CN104073552B - Bim基因突变检测方法和试剂盒 - Google Patents

Bim基因突变检测方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104073552B
CN104073552B CN201410152233.3A CN201410152233A CN104073552B CN 104073552 B CN104073552 B CN 104073552B CN 201410152233 A CN201410152233 A CN 201410152233A CN 104073552 B CN104073552 B CN 104073552B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
amplicon
amplimer
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410152233.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104073552A (zh
Inventor
张以哲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Digital Biotechnology (Xuancheng) Co., Ltd.
Original Assignee
张以哲
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 张以哲 filed Critical 张以哲
Priority to CN201410152233.3A priority Critical patent/CN104073552B/zh
Publication of CN104073552A publication Critical patent/CN104073552A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104073552B publication Critical patent/CN104073552B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明及诊断方法和试剂盒，尤其涉及用于个体化用药的基因突变分子诊断方法和试剂盒。一种检测BIM基因缺失突变的试剂盒，该试剂盒包含：能扩增SEQ ID NO:5中的第一扩增序列形成一个小于1000bp的第一扩增子的第一扩增引物对，所述第一扩增引物对或者不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列、或者扩增SEQ ID NO:1的一段序列产生一个比第一扩增子长2903bp的扩增子；以及不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列、但能扩增SEQ ID NO:1中的一段第二扩增序列产生第二扩增子的第二扩增引物对。本发明的试剂盒可以在肿瘤个性化治疗中的应用。

Description

BIM基因突变检测方法和试剂盒
技术领域
本发明及诊断方法和试剂盒，尤其涉及用于个体化用药的基因突变分子诊断方法和试剂盒。
背景技术
酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)通过诱导程序性细胞凋亡而杀死癌细胞，并给患有慢性骨髓白血病(chronic myeloid leukemia, CML)和表皮生长因子突变的肺癌患者(EGFR NSCLC)带来巨大的治疗益处，但是其有效治疗范围和持续时间因人而异，因此说明存在其他遗传修饰影响机体对TKIs的应答。
杜克-新加坡大学医学院的科学家Ng、Hillmer等对CML病人患者进行基因组测序分析，结果发现编码 BCL2-like 11 (BIM)蛋白的基因具有内含子缺失多态性。BIM是一种BCL2蛋白家族的前凋亡成员，对病理损伤(如神经退行性变、肿瘤、癫痫等)细胞具有强大的杀伤功能，在消除自身免疫、维持造血细胞内环境的稳定中起着重要的调节作用，是抗肿瘤药物活性的重要介质之一。BIM基因内含子2缺失2903对碱基，使得其转录的mRNA优先形成含有外显子3的剪切体，而不是正常的含有外显子4的剪切体，最终表达出的BIM蛋白亚型缺少BH3结构域，结果导致BH3结构域依赖性细胞凋亡受阻，表现为CML和EGFR NSCLC患者具有酪氨酸激酶抑制剂TKIs耐药性，无法从这类药物中受益，说明BIM多态性与TKIs耐药性相关。对2597个健康人体进行筛查，发现这种缺失多态性在将近八分之一的东亚个人体内发生，但是在非洲人和欧洲人体内并没有发现，说明BIM缺失多态性具有人种差异。
进一步研究东亚癌症患者对药物伊马替尼(imatinib)的反应，发现含有这种缺失多态性的CML患者更易产生耐药性。而在EGFR NSCLC患者体内，这种缺失多态性与药物(例如，吉非替尼)反应的持续时间相关联，携带这种缺失突变的EGFR突变阳性患者平均无进展存活期限为大约6个半月时间，而没有这种缺失突变的EGFR突变阳性患者则为将近12个月。体外实验证明，BH3-类似物药物例如ABT-737可以克服含BIM缺失突变的两种癌细胞的TKIs耐药性。
因此，需要开发简便易行的、准确率高、灵敏度高、结果判定方式简洁、直观、准确的诊断试剂盒，用于临床检测BIM缺失突变，来对机体进行TKIs耐药性风险评估，并指导机体的个体化治疗方案。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种检测BIM基因缺失突变的试剂盒，至少包含两对扩增引物：（1）能扩增SEQ ID NO:5中的一段序列（“第一扩增序列”）并且形成一个小于1000bp的扩增产物（“第一扩增子”）的第一扩增引物对，所述第一扩增引物对要么不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列、要么扩增SEQ ID NO:1的一段序列产生一个比第一扩增子长2903bp的扩增子，而最好是不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列，即不能以含有SEQ ID NO:1序列的DNA为模板PCR扩增产生扩增产物；（2）不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列、但能扩增SEQ ID NO:1中的一段序列（“第二扩增序列”）产生一个扩增DNA产物（“第二扩增子”）的第二扩增引物对。优选地，其中所述第一扩增子与第二扩增子核苷酸碱基长度不同，最好熔解温度也不同，最好相差0.5摄氏度以上。优选地，其中所述第一扩增子与第二扩增子核苷酸碱基长度相差至少5个碱基对、至少10个碱基对、至少50个碱基对、或者至少100个碱基对。优选地，其中所述第一扩增子与第二扩增子熔解温度相差至少2摄氏度、至少3摄氏度、至少5摄氏度。
在一个实施方案中，本发明的上述试剂盒还包含第三对扩增引物，这对引物不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列、但能扩增SEQ ID NO:1中的一段序列（“第三扩增序列”）产生一个DNA扩增产物（“第三扩增子”），而且上述第二扩增序列和此第三扩增序列不完全相同。优选地，其中上述第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子长度各不相同（即含不同数目的碱基对），最好熔解温度也各不同，最好互相之间相差0.5摄氏度以上，这样，扩增反应之后，就可以利用熔解曲线分析扩增产物，直观地判定每个扩增子的存在与否。优选地，其中上述第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子长度各不相同（即含不同数目的碱基对），两两相差至少5个碱基对、至少10个碱基对、至少50个碱基对、或者至少100个碱基对。优选地，其中上述第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子熔解温度各不相同，两两相差至少2摄氏度、至少3摄氏度、或者至少5摄氏度。
在另一个不同实施方案中，第三对扩增引物能扩增SEQ ID NO:5的另一个序列（“第三扩增序列”），即用含有SEQ ID NO:5序列的DNA为模板PCR扩增可以产生一个特异扩增产物（“第三扩增子”），但不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列，即用含有SEQ ID NO:1序列的DNA为模板不能特异性地扩增出产物。另外，所扩增的第三扩增序列与上述第一扩增序列不能完全相同，但可以部分重叠。优选地，其中上述第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子长度各不同（即含不同数目的碱基对），最好熔解温度也各不同，最好互相之间相差0.5摄氏度以上，这样这些扩增子就可以利用熔解曲线分析，直观地判定每个扩增子的存在与否。优选地，其中上述第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子长度各不相同（即含不同数目的碱基对），两两相差至少5个碱基对、至少10个碱基对、至少50个碱基对、或者至少100个碱基对。优选地，其中上述第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子熔解温度各不相同，两两相差至少2摄氏度、至少3摄氏度、或者至少5摄氏度。
优选地，所述第一、第二、和第三扩增子的长度都小于或等于300bp.
SEQ ID NO:1为BIM基因野生型序列，其中包括东亚人种里常见的缺失突变基因中所缺失的2903 bp序列。SEQ ID NO:2是BIM基因中位于上述2903 bp序列5’端的部分序列。SEQ ID NO:3是上述2903 bp序列，即缺失突变基因中所缺失部分。SEQ ID NO:4是BIM基因中位于上述2903 bp序列3’端的部分序列。SEQ ID NO:5为含有所述缺失突变的BIM基因序列，即缺失了SEQ ID NO:3所列的2903 bp序列的BIM基因序列。SEQ ID NO:6是SEQ ID NO:5中位于缺失突变两侧的部分序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种检测BIM基因缺失突变的方法，包括：用第一扩增引物对扩增SEQ ID NO:5中的第一扩增序列形成一个小于1000bp的扩增子，其中所述第一扩增引物对要么不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列、要么扩增SEQ ID NO:1的一段序列产生一个比第一扩增子长2903bp的扩增子；以第二扩增引物对扩增SEQ ID NO:1中的一段第二扩增序列产生第二扩增子，其中所述第二扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列；并且分析所述第一扩增子和第二扩增子。 换而言之，本发明提供了第一扩增引物对和第二扩增引物对联合用于制备检测BIM基因缺失突变的试剂盒的应用，其中所述第一扩增引物对扩增SEQ ID NO:5中的第一扩增序列形成一个小于1000bp的扩增子，并且所述第一扩增引物对要么不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列、要么扩增SEQ ID NO:1的一段序列产生一个比第一扩增子长2903bp的扩增子，而其中所述第二扩增引物对扩增SEQ ID NO:1中的一段第二扩增序列产生第二扩增子，并且所述第二扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列。
在一个实施方案中，还包括以第三扩增引物对扩增SEQ ID NO:1中的一段第三扩增序列产生第三扩增子，其中所述第三扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列，并且分析第三扩增子。在另一个实施方案中，还包括以第三扩增引物对扩增SEQ ID NO:5中的一个第三扩增序列形成第三扩增子，其中所述第三扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列，其中所述第一和第三扩增序列不完全相同，以及分析第三扩增子。
根据本发明的检测方法，可以用取自一个待测者（例如健康人或者肿瘤病人）的细胞基因组DNA做模板进行PCR扩增，如果用第一扩增引物对扩增产生一个小于1000bp的扩增子，则表明样本中含有突变BIM基因，即缺失了SEQ ID NO:3所列的2903 bp序列的BIM基因。而如果以第二扩增引物对扩增产生所述第二扩增子，则表明样本中存在野生型BIM基因。如果用第一扩增引物对扩增产生一个小于1000bp的扩增子，以第二扩增引物对扩增产生所述第二扩增子，那么就说明样本中同时存在突变BIM基因和野生型BIM基因。优选地，在上述扩增同时以第三扩增引物对扩增样本，所述第三扩增引物对能够扩增SEQ ID NO:1中的一段第三扩增序列产生第三扩增子但不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列。如果用第一扩增引物对扩增产生一个小于1000bp的第一扩增子，以第二扩增引物对扩增产生所述第二扩增子，以第三扩增引物对扩增产生一个第三扩增子，则表明样本中BIM基因型是杂合的，即同时含有缺失突变BIM基因和野生BIM基因。如果只产生第一扩增子，则表明样本中BIM基因纯合突变。如果只产生第二扩增子和第三扩增子，而不产生第一扩增子，则说明样本中BIM基因纯合野生。优选地，三个扩增子设计成各自熔解温度各不相同，两两相差至少2摄氏度、至少3摄氏度、或者至少5摄氏度。这时，如果用DNA熔解曲线分析，例如用染料法进行PCR扩增后，产生三个熔解峰就说明样本中BIM基因型是杂合的，如果只出现一个峰就表明样本中BIM基因型是纯合突变，如果只出现两个峰就表明样本中BIM基因型是纯合野生。因此，根据熔解曲线峰的数目就可以直观地判断BIM基因型。
优选地，用第一扩增引物对扩增SEQ ID NO:5中的第一扩增序列形成一个小于1000bp的扩增子，其中所述第一扩增引物对要么不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列、要么扩增SEQ ID NO:1的一段序列产生一个比第一扩增子长2903bp的扩增子；以第二扩增引物对扩增SEQ ID NO:1中的一段第二扩增序列产生第二扩增子，其中所述第二扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列。同时以第三扩增引物对扩增样本，所述第三扩增引物对能够扩增SEQ ID NO:5中的一个第三扩增序列形成第三扩增子，其中所述第三扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列，并且所述第一和第三扩增序列不完全相同。如果用第一扩增引物对扩增产生一个小于1000bp的第一扩增子，以第二扩增引物对扩增产生所述第二扩增子，以第三扩增引物对扩增产生一个第三扩增子，则表明样本中BIM基因型是杂合的，即同时含有缺失突变BIM基因和野生BIM基因。如果只产生第一和第三扩增子，则表明样本中BIM基因纯合突变。如果只产生第二扩增子，而不产生第一扩增子和第三扩增子，则说明样本中BIM基因纯合野生。优选地，三个扩增子设计成各自熔解温度各不相同，两两相差至少2摄氏度、至少3摄氏度、或者至少5摄氏度。这时，如果用DNA熔解曲线分析，例如用染料法进行PCR扩增后，产生三个熔解峰就说明样本中BIM基因型是杂合的，如果只出现一个峰就表明样本中BIM基因型是纯合野生，如果只出现两个峰就表明样本中BIM基因型是纯合突变。 因此，根据熔解曲线峰的数目就可以直观地判断BIM基因型。
待测样本可以是任何含有BIM基因的样本，可以是包含正常细胞，例如血液样本、口腔粘膜样本、毛发样本等等；也可以是肿瘤样本。
SEQ ID NO:1 （野生型序列）
ACCTAATTGTGGCTGTGAGGGCATGTGGTCTCAGGGTGGGTTTTCCTATATTGCAAGATAACCTAGGAATGCAAAATTGATGCCAGATACCCTGTTTCAACATTGACAGCTGATTCAGATTTTGAAAACATTGTACAAGCTGAAAAGAAACATCTGCAGACTTGATTTGGCCCTTGAACCTACAGCATGTGACTTTGGGTACATACTTTGGGTAACCTTGGTGAGGGGCTGAGTCTGTGTTGATCGACTTGCTGTTCCCCACCAATGGAAAAGGTTCATGTCTTGATCAGTAGTCAATCACATTGACCATTTGTCCAGATTAGCTTGCCATACATGAACAAGATAGAAGTAAGTTGGTAGAGTTATCAATTAGGAAACCCAGTACAGAGTCTATTATAATTTAGATTGTACCTCATGATGAAGGCTAACTCAACAAACCCATCAGAACAGACACTGGAACAAAATGACATTTCTAAATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAGGCTTCAGTGAGGTAAATCAGGCAGGCCTTTGCCCATGT TATAGAATTGGAAAGAACCTCAGAGTGGTGGTCACTTGTCAGAGGTTGGGCACACCTGTGAGGTGGTGGGGAGAAAT GACAGACATCCCAGCAGCTACACATGCTGGCTGCACGTCTCTTGCCAAATGCCAGGAGGTAATTTTTTAGGGTCCCT CCTTAGGGAAAGGGGCTGGAAGTTTTATTATTGCTGTTACTACTGCTCGTGAACTCATTTCAGCCTTAGAAGTTCTT GGCTTGTAGTTTTTGTTGTACTCATGAAAATGCTCCCCCATATATATGATCATTCTCGCTTACTATAACATCCTTGC TTACTAAATGAGTTAACAGGGCTTTATGGTGTGTATCGTGAAACACACGTGCATTAAAGACCCTCTGGAAGGTATTA GCTTTTCACACTTTCACAACAAAAGCTTCACACTTGTGGTTATTAAGCTATTTTCTCTAACCAGTTCCCTTTCAAGC AAAATGCATACATTGGTCTCTGTAGGTGATGGGTTAATGCATGGAAATAGTTTCTCCTTCCCTGGAACTGGGAATAG TGGGTGAGATAGTGTATTTTTTAATGTAAAGACAGGCACAAATGCTTTTTTTGTTGATAAATACTATTTTACAAGCT AATTATAAGTTAAGCACTGTTACTTGAGATGAAATATACAGGGCTTCAAAGATCATAATCTAAATAATTATGCACAG CTAATGGTTATACCTGTGAAGTAAAGTAGTGGATCCTGAGGTGTAATTTTATAGTATTAGCTGCATTTCAGTAGATG GTGTGATGAAGAGTTTAATGCATAGGATTAAATGAGAAGTTACGAGGAGTTTGTTTAAAGTTAATGTACCGAGGTAA GTTTTCAGTGTTAAGTTTTTGGGAGATTTGTTTTGGGAGAGGATGAGTTGGGGTTGGGGGAGGAAAGGACTTAGCCA GATGTGAGTTTCTTAAATTGAAGCATAAAATTTACAATTTATGTAGTCCATAATTTTCTCTGGACATTCTACAGTCT TAGTTCATGCCTGAAGACCACTGAAATAATGCTGAGTTGATAAGTGGTTCTCTTGACTTTGTTTAGTATTCTTTACT CAACCCTATCCATGAAGTTCTTCAATGAAGCTTTTGATAATTTATTGCAAAATACATTTTCCACAAAGAAGTCATTA TGATTGGTTTGAACTAGTGGAACACAAATGTGAGGTTATAAAGAGGTTCGCCTTAGCCAGGGGCTCCTTTAGCTGCA AAGCAGTTTTTTGCTCAGCAACTTGGGGTAGAGATCAGTGTGTCTTGAAGTTTTGTTTTGCAAAACTTTGTTCTAAT GAGAAAGTCAAGTCTTAGGAGGAATGTATAGTAGTTGAGTGTTTGTATTAACACTGTTTTCATATTTTCCTTTTATG TCTCTGATTTTTCTGAAGACAAGTTCAAGGAATATATTTCTCTGTGGGGCAACAGATACAGTTTTTTCACTTTTCCT CAATTTTAGTCTCCTTACACTCTGGGAGGATTAACTTGACAAATGATACCTTAGTGAATAACTGATTATTTTTATCA AAATCACTCACATGTGTTGGTTTACTGAGTGCCTTTTTGGATGAGTGTTTTATGCCATATGTGTTTTTAATGGAAAT TAAAGTGTAGTCAGTACACTAAAGTGTAGTCAGTACAATTGGAAATAAGAGTTGAGAAAAGTCAGGATATGGAGGAA TGCTCCCTAGTGTCATGTTAGTAAATGTCTTAAATTTTATACTTGTTCCCTGGCACATTGGAATTCACAGATGGGAG TTAATGGCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCAGCGTCTTGTGGGTACTTCTCTTATAGCTGGTACTTGTCTGA CCCCTCCTTTAGTTTGTGAGCTCCCTGGGCGGGGAATAATGGCCTGCAGATGCTAGCGAGTGCCTGACAAAGAGGAG AAGCCCAGGAGATGTTGAGAGTCAGTCCAGCTCTGCCTGTTAGCCTTTCAGACAAATAAAGTTGAAGAAGGCAGGTA GCAAGAAAAAGATCCTGACCTCTGCTCTGCCAAAGTGTTTTTAATTACCTGGATCTAGCTGTAAGGTTTGCCACGTA GTGGTGACAGCTGAGGTCTAGCTCAGCACTACTCAGCAGGGAAGCCACACATGCATTAAGCACTTGACATAGGACTA GTCTGAACTGAGTTGTGCTGTCATTATTGATACACACTGGATTTTGAGGAGACAAAAAAGAATGCAAAATAGTTTAA TTGTTTTCATATGGGTTACATGTTGAAATGGTGTTTTAAATATATAGGTTAAATAAAATATAAACTTGTATTGCAGT TAAACACAAAGCGTAAAATTTACCATCTGAACCATTTATTTCTAAGTGTACTGTTCAGTAGTGTTAAGTGCACTTAT TTTGTTGTGCGGCCAATCTCCAGAACTTCTTCACCTTGCAAAACAGAAATTCTGTACTCATTAAACAACTCCCCATT TCCCCCTCCCCCCAGCTTCTGACAACCACCATTCTATTTTCTGTCTATTAATTTGACAACTTCAGATACCTTATATA AGTGAAATTTATATAGTATTTGCTCTTCCATGACAGGCTTATTTCACTTAGCGTAATGTCGTCAGGGTTCATTTATC TTGCAACATGTCAGAATTTCCTTCCTTTTTAAGGCTGAAGGTTGTTCCAGTGTGTGTATATCACATACTTCATTTAT CCATTCATCCATCAGGAGATACTTGGGTTGCTTCCACTTTTTGGCTATTGTGAGTAGTGCTGCTATGAACATGGGTA TGCAAATATCTTTTGGGGGATTCTGCTTTGAATTTTTTTGGATATATACTTGGAAGTGGAATTGCTGGATCATATGG TAATTCTATTTTTAATTTTTTGGGGAACCATCATGCTGTTCTCCATAGAGGCTGTGCCATTTTACATTCCCACCAACAGGGCACAAGGGTTCCAGTTTCTCCACATACTTACCAACACTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGTAGTCATCCTAGAGGATATAGGTGATCTTTCACTGTGCTTTGGATTTATATTTACTGGCTTAGATTTGTATGGCCACCACCATAGTCAAGATACAGAACAACTCAACCACAAGGATTTCTCATGATACCTTTTTATAGCCACAGCCACCTCTCTCCCTCTTCCTTGAGCATTTTGTCATATGGTCATTGGTGATTAAATAAAATGTATTTTAATATTGACTTTCTCTGTTTCTTTCTACCTTTTTAAACATGGCTACTAGAAAAATGCACAATTAGATTTGTGGCTGGTGTTCTGTTTCATCTAAACAGGCTGGCCTCACAGAGGAGCTGGAGTGTGCAGTGCTGCTCTAGCAAGCCAGGCTTGACTCTTCCCACTCAGGGCACATCACTTCCATGAAGCTTACTCCTTGGGTTGTTTGGTTGACTTAGGAGAATGGAAGTGATTAGCAGAATCTTGTAAGCATTTTAAACATTAAATGAGCATTGTAAACAGCGGCATTCTTCAGGCAAATACAGTTTTGTTTTACCTCTTTAAATTCCATGGTATATTCGGACTTCAAAAAGTAGATGGTAGAGCACATGCTTTCTCAGCACCTTCAGGCTGCCTGGAGCCTCCCAATAGAGGTGTCTTCGAGGGAGTCCCAGCTCTGTCTCTGAAACCCCAAAGTTACTTGTTTGACACCAAGAGAAATAAGGAAACTTTTTAGGTCCTAAGTGGGGAGAGAAAGTGCTAGAAGAGAAAGATATTTTTCTTTACTAGTTCCAAACACATTTATTAATTGTTAGTTACCCAATTTTAAATTTACATCTTAAAAAAATTTTTTTTCAGATAATTACAGATTCACATGCATTTATAGGAAATAATACAAAGAAATTGTATATGCCATTCACCCA
带下划线部分为突变删除序列(2903bp)。
SEQ ID NO:2 (缺失序列5’端毗邻序列)
ACCTAATTGTGGCTGTGAGGGCATGTGGTCTCAGGGTGGGTTTTCCTATATTGCAAGATAACCTAGGAATGCAAAATTGATGCCAGATACCCTGTTTCAACATTGACAGCTGATTCAGATTTTGAAAACATTGTACAAGCTGAAAAGAAACATCTGCAGACTTGATTTGGCCCTTGAACCTACAGCATGTGACTTTGGGTACATACTTTGGGTAACCTTGGTGAGGGGCTGAGTCTGTGTTGATCGACTTGCTGTTCCCCACCAATGGAAAAGGTTCATGTCTTGATCAGTAGTCAATCACATTGACCATTTGTCCAGATTAGCTTGCCATACATGAACAAGATAGAAGTAAGTTGGTAGAGTTATCAATTAGGAAACCCAGTACAGAGTCTATTATAATTTAGATTGTACCTCATGATGAAGGCTAACTCAACAAACCCATCAGAACAGACACTGGAACAAAATGACATTTCTAAATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAGGCTTCAGTGAGGTAAATCA。
SEQ ID NO:3 (缺失部分)
GGCAGGCCTTTGCCCATGTTATAGAATTGGAAAGAACCTCAGAGTGGTGGTCACTTGTCAGAGGTTGGGCACACCTGTGAGGTGGTGGGGAGAAATGACAGACATCCCAGCAGCTACACATGCTGGCTGCACGTCTCTTGCCAAATGCCAGGAGGTAATTTTTTAGGGTCCCTCCTTAGGGAAAGGGGCTGGAAGTTTTATTATTGCTGTTACTACTGCTCGTGAACTCATTTCAGCCTTAGAAGTTCTTGGCTTGTAGTTTTTGTTGTACTCATGAAAATGCTCCCCCATATATATGATCATTCTCGCTTACTATAACATCCTTGCTTACTAAATGAGTTAACAGGGCTTTATGGTGTGTATCGTGAAACACACGTGCATTAAAGACCCTCTGGAAGGTATTAGCTTTTCACACTTTCACAACAAAAGCTTCACACTTGTGGTTATTAAGCTATTTTCTCTAACCAGTTCCCTTTCAAGCAAAATGCATACATTGGTCTCTGTAGGTGATGGGTTAATGCATGGAAATAGTTTCTCCTTCCCTGGAACTGGGAATAGTGGGTGAGATAGTGTATTTTTTAATGTAAAGACAGGCACAAATGCTTTTTTTGTTGATAAATACTATTTTACAAGCTAATTATAAGTTAAGCACTGTTACTTGAGATGAAATATACAGGGCTTCAAAGATCATAATCTAAATAATTATGCACAGCTAATGGTTATACCTGTGAAGTAAAGTAGTGGATCCTGAGGTGTAATTTTATAGTATTAGCTGCATTTCAGTAGATGGTGTGATGAAGAGTTTAATGCATAGGATTAAATGAGAAGTTACGAGGAGTTTGTTTAAAGTTAATGTACCGAGGTAAGTTTTCAGTGTTAAGTTTTTGGGAGATTTGTTTTGGGAGAGGATGAGTTGGGGTTGGGGGAGGAAAGGACTTAGCCAGATGTGAGTTTCTTAAATTGAAGCATAAAATTTACAATTTATGTAGTCCATAATTTTCTCTGGACATTCTACAGTCTTAGTTCATGCCTGAAGACCACTGAAATAATGCTGAGTTGATAAGTGGTTCTCTTGACTTTGTTTAGTATTCTTTACTCAACCCTATCCATGAAGTTCTTCAATGAAGCTTTTGATAATTTATTGCAAAATACATTTTCCACAAAGAAGTCATTATGATTGGTTTGAACTAGTGGAACACAAATGTGAGGTTATAAAGAGGTTCGCCTTAGCCAGGGGCTCCTTTAGCTGCAAAGCAGTTTTTTGCTCAGCAACTTGGGGTAGAGATCAGTGTGTCTTGAAGTTTTGTTTTGCAAAACTTTGTTCTAATGAGAAAGTCAAGTCTTAGGAGGAATGTATAGTAGTTGAGTGTTTGTATTAACACTGTTTTCATATTTTCCTTTTATGTCTCTGATTTTTCTGAAGACAAGTTCAAGGAATATATTTCTCTGTGGGGCAACAGATACAGTTTTTTCACTTTTCCTCAATTTTAGTCTCCTTACACTCTGGGAGGATTAACTTGACAAATGATACCTTAGTGAATAACTGATTATTTTTATCAAAATCACTCACATGTGTTGGTTTACTGAGTGCCTTTTTGGATGAGTGTTTTATGCCATATGTGTTTTTAATGGAAATTAAAGTGTAGTCAGTACACTAAAGTGTAGTCAGTACAATTGGAAATAAGAGTTGAGAAAAGTCAGGATATGGAGGAATGCTCCCTAGTGTCATGTTAGTAAATGTCTTAAATTTTATACTTGTTCCCTGGCACATTGGAATTCACAGATGGGAGTTAATGGCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCAGCGTCTTGTGGGTACTTCTCTTATAGCTGGTACTTGTCTGACCCCTCCTTTAGTTTGTGAGCTCCCTGGGCGGGGAATAATGGCCTGCAGATGCTAGCGAGTGCCTGACAAAGAGGAGAAGCCCAGGAGATGTTGAGAGTCAGTCCAGCTCTGCCTGTTAGCCTTTCAGACAAATAAAGTTGAAGAAGGCAGGTAGCAAGAAAAAGATCCTGACCTCTGCTCTGCCAAAGTGTTTTTAATTACCTGGATCTAGCTGTAAGGTTTGCCACGTAGTGGTGACAGCTGAGGTCTAGCTCAGCACTACTCAGCAGGGAAGCCACACATGCATTAAGCACTTGACATAGGACTAGTCTGAACTGAGTTGTGCTGTCATTATTGATACACACTGGATTTTGAGGAGACAAAAAAGAATGCAAAATAGTTTAATTGTTTTCATATGGGTTACATGTTGAAATGGTGTTTTAAATATATAGGTTAAATAAAATATAAACTTGTATTGCAGTTAAACACAAAGCGTAAAATTTACCATCTGAACCATTTATTTCTAAGTGTACTGTTCAGTAGTGTTAAGTGCACTTATTTTGTTGTGCGGCCAATCTCCAGAACTTCTTCACCTTGCAAAACAGAAATTCTGTACTCATTAAACAACTCCCCATTTCCCCCTCCCCCCAGCTTCTGACAACCACCATTCTATTTTCTGTCTATTAATTTGACAACTTCAGATACCTTATATAAGTGAAATTTATATAGTATTTGCTCTTCCATGACAGGCTTATTTCACTTAGCGTAATGTCGTCAGGGTTCATTTATCTTGCAACATGTCAGAATTTCCTTCCTTTTTAAGGCTGAAGGTTGTTCCAGTGTGTGTATATCACATACTTCATTTATCCATTCATCCATCAGGAGATACTTGGGTTGCTTCCACTTTTTGGCTATTGTGAGTAGTGCTGCTATGAACATGGGTATGCAAATATCTTTTGGGGGATTCTGCTTTGAATTTTTTTGGATATATACTTGGAAGTGGAATTGCTGGATCATATGGTAATTCTATTTTTAATTTTTTGGGGAACCATCATG。
SEQ ID NO:4 (缺失序列3’端毗邻序列)
CTGTTCTCCATAGAGGCTGTGCCATTTTACATTCCCACCAACAGGGCACAAGGGTTCCAGTTTCTCCACATACTTACCAACACTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGTAGTCATCCTAGAGGATATAGGTGATCTTTCACTGTGCTTTGGATTTATATTTACTGGCTTAGATTTGTATGGCCACCACCATAGTCAAGATACAGAACAACTCAACCACAAGGATTTCTCATGATACCTTTTTATAGCCACAGCCACCTCTCTCCCTCTTCCTTGAGCATTTTGTCATATGGTCATTGGTGATTAAATAAAATGTATTTTAATATTGACTTTCTCTGTTTCTTTCTACCTTTTTAAACATGGCTACTAGAAAAATGCACAATTAGATTTGTGGCTGGTGTTCTGTTTCATCTAAACAGGCTGGCCTCACAGAGGAGCTGGAGTGTGCAGTGCTGCTCTAGCAAGCCAGGCTTGACTCTTCCCACTCAGGGCACATCACTTCCATGAAGCTTACTCCTTGGGTTGTTTGGTTGACTTAGGAGAATGGAAGTGATTAGCAGAATCTTGTAAGCATTTTAAACATTAAATGAGCATTGTAAACAGCGGCATTCTTCAGGCAAATACAGTTTTGTTTTACCTCTTTAAATTCCATGGTATATTCGGACTTCAAAAAGTAGATGGTAGAGCACATGCTTTCTCAGCACCTTCAGGCTGCCTGGAGCCTCCCAATAGAGGTGTCTTCGAGGGAGTCCCAGCTCTGTCTCTGAAACCCCAAAGTTACTTGTTTGACACCAAGAGAAATAAGGAAACTTTTTAGGTCCTAAGTGGGGAGAGAAAGTGCTAGAAGAGAAAGATATTTTTCTTTACTAGTTCCAAACACATTTATTAATTGTTAGTTACCCAATTTTAAATTTACATCTTAAAAAAATTTTTTTTCAGATAATTACAGATTCACATGCATTTATAGGAAATAATACAAAGAAATTGTATATGCCATTCACCCA。
SEQ ID NO:5 (缺失突变序列)
ACCTAATTGTGGCTGTGAGGGCATGTGGTCTCAGGGTGGGTTTTCCTATATTGCAAGATAACCTAGGAATGCAAAATTGATGCCAGATACCCTGTTTCAACATTGACAGCTGATTCAGATTTTGAAAACATTGTACAAGCTGAAAAGAAACATCTGCAGACTTGATTTGGCCCTTGAACCTACAGCATGTGACTTTGGGTACATACTTTGGGTAACCTTGGTGAGGGGCTGAGTCTGTGTTGATCGACTTGCTGTTCCCCACCAATGGAAAAGGTTCATGTCTTGATCAGTAGTCAATCACATTGACCATTTGTCCAGATTAGCTTGCCATACATGAACAAGATAGAAGTAAGTTGGTAGAGTTATCAATTAGGAAACCCAGTACAGAGTCTATTATAATTTAGATTGTACCTCATGATGAAGGCTAACTCAACAAACCCATCAGAACAGACACTGGAACAAAATGACATTTCTAAATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAGGCTTCAGTGAGGTAAATCA|CTGTTCTCCATAGAGGCTGTGCCATTTTACATTCCCACCAACAGGGCACAAGGGTTCCAGTTTCTCCACATACTTACCAACACTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGTAGTCATCCTAGAGGATATAGGTGATCTTTCACTGTGCTTTGGATTTATATTTACTGGCTTAGATTTGTATGGCCACCACCATAGTCAAGATACAGAACAACTCAACCACAAGGATTTCTCATGATACCTTTTTATAGCCACAGCCACCTCTCTCCCTCTTCCTTGAGCATTTTGTCATATGGTCATTGGTGATTAAATAAAATGTATTTTAATATTGACTTTCTCTGTTTCTTTCTACCTTTTTAAACATGGCTACTAGAAAAATGCACAATTAGATTTGTGGCTGGTGTTCTGTTTCATCTAAACAGGCTGGCCTCACAGAGGAGCTGGAGTGTGCAGTGCTGCTCTAGCAAGCCAGGCTTGACTCTTCCCACTCAGGGCACATCACTTCCATGAAGCTTACTCCTTGGGTTGTTTGGTTGACTTAGGAGAATGGAAGTGATTAGCAGAATCTTGTAAGCATTTTAAACATTAAATGAGCATTGTAAACAGCGGCATTCTTCAGGCAAATACAGTTTTGTTTTACCTCTTTAAATTCCATGGTATATTCGGACTTCAAAAAGTAGATGGTAGAGCACATGCTTTCTCAGCACCTTCAGGCTGCCTGGAGCCTCCCAATAGAGGTGTCTTCGAGGGAGTCCCAGCTCTGTCTCTGAAACCCCAAAGTTACTTGTTTGACACCAAGAGAAATAAGGAAACTTTTTAGGTCCTAAGTGGGGAGAGAAAGTGCTAGAAGAGAAAGATATTTTTCTTTACTAGTTCCAAACACATTTATTAATTGTTAGTTACCCAATTTTAAATTTACATCTTAAAAAAATTTTTTTTCAGATAATTACAGATTCACATGCATTTATAGGAAATAATACAAAGAAATTGTATATGCCATTCACCCA。
SEQ ID NO:6 (缺失突变毗邻顺序）
GGCTTCAGTGAGGTAAATCA|CTGTTCTCCATAGAGGCTGT。
附图说明
图1，PCR扩增后在荧光定量PCR仪上直接进行熔解曲线分析，纯合野生基因组DNA给出两个峰的熔解曲线。
图2，PCR扩增后在荧光定量PCR仪上直接进行熔解曲线分析，纯合突变基因组DNA则给出一个单峰的熔解曲线。
图3，PCR扩增后在荧光定量PCR仪上直接进行熔解曲线分析，杂合突变突变基因组DNA 则给出三个峰的熔解曲线。
具体实施方式
实施例 1
设计三对引物如下：
扩增第一个野生型序列的引物对：
通用上游：BIM-FP:5' TAAATACCATCCAGCTCTGTCTTC 3' (SEQ ID NO:7)
野生下游：BIM-wRP: 5' ACCTCCTGGCATTTGGCAAG 3' (SEQ ID NO:8)
扩增突变型序列的引物对：
通用上游：BIM-FP:5' TAAATACCATCCAGCTCTGTCTTC 3' (SEQ ID NO:9)
突变下游：BIM-dRP: 5’-GGTAAGTATGTGGAGAAACTGG -3’ (SEQ ID NO:10)
扩增第二个野生型序列的引物对：
BIM-mFP：5' TGGGGTAGAGATCAGTGTGTCTTG 3' (SEQ ID NO:11)
BIM-mRP2：5' TCCTTGAACTTGTCTTCAGAAAAATC 3' (SEQ ID NO:12)
优化PCR反应体系
composition Volume(µl) Finial con
5XGotaq buffer 5 1X
dNTP(10mM) 0.5 200mM
EvaGreen (20X) 1
BIM-FP (10μM) 0.5 200nM
BIM-wRP (10μM) 0.25 100nM
BIM-dRP (10μM) 0.25 100nM
BIM-mFP (10μM) 0.5 200nM
BIM-mRP2 (10μM) 0.5 200nM
Mg2+(25mM) 1 2.5mM
buffferA 0.5 2%
Taq DNA polymerase (5U/µl) 0.15 0.75U
H2O 10.5
Template(10ng/μl) 5
Final volume 25
PCR反应程序：95℃ 5min——95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s (40cycles)
Melt: 72℃——90℃(0.2℃/step)
分别以野生型和突变性基因组DNA作为模板，PCR扩增，在荧光定量PCR仪上直接进行熔解曲线分析，纯合野生基因组DNA给出两个峰的熔解曲线，即分别扩增第一个野生型序列和第二个野生型序列的产物 （图1）。纯合突变基因组DNA 则给出一个单峰的熔解曲线，即用上述扩增突变型序列的引物对扩增的产物（图2）。而杂合突变突变基因组DNA 则给出三个峰的熔解曲线，即用上述三组引物对分别扩增的产物（图3）。因此根据熔解曲线中峰的数目即可直观地准确地得到BIM基因型。
实施例 2
设计三对引物如下：
扩增野生型序列的引物对：
上游：BIM-wFP-3: 5' AACTGGGAATAGTGGGTGAG 3' (SEQ ID NO:13)
下游：BIM-wRP-3: 5' TTTCATCTCAAGTAACAGTGC 3' (SEQ ID NO:14)
扩增突变型序列的引物对：
通用上游：BIM-dmFP: 5' CAGTGAGGTAAATCACTGTTC 3' (SEQ ID NO:15)
突变下游：BIM-dmRP-2: 5’- TGCCCTGTTGGGAATG -3’ (SEQ ID NO:16)
扩增第二个突变型序列的引物对：
通用上游：BIM-dmFP: 5' CAGTGAGGTAAATCACTGTTC 3' (SEQ ID NO:17)
突变下游: BIM-dmRP-3：5' GGTAAGTATGTGGAGAAACTGG 3' (SEQ ID NO:18)
优化PCR反应体系
composition Volume(µl) Finial con
5XGotaq buffer 5 1X
dNTP(10mM) 0.5 200mM
EvaGreen (20X) 1
BIM-FP (10μM) 0.5 200nM
BIM-wRP (10μM) 0.25 100nM
BIM-dRP (10μM) 0.25 100nM
BIM-mFP (10μM) 0.5 200nM
BIM-mRP2 (10μM) 0.5 200nM
Mg2+(25mM) 1 2.5mM
buffferA 0.5 2%
Taq DNA polymerase (5U/µl) 0.15 0.75U
H2O 10.5
Template(10ng/μl) 5
Final volume 25
PCR反应程序：95℃ 5min——95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s (40cycles)
Melt: 72℃——90℃(0.2℃/step)
分别以野生型和突变性基因组DNA作为模板，PCR扩增，在荧光定量PCR仪上直接进行熔解曲线分析，纯合突变基因组DNA给出两个峰的熔解曲线，即分别扩增第一个突变型序列和第二个突变型序列的产物。纯合野生基因组DNA 则给出一个单峰的熔解曲线，即用上述扩增野生型序列的引物对扩增的产物。而杂合突变突变基因组DNA 则给出三个峰的熔解曲线，即用上述三组引物对分别扩增的产物。因此根据熔解曲线中峰的数目即可直观地准确地得到BIM基因型。
序列表
<110>张以哲
<120>BIM基因突变检测方法和试剂盒
<160>18
<210>1
<211>4423
<212> DNA
<213>BIM基因
<400> 1
1 ACCTAATTGT GGCTGTGAGG GCATGTGGTC TCAGGGTGGG TTTTCCTATA TTGCAAGATA
61 ACCTAGGAAT GCAAAATTGA TGCCAGATAC CCTGTTTCAA CATTGACAGC TGATTCAGAT
121 TTTGAAAACA TTGTACAAGC TGAAAAGAAA CATCTGCAGA CTTGATTTGG CCCTTGAACC
181 TACAGCATGT GACTTTGGGT ACATACTTTG GGTAACCTTG GTGAGGGGCT GAGTCTGTGT
241 TGATCGACTT GCTGTTCCCC ACCAATGGAA AAGGTTCATG TCTTGATCAG TAGTCAATCA
301 CATTGACCAT TTGTCCAGAT TAGCTTGCCA TACATGAACA AGATAGAAGT AAGTTGGTAG
361 AGTTATCAAT TAGGAAACCC AGTACAGAGT CTATTATAAT TTAGATTGTA CCTCATGATG
421 AAGGCTAACT CAACAAACCC ATCAGAACAG ACACTGGAAC AAAATGACAT TTCTAAATAC
481 CATCCAGCTC TGTCTTCATA GGCTTCAGTG AGGTAAATCA GGCAGGCCTT TGCCCATGTT
541 ATAGAATTGG AAAGAACCTC AGAGTGGTGG TCACTTGTCA GAGGTTGGGC ACACCTGTGA
601 GGTGGTGGGG AGAAATGACA GACATCCCAG CAGCTACACA TGCTGGCTGC ACGTCTCTTG
661 CCAAATGCCA GGAGGTAATT TTTTAGGGTC CCTCCTTAGG GAAAGGGGCT GGAAGTTTTA
721 TTATTGCTGT TACTACTGCT CGTGAACTCA TTTCAGCCTT AGAAGTTCTT GGCTTGTAGT
781 TTTTGTTGTA CTCATGAAAA TGCTCCCCCA TATATATGAT CATTCTCGCT TACTATAACA
841 TCCTTGCTTA CTAAATGAGT TAACAGGGCT TTATGGTGTG TATCGTGAAA CACACGTGCA
901 TTAAAGACCC TCTGGAAGGT ATTAGCTTTT CACACTTTCA CAACAAAAGC TTCACACTTG
961 TGGTTATTAA GCTATTTTCT CTAACCAGTT CCCTTTCAAG CAAAATGCAT ACATTGGTCT
1021 CTGTAGGTGA TGGGTTAATG CATGGAAATA GTTTCTCCTT CCCTGGAACT GGGAATAGTG
1081 GGTGAGATAG TGTATTTTTT AATGTAAAGA CAGGCACAAA TGCTTTTTTT GTTGATAAAT
1141 ACTATTTTAC AAGCTAATTA TAAGTTAAGC ACTGTTACTT GAGATGAAAT ATACAGGGCT
1201 TCAAAGATCA TAATCTAAAT AATTATGCAC AGCTAATGGT TATACCTGTG AAGTAAAGTA
1261 GTGGATCCTG AGGTGTAATT TTATAGTATT AGCTGCATTT CAGTAGATGG TGTGATGAAG
1321 AGTTTAATGC ATAGGATTAA ATGAGAAGTT ACGAGGAGTT TGTTTAAAGT TAATGTACCG
1381 AGGTAAGTTT TCAGTGTTAA GTTTTTGGGA GATTTGTTTT GGGAGAGGAT GAGTTGGGGT
1441 TGGGGGAGGA AAGGACTTAG CCAGATGTGA GTTTCTTAAA TTGAAGCATA AAATTTACAA
1501 TTTATGTAGT CCATAATTTT CTCTGGACAT TCTACAGTCT TAGTTCATGC CTGAAGACCA
1561 CTGAAATAAT GCTGAGTTGA TAAGTGGTTC TCTTGACTTT GTTTAGTATT CTTTACTCAA
1621 CCCTATCCAT GAAGTTCTTC AATGAAGCTT TTGATAATTT ATTGCAAAAT ACATTTTCCA
1681 CAAAGAAGTC ATTATGATTG GTTTGAACTA GTGGAACACA AATGTGAGGT TATAAAGAGG
1741 TTCGCCTTAG CCAGGGGCTC CTTTAGCTGC AAAGCAGTTT TTTGCTCAGC AACTTGGGGT
1801 AGAGATCAGT GTGTCTTGAA GTTTTGTTTT GCAAAACTTT GTTCTAATGA GAAAGTCAAG
1861 TCTTAGGAGG AATGTATAGT AGTTGAGTGT TTGTATTAAC ACTGTTTTCA TATTTTCCTT
1921 TTATGTCTCT GATTTTTCTG AAGACAAGTT CAAGGAATAT ATTTCTCTGT GGGGCAACAG
1981 ATACAGTTTT TTCACTTTTC CTCAATTTTA GTCTCCTTAC ACTCTGGGAG GATTAACTTG
2041 ACAAATGATA CCTTAGTGAA TAACTGATTA TTTTTATCAA AATCACTCAC ATGTGTTGGT
2101 TTACTGAGTG CCTTTTTGGA TGAGTGTTTT ATGCCATATG TGTTTTTAAT GGAAATTAAA
2161 GTGTAGTCAG TACACTAAAG TGTAGTCAGT ACAATTGGAA ATAAGAGTTG AGAAAAGTCA
2221 GGATATGGAG GAATGCTCCC TAGTGTCATG TTAGTAAATG TCTTAAATTT TATACTTGTT
2281 CCCTGGCACA TTGGAATTCA CAGATGGGAG TTAATGGCTT TCTTTTTTTT TTTTTTTTTT
2341 TCCTCAGCGT CTTGTGGGTA CTTCTCTTAT AGCTGGTACT TGTCTGACCC CTCCTTTAGT
2401 TTGTGAGCTC CCTGGGCGGG GAATAATGGC CTGCAGATGC TAGCGAGTGC CTGACAAAGA
2461 GGAGAAGCCC AGGAGATGTT GAGAGTCAGT CCAGCTCTGC CTGTTAGCCT TTCAGACAAA
2521 TAAAGTTGAA GAAGGCAGGT AGCAAGAAAA AGATCCTGAC CTCTGCTCTG CCAAAGTGTT
2581 TTTAATTACC TGGATCTAGC TGTAAGGTTT GCCACGTAGT GGTGACAGCT GAGGTCTAGC
2641 TCAGCACTAC TCAGCAGGGA AGCCACACAT GCATTAAGCA CTTGACATAG GACTAGTCTG
2701 AACTGAGTTG TGCTGTCATT ATTGATACAC ACTGGATTTT GAGGAGACAA AAAAGAATGC
2761 AAAATAGTTT AATTGTTTTC ATATGGGTTA CATGTTGAAA TGGTGTTTTA AATATATAGG
2821 TTAAATAAAA TATAAACTTG TATTGCAGTT AAACACAAAG CGTAAAATTT ACCATCTGAA
2881 CCATTTATTT CTAAGTGTAC TGTTCAGTAG TGTTAAGTGC ACTTATTTTG TTGTGCGGCC
2941 AATCTCCAGA ACTTCTTCAC CTTGCAAAAC AGAAATTCTG TACTCATTAA ACAACTCCCC
3001 ATTTCCCCCT CCCCCCAGCT TCTGACAACC ACCATTCTAT TTTCTGTCTA TTAATTTGAC
3061 AACTTCAGAT ACCTTATATA AGTGAAATTT ATATAGTATT TGCTCTTCCA TGACAGGCTT
3121 ATTTCACTTA GCGTAATGTC GTCAGGGTTC ATTTATCTTG CAACATGTCA GAATTTCCTT
3181 CCTTTTTAAG GCTGAAGGTT GTTCCAGTGT GTGTATATCA CATACTTCAT TTATCCATTC
3241 ATCCATCAGG AGATACTTGG GTTGCTTCCA CTTTTTGGCT ATTGTGAGTA GTGCTGCTAT
3301 GAACATGGGT ATGCAAATAT CTTTTGGGGG ATTCTGCTTT GAATTTTTTT GGATATATAC
3361 TTGGAAGTGG AATTGCTGGA TCATATGGTA ATTCTATTTT TAATTTTTTG GGGAACCATC
3421 ATGCTGTTCT CCATAGAGGC TGTGCCATTT TACATTCCCA CCAACAGGGC ACAAGGGTTC
3481 CAGTTTCTCC ACATACTTAC CAACACTTTT TTTTTTTTTT TTTTAACAGT AGTCATCCTA
3541 GAGGATATAG GTGATCTTTC ACTGTGCTTT GGATTTATAT TTACTGGCTT AGATTTGTAT
3601 GGCCACCACC ATAGTCAAGA TACAGAACAA CTCAACCACA AGGATTTCTC ATGATACCTT
3661 TTTATAGCCA CAGCCACCTC TCTCCCTCTT CCTTGAGCAT TTTGTCATAT GGTCATTGGT
3721 GATTAAATAA AATGTATTTT AATATTGACT TTCTCTGTTT CTTTCTACCT TTTTAAACAT
3781 GGCTACTAGA AAAATGCACA ATTAGATTTG TGGCTGGTGT TCTGTTTCAT CTAAACAGGC
3841 TGGCCTCACA GAGGAGCTGG AGTGTGCAGT GCTGCTCTAG CAAGCCAGGC TTGACTCTTC
3901 CCACTCAGGG CACATCACTT CCATGAAGCT TACTCCTTGG GTTGTTTGGT TGACTTAGGA
3961 GAATGGAAGT GATTAGCAGA ATCTTGTAAG CATTTTAAAC ATTAAATGAG CATTGTAAAC
4021 AGCGGCATTC TTCAGGCAAA TACAGTTTTG TTTTACCTCT TTAAATTCCA TGGTATATTC
4081 GGACTTCAAA AAGTAGATGG TAGAGCACAT GCTTTCTCAG CACCTTCAGG CTGCCTGGAG
4141 CCTCCCAATA GAGGTGTCTT CGAGGGAGTC CCAGCTCTGT CTCTGAAACC CCAAAGTTAC
4201 TTGTTTGACA CCAAGAGAAA TAAGGAAACT TTTTAGGTCC TAAGTGGGGA GAGAAAGTGC
4261 TAGAAGAGAA AGATATTTTT CTTTACTAGT TCCAAACACA TTTATTAATT GTTAGTTACC
4321 CAATTTTAAA TTTACATCTT AAAAAAATTT TTTTTCAGAT AATTACAGAT TCACATGCAT
4381 TTATAGGAAA TAATACAAAG AAATTGTATA TGCCATTCAC CCA
<210>2
<211>520
<212> DNA
<213> BIM基因
<400> 2
1 ACCTAATTGT GGCTGTGAGG GCATGTGGTC TCAGGGTGGG TTTTCCTATA TTGCAAGATA
61 ACCTAGGAAT GCAAAATTGA TGCCAGATAC CCTGTTTCAA CATTGACAGC TGATTCAGAT
121 TTTGAAAACA TTGTACAAGC TGAAAAGAAA CATCTGCAGA CTTGATTTGG CCCTTGAACC
181 TACAGCATGT GACTTTGGGT ACATACTTTG GGTAACCTTG GTGAGGGGCT GAGTCTGTGT
241 TGATCGACTT GCTGTTCCCC ACCAATGGAA AAGGTTCATG TCTTGATCAG TAGTCAATCA
301 CATTGACCAT TTGTCCAGAT TAGCTTGCCA TACATGAACA AGATAGAAGT AAGTTGGTAG
361 AGTTATCAAT TAGGAAACCC AGTACAGAGT CTATTATAAT TTAGATTGTA CCTCATGATG
421 AAGGCTAACT CAACAAACCC ATCAGAACAG ACACTGGAAC AAAATGACAT TTCTAAATAC
481 CATCCAGCTC TGTCTTCATA GGCTTCAGTG AGGTAAATCA
<210>3
<211>2903
<212> DNA
<213> BIM基因
<400> 3
1 GGCAGGCCTT TGCCCATGTT ATAGAATTGG AAAGAACCTC AGAGTGGTGG TCACTTGTCA
61 GAGGTTGGGC ACACCTGTGA GGTGGTGGGG AGAAATGACA GACATCCCAG CAGCTACACA
121 TGCTGGCTGC ACGTCTCTTG CCAAATGCCA GGAGGTAATT TTTTAGGGTC CCTCCTTAGG
181 GAAAGGGGCT GGAAGTTTTA TTATTGCTGT TACTACTGCT CGTGAACTCA TTTCAGCCTT
241 AGAAGTTCTT GGCTTGTAGT TTTTGTTGTA CTCATGAAAA TGCTCCCCCA TATATATGAT
301 CATTCTCGCT TACTATAACA TCCTTGCTTA CTAAATGAGT TAACAGGGCT TTATGGTGTG
361 TATCGTGAAA CACACGTGCA TTAAAGACCC TCTGGAAGGT ATTAGCTTTT CACACTTTCA
421 CAACAAAAGC TTCACACTTG TGGTTATTAA GCTATTTTCT CTAACCAGTT CCCTTTCAAG
481 CAAAATGCAT ACATTGGTCT CTGTAGGTGA TGGGTTAATG CATGGAAATA GTTTCTCCTT
541 CCCTGGAACT GGGAATAGTG GGTGAGATAG TGTATTTTTT AATGTAAAGA CAGGCACAAA
601 TGCTTTTTTT GTTGATAAAT ACTATTTTAC AAGCTAATTA TAAGTTAAGC ACTGTTACTT
661 GAGATGAAAT ATACAGGGCT TCAAAGATCA TAATCTAAAT AATTATGCAC AGCTAATGGT
721 TATACCTGTG AAGTAAAGTA GTGGATCCTG AGGTGTAATT TTATAGTATT AGCTGCATTT
781 CAGTAGATGG TGTGATGAAG AGTTTAATGC ATAGGATTAA ATGAGAAGTT ACGAGGAGTT
841 TGTTTAAAGT TAATGTACCG AGGTAAGTTT TCAGTGTTAA GTTTTTGGGA GATTTGTTTT
901 GGGAGAGGAT GAGTTGGGGT TGGGGGAGGA AAGGACTTAG CCAGATGTGA GTTTCTTAAA
961 TTGAAGCATA AAATTTACAA TTTATGTAGT CCATAATTTT CTCTGGACAT TCTACAGTCT
1021 TAGTTCATGC CTGAAGACCA CTGAAATAAT GCTGAGTTGA TAAGTGGTTC TCTTGACTTT
1081 GTTTAGTATT CTTTACTCAA CCCTATCCAT GAAGTTCTTC AATGAAGCTT TTGATAATTT
1141 ATTGCAAAAT ACATTTTCCA CAAAGAAGTC ATTATGATTG GTTTGAACTA GTGGAACACA
1201 AATGTGAGGT TATAAAGAGG TTCGCCTTAG CCAGGGGCTC CTTTAGCTGC AAAGCAGTTT
1261 TTTGCTCAGC AACTTGGGGT AGAGATCAGT GTGTCTTGAA GTTTTGTTTT GCAAAACTTT
1321 GTTCTAATGA GAAAGTCAAG TCTTAGGAGG AATGTATAGT AGTTGAGTGT TTGTATTAAC
1381 ACTGTTTTCA TATTTTCCTT TTATGTCTCT GATTTTTCTG AAGACAAGTT CAAGGAATAT
1441 ATTTCTCTGT GGGGCAACAG ATACAGTTTT TTCACTTTTC CTCAATTTTA GTCTCCTTAC
1501 ACTCTGGGAG GATTAACTTG ACAAATGATA CCTTAGTGAA TAACTGATTA TTTTTATCAA
1561 AATCACTCAC ATGTGTTGGT TTACTGAGTG CCTTTTTGGA TGAGTGTTTT ATGCCATATG
1621 TGTTTTTAAT GGAAATTAAA GTGTAGTCAG TACACTAAAG TGTAGTCAGT ACAATTGGAA
1681 ATAAGAGTTG AGAAAAGTCA GGATATGGAG GAATGCTCCC TAGTGTCATG TTAGTAAATG
1741 TCTTAAATTT TATACTTGTT CCCTGGCACA TTGGAATTCA CAGATGGGAG TTAATGGCTT
1801 TCTTTTTTTT TTTTTTTTTT TCCTCAGCGT CTTGTGGGTA CTTCTCTTAT AGCTGGTACT
1861 TGTCTGACCC CTCCTTTAGT TTGTGAGCTC CCTGGGCGGG GAATAATGGC CTGCAGATGC
1921 TAGCGAGTGC CTGACAAAGA GGAGAAGCCC AGGAGATGTT GAGAGTCAGT CCAGCTCTGC
1981 CTGTTAGCCT TTCAGACAAA TAAAGTTGAA GAAGGCAGGT AGCAAGAAAA AGATCCTGAC
2041 CTCTGCTCTG CCAAAGTGTT TTTAATTACC TGGATCTAGC TGTAAGGTTT GCCACGTAGT
2101 GGTGACAGCT GAGGTCTAGC TCAGCACTAC TCAGCAGGGA AGCCACACAT GCATTAAGCA
2161 CTTGACATAG GACTAGTCTG AACTGAGTTG TGCTGTCATT ATTGATACAC ACTGGATTTT
2221 GAGGAGACAA AAAAGAATGC AAAATAGTTT AATTGTTTTC ATATGGGTTA CATGTTGAAA
2281 TGGTGTTTTA AATATATAGG TTAAATAAAA TATAAACTTG TATTGCAGTT AAACACAAAG
2341 CGTAAAATTT ACCATCTGAA CCATTTATTT CTAAGTGTAC TGTTCAGTAG TGTTAAGTGC
2401 ACTTATTTTG TTGTGCGGCC AATCTCCAGA ACTTCTTCAC CTTGCAAAAC AGAAATTCTG
2461 TACTCATTAA ACAACTCCCC ATTTCCCCCT CCCCCCAGCT TCTGACAACC ACCATTCTAT
2521 TTTCTGTCTA TTAATTTGAC AACTTCAGAT ACCTTATATA AGTGAAATTT ATATAGTATT
2581 TGCTCTTCCA TGACAGGCTT ATTTCACTTA GCGTAATGTC GTCAGGGTTC ATTTATCTTG
2641 CAACATGTCA GAATTTCCTT CCTTTTTAAG GCTGAAGGTT GTTCCAGTGT GTGTATATCA
2701 CATACTTCAT TTATCCATTC ATCCATCAGG AGATACTTGG GTTGCTTCCA CTTTTTGGCT
2761 ATTGTGAGTA GTGCTGCTAT GAACATGGGT ATGCAAATAT CTTTTGGGGG ATTCTGCTTT
2821 GAATTTTTTT GGATATATAC TTGGAAGTGG AATTGCTGGA TCATATGGTA ATTCTATTTT
2881 TAATTTTTTG GGGAACCATC ATG
<210>4
<211>1000
<212> DNA
<213> BIM基因
<400>4
1 CTGTTCTCCA TAGAGGCTGT GCCATTTTAC ATTCCCACCA ACAGGGCACA AGGGTTCCAG
61 TTTCTCCACA TACTTACCAA CACTTTTTTT TTTTTTTTTT TAACAGTAGT CATCCTAGAG
121 GATATAGGTG ATCTTTCACT GTGCTTTGGA TTTATATTTA CTGGCTTAGA TTTGTATGGC
181 CACCACCATA GTCAAGATAC AGAACAACTC AACCACAAGG ATTTCTCATG ATACCTTTTT
241 ATAGCCACAG CCACCTCTCT CCCTCTTCCT TGAGCATTTT GTCATATGGT CATTGGTGAT
301 TAAATAAAAT GTATTTTAAT ATTGACTTTC TCTGTTTCTT TCTACCTTTT TAAACATGGC
361 TACTAGAAAA ATGCACAATT AGATTTGTGG CTGGTGTTCT GTTTCATCTA AACAGGCTGG
421 CCTCACAGAG GAGCTGGAGT GTGCAGTGCT GCTCTAGCAA GCCAGGCTTG ACTCTTCCCA
481 CTCAGGGCAC ATCACTTCCA TGAAGCTTAC TCCTTGGGTT GTTTGGTTGA CTTAGGAGAA
541 TGGAAGTGAT TAGCAGAATC TTGTAAGCAT TTTAAACATT AAATGAGCAT TGTAAACAGC
601 GGCATTCTTC AGGCAAATAC AGTTTTGTTT TACCTCTTTA AATTCCATGG TATATTCGGA
661 CTTCAAAAAG TAGATGGTAG AGCACATGCT TTCTCAGCAC CTTCAGGCTG CCTGGAGCCT
721 CCCAATAGAG GTGTCTTCGA GGGAGTCCCA GCTCTGTCTC TGAAACCCCA AAGTTACTTG
781 TTTGACACCA AGAGAAATAA GGAAACTTTT TAGGTCCTAA GTGGGGAGAG AAAGTGCTAG
841 AAGAGAAAGA TATTTTTCTT TACTAGTTCC AAACACATTT ATTAATTGTT AGTTACCCAA
901 TTTTAAATTT ACATCTTAAA AAAATTTTTT TTCAGATAAT TACAGATTCA CATGCATTTA
961 TAGGAAATAA TACAAAGAAA TTGTATATGC CATTCACCCA
<210>5
<211>1520
<212> DNA
<213> BIM基因
<400>5
1 ACCTAATTGT GGCTGTGAGG GCATGTGGTC TCAGGGTGGG TTTTCCTATA TTGCAAGATA
61 ACCTAGGAAT GCAAAATTGA TGCCAGATAC CCTGTTTCAA CATTGACAGC TGATTCAGAT
121 TTTGAAAACA TTGTACAAGC TGAAAAGAAA CATCTGCAGA CTTGATTTGG CCCTTGAACC
181 TACAGCATGT GACTTTGGGT ACATACTTTG GGTAACCTTG GTGAGGGGCT GAGTCTGTGT
241 TGATCGACTT GCTGTTCCCC ACCAATGGAA AAGGTTCATG TCTTGATCAG TAGTCAATCA
301 CATTGACCAT TTGTCCAGAT TAGCTTGCCA TACATGAACA AGATAGAAGT AAGTTGGTAG
361 AGTTATCAAT TAGGAAACCC AGTACAGAGT CTATTATAAT TTAGATTGTA CCTCATGATG
421 AAGGCTAACT CAACAAACCC ATCAGAACAG ACACTGGAAC AAAATGACAT TTCTAAATAC
481 CATCCAGCTC TGTCTTCATA GGCTTCAGTG AGGTAAATCA CTGTTCTCCA TAGAGGCTGT
541 GCCATTTTAC ATTCCCACCA ACAGGGCACA AGGGTTCCAG TTTCTCCACA TACTTACCAA
601 CACTTTTTTT TTTTTTTTTT TAACAGTAGT CATCCTAGAG GATATAGGTG ATCTTTCACT
661 GTGCTTTGGA TTTATATTTA CTGGCTTAGA TTTGTATGGC CACCACCATA GTCAAGATAC
721 AGAACAACTC AACCACAAGG ATTTCTCATG ATACCTTTTT ATAGCCACAG CCACCTCTCT
781 CCCTCTTCCT TGAGCATTTT GTCATATGGT CATTGGTGAT TAAATAAAAT GTATTTTAAT
841 ATTGACTTTC TCTGTTTCTT TCTACCTTTT TAAACATGGC TACTAGAAAA ATGCACAATT
901 AGATTTGTGG CTGGTGTTCT GTTTCATCTA AACAGGCTGG CCTCACAGAG GAGCTGGAGT
961 GTGCAGTGCT GCTCTAGCAA GCCAGGCTTG ACTCTTCCCA CTCAGGGCAC ATCACTTCCA
1021 TGAAGCTTAC TCCTTGGGTT GTTTGGTTGA CTTAGGAGAA TGGAAGTGAT TAGCAGAATC
1081 TTGTAAGCAT TTTAAACATT AAATGAGCAT TGTAAACAGC GGCATTCTTC AGGCAAATAC
1141 AGTTTTGTTT TACCTCTTTA AATTCCATGG TATATTCGGA CTTCAAAAAG TAGATGGTAG
1201 AGCACATGCT TTCTCAGCAC CTTCAGGCTG CCTGGAGCCT CCCAATAGAG GTGTCTTCGA
1261 GGGAGTCCCA GCTCTGTCTC TGAAACCCCA AAGTTACTTG TTTGACACCA AGAGAAATAA
1321 GGAAACTTTT TAGGTCCTAA GTGGGGAGAG AAAGTGCTAG AAGAGAAAGA TATTTTTCTT
1381 TACTAGTTCC AAACACATTT ATTAATTGTT AGTTACCCAA TTTTAAATTT ACATCTTAAA
1441 AAAATTTTTT TTCAGATAAT TACAGATTCA CATGCATTTA TAGGAAATAA TACAAAGAAA
1501 TTGTATATGC CATTCACCCA
<210>6
<211>40
<212> DNA
<213> BIM基因
<400>6
1 GGCTTCAGTG AGGTAAATCA CTGTTCTCCA TAGAGGCTGT
<210>7
<211>24
<212> DNA
<213>人工合成
<400>7
1 TAAATACCAT CCAGCTCTGT CTTC
<210>8
<211>20
<212> DNA
<213>人工合成
<400>8
1 ACCTCCTGGC ATTTGGCAAG
<210>9
<211>24
<212> DNA
<213>人工合成
<400>9
1 TAAATACCAT CCAGCTCTGT CTTC
<210>10
<211>22
<212> DNA
<213>人工合成
<400>10
1 GGTAAGTATG TGGAGAAACT GG
<210>11
<211>24
<212> DNA
<213>人工合成
<400>11
1 TGGGGTAGAG ATCAGTGTGT CTTG
<210>12
<211>26
<212> DNA
<213>人工合成
<400>12
1 TCCTTGAACT TGTCTTCAGA AAAATC
<210>13
<211>20
<212> DNA
<213>人工合成
<400>13
1 AACTGGGAAT AGTGGGTGAG
<210>14
<211>21
<212> DNA
<213>人工合成
<400>14
1 TTTCATCTCA AGTAACAGTG C
<210>15
<211>21
<212> DNA
<213>人工合成
<400>15
1 CAGTGAGGTA AATCACTGTT C
<210>16
<211>16
<212> DNA
<213>人工合成
<400>16
1 TGCCCTGTTG GGAATG
<210>17
<211>21
<212> DNA
<213>人工合成
<400>17
1 CAGTGAGGTA AATCACTGTT C
<210>18
<211>22
<212> DNA
<213>人工合成
<400>18
1 GGTAAGTATG TGGAGAAACT GG

Claims (8)

1.一种检测BIM基因缺失突变的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含：
能扩增SEQ ID NO:5中的第一扩增序列形成一个小于1000bp的第一扩增子的第一扩增引物对，所述第一扩增引物对或者不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列、或者扩增SEQ ID NO:1的一段序列产生一个比第一扩增子长2903bp的扩增子；以及
不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列、但能扩增SEQ ID NO:1中的一段第二扩增序列产生第二扩增子的第二扩增引物对；
不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列、但能扩增SEQ ID NO:1中的一段第三扩增序列产生第三扩增子的第三扩增引物对，其中所述第二和第三扩增序列不完全相同。
2.一种检测BIM基因缺失突变的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含：
能扩增SEQ ID NO:5中的第一扩增序列形成一个小于1000bp的第一扩增子的第一扩增引物对，所述第一扩增引物对或者不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列、或者扩增SEQ ID NO:1的一段序列产生一个比第一扩增子长2903bp的扩增子；
不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列、但能扩增SEQ ID NO:1中的一段第二扩增序列产生第二扩增子的第二扩增引物对；以及
能扩增SEQ ID NO:5的第二扩增序列形成第三扩增子的第三扩增引物对，其中所述第三扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列，其中所述第一和第三扩增序列不完全相同。
3.根据权利要求1-2中任一所述试剂盒，其特征在于所述第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子的熔解温度各不相同。
4.根据权利要求3中所述试剂盒，其特征在于所述第一扩增引物对包含一个在扩增反应条件下与SEQ ID NO:6或其反义链特异性杂交但不与SEQ ID NO:1杂交的扩增引物。
5.根据权利要求3中所述试剂盒，其特征在于所述第二扩增引物对包含一个在扩增反应条件下与SEQ ID NO:3序列或其反义链特异性杂交的扩增引物。
6.根据权利要求3中所述试剂盒，其特征在于该试剂盒还包含下列试剂中的至少一种：聚合酶、荧光染料、缓冲溶液、脱氧核糖核酸。
7.第一扩增引物对、第二扩增引物对和第三扩增引物对在制备检测BIM基因缺失突变的试剂中的应用方法，其特征在于：所述第一扩增引物对扩增SEQ ID NO:5的第一扩增序列形成一个小于1000bp的第一扩增子，其中所述第一扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列、或者扩增SEQ ID NO:1的一段序列产生一个比所述第一扩增子长2903bp的扩增子；其中所述第二扩增引物对扩增SEQ ID NO:1中的一段第二扩增序列产生第二扩增子，其中所述第二扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列；第三扩增引物对能够扩增SEQ IDNO:1中的一段第三扩增序列产生第三扩增子，其中所述第三扩增引物对不能扩增SEQ IDNO:5中任何序列。
8.第一扩增引物对、第二扩增引物对和第三扩增引物对在制备检测BIM基因缺失突变的试剂中的应用方法，其特征在于：所述第一扩增引物对扩增SEQ ID NO:5的第一扩增序列形成一个小于1000bp的第一扩增子，所述第一扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列、或者扩增SEQ ID NO:1的一段序列产生一个比所述第一扩增子长2903bp的扩增子；所述第二扩增引物对扩增SEQ ID NO:1中的一段第二扩增序列产生第二扩增子，其中所述第二扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:5中任何序列；所述第三扩增引物对能够扩增SEQ ID NO:5的第三扩增序列形成第三扩增子，其中所述第三扩增引物对不能扩增SEQ ID NO:1中任何序列，其中所述第一和第三扩增序列不完全相同。
CN201410152233.3A 2013-04-16 2014-04-16 Bim基因突变检测方法和试剂盒 Active CN104073552B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410152233.3A CN104073552B (zh) 2013-04-16 2014-04-16 Bim基因突变检测方法和试剂盒

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310130460.1 2013-04-16
CN201310130460 2013-04-16
CN2013101304601 2013-04-16
CN201410152233.3A CN104073552B (zh) 2013-04-16 2014-04-16 Bim基因突变检测方法和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104073552A CN104073552A (zh) 2014-10-01
CN104073552B true CN104073552B (zh) 2016-09-07

Family

ID=51595155

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410152233.3A Active CN104073552B (zh) 2013-04-16 2014-04-16 Bim基因突变检测方法和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104073552B (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG182016A1 (en) * 2010-12-14 2012-07-30 Univ Singapore Method of detecting resistance to cancer therapy
CN103571923B (zh) * 2012-07-18 2015-06-17 益善生物技术股份有限公司 Bim基因缺失突变检测探针和液相芯片

Also Published As

Publication number Publication date
CN104073552A (zh) 2014-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tinat et al. 2009 version of the Chompret criteria for Li Fraumeni syndrome
McReynolds et al. MDS-associated mutations in germline GATA2 mutated patients with hematologic manifestations
Lin et al. Characterization of the DNA copy-number genome in the blood of cutaneous T-cell lymphoma patients
CN107849606A (zh) 提高下一代测序灵敏度的方法
Wardell et al. Changes in the human mitochondrial genome after treatment of malignant disease
CN101875972B (zh) Kras基因突变的快速检测
Chan et al. Detection of paternal alleles in maternal plasma for non-invasive prenatal diagnosis of β-thalassemia: a feasibility study in southern Chinese
Burmeister et al. Evidence-based RT-PCR methods for the detection of the 8 most common MLL aberrations in acute leukemias
Simonelli et al. Cerebrospinal fluid tumor DNA for liquid biopsy in glioma patients’ management: Close to the clinic?
CN104805206A (zh) 检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法
Schmit et al. Two novel RUNX1 mutations in a patient with congenital thrombocytopenia that evolved into a high grade myelodysplastic syndrome
Fuchs et al. CEBPA polymorphisms and mutations in patients with acute myeloid leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma and non-Hodgkin's lymphoma
Um et al. Proinflammatory cytokine IL-1 β polymorphisms in sudden sensorineural hearing loss
CN104480215B (zh) 一种基因联合检测方法及试剂盒
CN104073552B (zh) Bim基因突变检测方法和试剂盒
Um et al. Polymorphism of angiotensin-converting enzyme, angiotensinogen, and apolipoprotein E genes in Korean patients with cerebral infarction
Ismael et al. De novo childhood myelodysplastic/myeloproliferative disease with unique molecular characteristics
Gunes et al. AXIN2 polymorphism and its association with astrocytoma in a Turkish population
Setty et al. Sensitive determination of BRAF copy number in clinical samples by pyrosequencing
Li et al. DNMT3A mutations and prognostic significance in childhood acute lymphoblastic leukemia
WO2017084027A1 (zh) 一种用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒及检测方法
Rojansky et al. Cutaneous T-cell lymphomas with pathogenic somatic mutations and absence of detectable clonal T-cell receptor gene rearrangement: two case reports
Brown et al. The spectrum of β thalassaemia in Burma
Sartoris et al. Analysis of CIITA encoding AIR-1 gene promoters in insulin-dependent diabetes mellitus and rheumatoid arthritis patients from the northeast of Italy: absence of sequence variability
Hu et al. Genetic polymorphisms of STAT3 correlated with prognosis in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with rituximab

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20180817

Address after: 242000 19-2 buildings and 19-1 buildings of R & D building of Xuancheng science and Technology Park, Anhui economic and Technological Development Zone.

Patentee after: Digital Biotechnology (Xuancheng) Co., Ltd.

Address before: 313200 Deqing County sunshine garden, Huzhou, Zhejiang

Patentee before: Zhang Yizhe

TR01 Transfer of patent right