花结的临床分离株的PfEMP1结构和序列更广泛的研究对于这里记载的抗体交叉反应性怎样涉及序列多样性和PfEMP1类型的全面理解将是关键的。
不结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的之前的研究鉴定寄生虫形成玫瑰花结的配体为PfEMP1变体(ITvar9,Palo Alto varO和PF13_0003)，其显示DBLα结构域的八种可能的亚类中的一个,DBLα1.6[11,20,21]。相比之下,这里描述的类型A形成玫瑰花结的变体具有DBLα1.5(HB3var6和Muz12var1)或DBLα1.8(ITvar60和TM284var1)之一。临床分离株显示与HB3var6抗体(DBLα1.5类型)或TM284var1抗体(DBLα1.8)之一的表面反应性,但很少与两种抗体都有交叉反应性(图4b)。这些数据提示这两种主要DBLα1类型可以构成不同地域分离株中结合IgM的形成玫瑰花结的表型的基础,尽管显然需要进一步序列信息以证实该想法。TM180var1不同于其它玫瑰花结-相关变体，因为其具有UpsB序列和DBLα2亚型,并且这可以代表形成玫瑰花结的表型的不同类型，其需要进一步研究。综合本研究的研究结果和之前发表的工作，我们猜测，具有DBLα1.5,DBLα1.6或DBLα1.8结构域的所有类型A PfEMP1变体可以是玫瑰花结-介导的变体。如果是正确的,这将表明来自每个恶性疟原虫分离株的类型A var基因组库的很大比例(大约三分之一到二分之一)可以编码形成玫瑰花结的变体[6]。这将表示由寄生虫在粘附表型中的大量投入，其对寄生虫适合度的益处尚且未知。
Rask等人[6]近来提供通过审视“结构域盒”(通常一起存在的PfEMP1结构域组合)评估PfEMP1类型的替代的方式。他们鉴定了在类型A var基因中常见的七个结构域盒[6]。我们的数据提示，这些结构域盒中的两个与形成玫瑰花结的表型相关联:结构域盒16,特征为如在HB3var6中看到的连接于CIDRδδ的DBLα1.5/6,和结构域盒11，特征为如在ITvar60和TM284var1看到的连接于CIDRβ2和DBLγ7的DBLα1.8。尽管需要更多的工作以概括这些结果并确定特定DBLα亚类和结构域盒是否总是与形成玫瑰花结相关联,但是我们的数据代表在将PfEMP1序列与寄生虫粘附表型相关联方面的重要步骤。
目前的数据的一个无法解释的特征是，尽管两组变体中有明显相当的氨基酸多样性，但是为何结合IgM的形成玫瑰花结的变体在由指示共享的表位的PfEMP1抗体识别方面显示交叉反应性,然而不结合IgM的变体不显示。我们考虑了IgM本身可以是交叉反应性的原因的可能性,然而我们展示在ELISA中PfEMP1抗体不识别人IgM,并且当寄生虫在缺乏人IgM的情况下生长时，PfEMP1抗体仍然识别异源株(图5)。其可能是，小的序列基序(比如由Rask等人[6]描述的仅存在于结合IgM的变体中的同源性区块中的一种)解释了交叉反应性。将需要结合IgM的形成玫瑰花结的变体的另外的实例以研究此种可能性。备选地,可能IgM对PfEMP1的结合影响其三级或四级结构,使其更易接近针对分子的N-末端的抗体。然而,最近的数据提示，IgM结合使得PfEMP1较不易接近特异抗体[41]。
之前关于PfEMP1的工作提示，抗体应答主要是变体特异的[10,11,12]，结构域之间有一点交叉反应性[52]。然而,其它报道提示，交叉反应性抗体可以存在[53,54,55]并且可以在抗原变异过程中的组织PfEMP1表达中发挥作用[56]。对临床疟疾的免疫性的逐步获得是否与针对很多不同变体类型的抗体的广泛的组库的获得相关,或是否由于交叉反应性应答的产生仍未解决。尤其在威胁生命的疟疾的情况下,针对PfEMP1的抗体的作用不清楚。已知儿童在少量感染后变得对重症疟疾免疫[13,57],并且重症疟疾与获得针对普遍识别的变体的抗体相关[14,15,58]。目前的想法提示重症疟疾由表达变体表面抗原的抗原限制的亚类[2](可能由类型A var基因编码[26,27])的寄生虫引起。将预期此种寄生虫的“抗原限制的”亚类具有显示保守的序列和/或保守的表位的变体表面抗原(可能是PfEMP1)，所述保守的序列和/或保守的表位将被显示与不同寄生虫株的表面反应性的抗体识别。这里报道的具有共享的构成毒力相关表型基础的表位的变体的亚类的研究结果可以代表寄生虫的此种“抗原限制的”亚类的第一种实例。
总的来说,这些数据显示，针对来自结合IgM的形成玫瑰花结的实验室株的类型A PfEMP1变体亚类产生的抗体对共享相同的粘附表型的全球的寄生虫分离株有广泛的交叉反应性。具有共享的毒力相关表型的恶性疟原虫分离株中共享的表位的这种发现可以构成儿童在少量感染后获得对威胁生命的疟疾的免疫性的流行病学观察的基础[13,57]。最重要的是,通过用构成毒力表型基础的关键PfEMP1变体免疫诱导广泛的交叉反应性抗体的能力,提示设计干预措施以预防重症疟疾是现实的目标。
实施例2
实施例1中提供的数据集中于针对来自结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMP1变体的N-末端区域(NTS-DBL1a)的抗体。实施例2中提供的实验,研究针对其它来自这些PfEMP1变体的DBL结构域的抗体是否也将显示交叉反应性。这将不能从结构域之间的氨基酸相似性(其是低的,大部分介于20-40％的氨基酸同一性之间)的研究中预测。
材料和方法
如在主要的手稿中描述的，在大肠杆菌中制备重组蛋白并且在兔中产生抗体。通过如在实施例1中描述的流式细胞术,玫瑰花结抑制和吞噬作用诱导评估表面反应性。
结果：
针对来自ITvar60变体的所有DBL结构域(图1A和图8以红色显示的下部区域)并且也对来自HB3var6变体的DBL4e和DBL5e(Fig1A)产生抗体。
测试针对同源寄生虫株(IT/PAR+)的ITvar60抗体
测试ITvar60抗体针对同源寄生虫株(IT/PAR+)的活的感染的红细胞的表面反应性。除了针对DBL3ζ的抗体(其仅在100μg/ml产生表面反应性)以外,所有抗体显示点状荧光(PfEMP1的特征),低至低浓度(参见表1)。针对ITvar60的其它结构域的抗体抑制形成玫瑰花结,尽管没有一个如NTS-DBL1α抗体那样有效(参见图10和表1)。还测试了ITvar60抗体诱导感染的红细胞的吞噬作用的能力(在体内可能重要的功能)。针对ITvar60的DBL2γ的抗体能够调理感染的红细胞并类似于NTS-DBL1a抗体诱导吞噬作用(参见图11下图)。有趣的是,尽管有良好的表面反应性和玫瑰花结抑制能力,但是针对ITvar60的DBL4ε和DBL5ε的抗体不能够调理和诱导吞噬作用。
表1在针对IT/PAR+寄生虫的不同测定中ITvar60Abs的有效性。
针对其它寄生虫株测试ITvar60抗体
以活的感染的红细胞测试抗体对不同形成玫瑰花结的寄生虫株的表面反应性。针对ITvar60的DBL4ε的抗体显示针对其它结合IgM的形成玫瑰花结株的交叉反应性(参见图11)。该识别是对结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫特异的,并且用不结合IgM的形成玫瑰花结的寄生虫未看到该识别(参见图12)。
讨论
这些数据显示，能够诱导交叉反应性抗体的不仅是PfEMP1的NTS-DBL1α区域,而且来自结合IgM的形成玫瑰花结的变体的其它结构域显示相同的效果。这产生了其它结构域可以包含在疫苗中的可能性。
就功能活性而言,根据玫瑰花结抑制和吞噬作用，针对NTS-DBL1α区域的抗体显然是最有效的(参见表1)。这些活性对于抗体的体内功能有效性可能是重要的,因此，这些数据论证NTS-DBL1α是包含在疫苗中的最有效区域。存在其它可能的可以由所有表面反应性抗体诱导的体内抗体作用的机制(例如补体介导的感染的红细胞的溶解)。
表S1.通过同基因型形成玫瑰花结的(R+)和不形成玫瑰花结的(R-)HB3寄生虫的转录图谱鉴定玫瑰花结-特异的var基因。
为了鉴定主要的玫瑰花结-特异的PfEMP1变体,比较同基因型的形成玫瑰花结的(R+)和不形成玫瑰花结的(R-)寄生虫的var基因转录图谱。从环形期晚期的寄生虫提取RNA并且通过用针对DBL1α的简并引物的逆转录酶(RT)-PCR评估var基因转录(1,2)。通过TA克隆(Invitrogen)克隆RT-PCR产物,并且挑取40个克隆用于小量制备DNA提取和测序(3)。从HB3R+系(玫瑰花结频率58％),获得36个具有var基因插入物的重组质粒,并且最常见的序列(39％的克隆)是类型A var基因HB3var6(以粗体显示)。从HB3R-系(玫瑰花结频率2％)，在测序的34个var基因插入物中的仅一个发现该基因,然而在不形成玫瑰花结的系中通常检测到一些类型B和C var基因。另一种类型A var基因在HB3R+系中也常见(HB3var3,10/36克隆)并且在HB3R-系中罕见(1/34克隆)。从HB3寄生虫的不同冷冻稳定生物(cryostabilate)开始的第二次独立选择显示来自R+寄生虫的5/16克隆中为HB3var6和来自R-寄生虫的0/15克隆中为HB3var6,然而在R+或R-群体中未检测到HB3var3。这些数据显示在HB3形成玫瑰花结的寄生虫中转录的主要var基因是HB3var6。对其它恶性疟原虫形成玫瑰花结的株接着进行相同的过程,以至少两次独立的选择和RT-PCR表明各个情况下主要的var基因。
表S1的参考文献
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表S2.对于来自形成玫瑰花结的PfEMP1变体的NTS-DBLα,CIDR1和DBLγ的成对的氨基酸同一性a
a这项工作中描述的形成玫瑰花结的变体加上ITvar9[1],Palo Alto VarO[2]和PF13_0003[3].
b以红色显示的结合IgM的形成玫瑰花结的株之间的成对氨基酸同一性
表S2的参考文献
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表S3.对于来自形成玫瑰花结的PfEMP1变体的DBLε的成对氨基酸同一性
ad3:来自N-末端的第3DBL结构域
表S4.对于来自形成玫瑰花结的PfEMP1变体的DBLζ的成对氨基酸同一性
HB3var6 TM284var1 ITvar60 Palo Alto VarO
HB3var6 100 42.7 37.1 36.1
TM284var1 100 35.6 35.0
ITvar60 100 36.8
PA varO 100
表S5.对于来自形成玫瑰花结的PfEMP1变体的DBLβ的成对氨基酸同一性
表S6.对于来自形成玫瑰花结的PfEMP1变体的DBLδ的成对氨基酸同一性
表S7.对于来自形成玫瑰花结的PfEMP1变体的CIDR2的成对氨基酸同一性
HB3var6 Muz12var1 TM180var1 ITvar9 Palo Alto VarO 3D7PF13
HB3var6 100 28.1 30.9 26.7 53.0 32.3
Muz12var1 100 45.3 50.2 33.3 41.8
TM180var1 100 37.9 34.4 48.1
ITvar9 100 29.8 36.8
PA varO 100 35.1
3D7PF13 100
实施例3
表达ITvar60的寄生虫被来自从重症(脑)疟疾恢复的儿童的血浆中的抗体特异识别。
材料和方法
血浆样品
在急性期和恢复期收集来自10个肯尼亚脑疟疾病例和10个肯尼亚非严重对照的临床血浆样品(通过年龄和入院日期匹配的)。急性期样品(入院时取的)反映在疟疾感染前过程中产生的抗体(即这是“基线”样品)；恢复期样品(入院后一个月取的)反映针对引起最近导致儿童住院治疗的临床感染的寄生虫产生的抗体。
流式细胞术
通过流式细胞术测试活的恶性疟原虫感染的红细胞表面抗原的识别。
测试的寄生虫株是:
IT/PAR+(其是表达本专利中称为ITvar60变体的、IgM-阳性的形成玫瑰花结的寄生虫),我们预测其应该被重症疟疾儿童的恢复期抗体识别。IT/R29和SA075R+，其是我们预测应当不被重症疟疾儿童的恢复期抗体识别的、IgM-阴性的形成玫瑰花结的寄生虫。
如预测的,表达ITvar60PfEMP1变体的IT/PAR+寄生虫被从重症(脑)疟疾恢复的儿童的血浆中的抗体特异识别(图13,CM病例)。相比之下,患有非重症疟疾的年龄匹配的对照儿童在恢复期血浆中不显示增强的IT/PAR+寄生虫识别(图13，CM-对照)。
这些数据支持ITvar60-样抗原参与重症疟疾的发病机制，和针对该变体形成的抗体将针对重症疟疾的未来发病提供保护的猜想(因为流行病学研究显示，尽管很多年他们仍然对轻微的临床疾病易感，但儿童在生命的前几年快速变得对重症疟疾免疫，并且很少多于一次形成重症疟疾)。
相比上述数据，IgM-阴性的形成玫瑰花结的寄生虫(我们不期待参与重症疟疾的)不被从重症疟疾恢复的儿童血浆中的抗体特异识别(图1和15)。
以类似的方式，表达HB3var6抗原的寄生虫被从重症疟疾恢复的儿童血浆中的抗体特异识别(图16A和B)，然而，以此种方式，对照表达SA075var1的寄生虫不被特异识别(图17A和B)。
抗体
如由以下ELISA显示的，用TM284var1抗原免疫的小鼠产生极好的多克隆抗体应答。来自各个小鼠的多克隆抗体还显示低至至少1/10,000稀释度的天然抗原对活的感染的红细胞表面的强烈识别，并且在1/1000稀释度完全破坏玫瑰花结(图18)。在筛选抗-PfEMP1单克隆抗体之前，已从小鼠脾制备融合体。
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Claims (17)

1.恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)红细胞膜蛋白-1(PfEMP1)抗原或其一个或多个片段,其用于产生免疫应答的用途。
2.如权利要求1所述的用于权利要求1所述用途的PfEMP1抗原,其中所述PfEMP1抗原是源自IgM形成玫瑰花结的恶性疟原虫变体。
3.如权利要求1或2所述的用于权利要求1或2所述用途的PfEMP1抗原,其中所述PfEMP1抗原选自由以下组成的组:
(i)HB3var6；
(ii)TM284var1；和
(iii)ITvar60。
4.如权利要求3所述的用于权利要求3所述用途的PfEMP1抗原,其中所述PfEMP1抗原HB3var6获自恶性疟原虫株HB3；所述PfEMP1抗原TM284var1获自恶性疟原虫株TM284并且所述PfEMP1抗原ITvar60获自恶性疟原虫株IT/PAR+。
5.如任一项在前权利要求所述的用于任一项在前权利要求所述用途的PfEMP1抗原,其中所述PfEMP1抗原由以下编码:
(i)以SEQ ID NOS1,2,3,4,5或6或其片段给出的序列中的一种或多种；
(ii)相对由SEQ ID NOS:1,2,3,4,5或6或其片段提供的序列中的一种或多种显示至少80％同源性或同一性的序列。
6.如任一项在前权利要求所述的用于任一项在前权利要求所述用途的PfEMP1抗原,其中所述PfEMP1抗原包含PfEMP1Duffy结合样(DuffyBinding Like)(DBL)结构域。
7.如权利要求6所述的用于权利要求6所述用途的PfEMP1抗原,其中所述DBL结构域是选自由以下组成的组的一种或多种:
(i)HB3var6,TM284var1和/或ITvar60NTS-DBL1α结构域；
(ii)ITvar60DBL4ε结构域；和
(iii)(i)和/或(ii)的(免疫原性/抗原性)片段。
8.如任一项在前权利要求所述的用于任一项在前权利要求所述用途的PfEMP1抗原,其中所述免疫应答
(i)有效针对疟原虫、恶性疟原虫的不同株和分离株；
(ii)包含下述抗体，所述抗体对所述HB3var6、TM284var1和/或ITvar60PfEMP1抗原显示一定程度的亲和力、选择性和/或特异性和对除了所述HB3var6、TM284var1和/或ITvar60PfEMP1抗原之外的PfEMP1抗原显示一定程度的亲和力、选择性和/或特异性。
9.一种疫苗或疫苗组合物，其包含一种或多种选自由以下组成的组的PfEMP1抗原:
(i)PfEMP1抗原或其一个或多个片段；
(ii)结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMP1；
(iii)PfEMP1变体HB3var6；
(iv)PfEMP1变体TM284var1；
(v)PfEMP1变体ITvar60；
(vi)PfEMP1DBL结构域；
(vii)NTS-DBL1α结构域；
(viii)DBL4ε结构域；
(ix)PfEMP1变体HB3var6的NTS-DBL1α结构域；
(x)PfEMP1变体TM284var1的NTS-DBL1α结构域；
(xi)PfEMP1变体ITvar60的DBL4ε结构域；和
(x)(i)-(ix)中任一个的(免疫原性/抗原性)片段。
10.如权利要求9所述的疫苗或疫苗组合物,其用于产生免疫应答的用途。
11.如权利要求10所述的用于权利要求10所述用途的疫苗或疫苗组合物,其中在人或青少年人中产生所述免疫应答。
12.如权利要求9所述的疫苗或疫苗组合物,其用于治疗或预防疟疾或重症疟疾。
13.对选自由以下组成的组的PfEMP1中的一种或多种显示一定程度的亲和力、特异性和/或选择性的抗体:
(i)PfEMP1抗原或其一个或多个片段；
(ii)结合IgM的形成玫瑰花结的PfEMP1；
(iii)PfEMP1变体HB3var6；
(iv)PfEMP1变体TM284var1；
(v)P0EMP1变体ITvar60；
(vi)PfEMP1DBL结构域；
(vii)NTS-DBL1α结构域；
(viii)DBL4ε结构域；
(ix)PfEMP1变体HB3var6的NTS-DBL1α结构域；
(x)PfEMP1变体TM284var1的NTS-DBL1α结构域；
(xi)PfEMP1变体ITvar60的DBL4ε结构域；和
(x)(i)-(ix)中任一个的(免疫原性/抗原性)片段。
14.如权利要求13所述的抗体,其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
15.如权利要求13或14所述的抗体,其用于
(i)治疗或预防疟疾和/或重症疟疾；和/或
(ii)预防疟疾中的红细胞玫瑰花结形成。
16.一种诊断疟疾或重症疟疾的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)提供来自要被测试的受试者的样品；和
(b)将(a)中提供的样品与根据权利要求13或14所述的抗体在足以允许所述抗体和存在于所述样品中的任何PfEMP1抗原之间的结合的条件下接触；
(c)任选地移除未结合的抗体；和
(d)检测抗体/PfEMP1抗原复合物的存在；
其中检测出抗体/PfEMP1抗原复合物指示受试者患有疟疾和/或重症疟疾,或处于发展为疟疾和/或重症疟疾的风险中。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述受试者是人受试者或青少年人受试者。
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