CN104071890B - 用微生物胞外碳酸酐酶去除碳酸钙垢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于工业水处理技术领域,具体涉及利用微生物胞外碳酸酐酶去除碳酸钙垢的方法。本发明要解决的技术问题是提供一种缓解工业循环水系统结生碳酸盐垢现象的方法。该方法能减少含磷废水排入环境水体。本发明的技术方案是利用微生物胞外碳酸酐酶去除碳酸钙垢的方法,包括如下步骤:1)制备分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌菌剂;2)冷冻离心,盐析粗提取出含碳酸酐酶的粗酶液;3)将粗酶液加入到生了碳酸盐水垢的工业循环水中。本发明方法可用于去除工业循环水系统中的碳酸钙垢,成本低,不污染环境。
Description
技术领域
本发明属于工业水处理技术领域,具体涉及利用微生物胞外碳酸酐酶去除碳酸钙垢的方法。
背景技术
工业用水系统中,碳酸钙垢的存在影响换热、循环水等的水质。运行一定时间后,工业锅炉的金属表面极易形成水垢,形成水垢的主要原因是锅炉给水中含有一定数量的钙、镁盐类,在锅炉内部受压力、温度等因素的影响发生物理和化学变化,生成各种类型的水垢。循环冷却水系统在工业生产用水中占有重要地位,占有工业用水量70%-80%。在冷却水循环利用过程中,水分不断蒸发,水中难溶盐离子浓度不断增加,逐渐达到饱和状态,可能从水中析出成垢。碳酸钙垢可能沉积在设备或管道表面结成水垢、污垢,不但降低了传热效率,增加能耗,给系统的安全、正常运行带来隐患,使得水处理剂无法及时到达金属表面而失效,加速了金属腐蚀的速度等,结垢严重时甚至可能导致停产。因此及时地去除水系统中的各类污垢,不仅仅是节能、安全的需要,也是延长设备使用寿命的需要。
阻垢剂的发展经历了从最初的天然有机物到无机聚磷酸盐,直至现在的全有机配方聚合物的过程。上世纪三十年代开始,人们开始研究冷却水。由于水资源的限制和成本的制约,冷却水已由直流水改为了循环水。水的循环使水中盐类浓缩,二氧化碳逸散,导致循环水系统结垢严重。为减轻结垢,采用CO2或加H2SO4进行酸化处理,减轻结垢。这一阶段,人们对循环水引起的危害性认识不足,水处理技术处于初级阶段。上世纪五十年代至六十年代,随着认识的深化和工业的需求,开发了许多水处理剂,如聚磷酸盐、铬酸盐等水处理配方。其中铬酸盐/聚磷酸盐/锌盐水处理配方(一般称铬系配方)的应用最为成功。上世纪七十年代以来,国外冷却水技术发展迅速,采用了扩大的磷酸盐处理配方、全有机配方和碱性水等,磷系水处理剂被发现并应用于工业循环水中以来,因为其无毒、低价及具有良好的缓蚀与阻垢性能,目前在水处理剂中仍占绝对主导的地位。一方面,它为解决工业循环水系统的腐蚀与结垢问题做出了巨大的积极贡献。可以想象,没有聚合磷和有机磷存在,就不会有工业循环水系统和生产装置安全长周期运行。另一方面,因为磷系水处理剂会带来大量的含磷废水的排放,导致环境污染。
目前,循环水系统大量使用有机磷酸(盐)和聚丙烯酸(盐)等这些高效阻垢剂、分散剂来解决水中致垢盐的结垢问题。但是,磷酸盐一方面是循环水系统中微生物的营养源,有利于微生物生长而形成软垢,另一方面磷酸盐随着循环水系统排污而排放水体中,造成水体富营养化。现在全国每年用于缓蚀阻垢剂生产的磷近10万吨,这些磷几乎未经任何处理就被排到环境中,对环境造成污染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种缓解工业循环冷却水系统结生碳酸盐垢现象的方法。该方法能减少含磷废水排入环境水体。
本发明的技术方案是利用微生物胞外碳酸酐酶去除碳酸钙垢的方法,包括如下步骤:1)制备分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌菌剂;2)冷冻离心,盐析粗提取出含碳酸酐酶的粗酶液;3)将粗酶液加入到生了碳酸盐水垢的水体中。
具体的,步骤1)所述的制备分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌菌剂包括如下操作:取循环水系统冷却水,将其均匀涂布于含有60g/L碳酸钙、1μmol/L ZnSO4的牛肉膏蛋白胨琼脂平板上,将平板置于34~37℃下培养24h,挑出长好的菌落并采用划线法进行纯化;将纯化得到的菌种进行16S rRNA扩增,确定其种属;将确定后的菌种接种到LB液体培养基中进行扩大培养至稳定期,培养温度为29~31℃,摇床转速为120r/min。
具体的,步骤2)的操作具体如下:将1)中培养好的菌液在4℃、5000r/min下离心10min,取上清液,向上清液中加入(NH4)2SO4使溶液饱和度达到70%,置于4℃下盐析12h后,4℃8000r/min离心30min得到蛋白质沉淀,将蛋白质沉淀溶解于25mmol/L pH7.5的Tris-H2SO4缓冲液中,通过G-100葡聚糖凝胶柱,洗脱收集粗酶液;
进一步的,在步骤2)中将粗酶液透析48h后用DE-52离子交换柱分离纯化,洗脱液为100mmol/L、pH7.5的Tris-H2SO4缓冲液,收集酶活性较高的CA溶液,用聚乙二醇20000浓缩备用。
具体的,步骤1)中分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌枯草芽孢杆菌和蜡样芽胞杆菌。
本发明还提供了微生物胞外碳酸酐酶在去除工业循环水中碳酸钙垢的用途。
本发明还提供了所述的方法在去除工业循环水中碳酸钙垢的用途。
本发明的有益效果:
本发明方法从循环冷却水中筛选微生物,提取粗酶再投放到系统中能快速正常运作,不会因为条件变化过大而失去活性。在结生碳酸盐水垢的循环水系统中加入含碳酸酐酶的粗酶液,碳酸酐酶能快速催化二氧化碳与碳酸氢根之间相互转换,加速二氧化碳溶于水合成碳酸氢根的水合反应,同时释放氢离子,使水体pH下降,从而影响CaCO3的电离平衡,使碳酸盐沉淀溶解。无需往循环水系统中投加大量含磷阻垢剂,不会导致大量含磷废水排入环境,造成水体富营养化,利用微生物碳酸酐酶进行阻垢,绿色环保,在阻垢的同时可实现磷减排。
具体实施方式
碳酸酐酶(carbonic anhydrase,简称CA,EC4.2.1.1)广泛分布于动植物和原核生物中,是已知的催化反应速率最快的生物催化剂。不仅所有哺乳动物的组织和细胞类型中都发现了碳酸酐酶,而且植物和单细胞绿藻中含有丰富的碳酸酐酶。它具有一系列重要的生理作用,如控制酸碱平衡、呼吸作用、二氧化碳和离子运输、光合作用、钙化作用等。
近年来有研究发现,碳酸酐酶在岩溶环境中广泛分布,与生态系统中元素迁移之间有着紧密的关系。岩溶地区土壤细菌的碳酸酐酶以胞外酶方式存在,在石灰岩的溶解实验中加入CA,可使溶解速率提高10倍。
碳酸酐酶的活性中心含有一个催化活性所必需的锌原子,催化CO2进行可逆水合反应。其催化机理如下:
由式(1)、(2)可知,CO2的水合反应生成的H+会影响CaCO3的电离平衡,从而使碳酸盐溶解,即有:
因此碳酸酐酶能催化碳酸盐垢的沉积和溶解,在工业循环水系统中加入看缓解系统中结垢的现象。
本发明是先将可分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)培养至稳定期,冷冻离心取上清液并盐析粗提取出含碳酸酐酶的粗酶液,碳酸酐酶能快速催化二氧化碳与碳酸氢根之间相互转换,加速二氧化碳溶于水合成碳酸氢根的水合反应,同时释放氢离子,使水体pH下降,从而影响CaCO3的电离平衡,使碳酸盐沉淀溶解。在循环冷却水系统中加入含一定浓度胞外碳酸酐酶的菌液,可以在一定程度上缓解系统结生碳酸钙水垢的现象。
碳酸酐酶催化二氧化碳水合反应的原理:
动力学研究表明CA遵循一个两步机制:第一步是Zn2+结合的氢氧根离子对CO2的亲核攻击(方程1),此时产生一个碳酸氢根离子,提高了反应速率;第二步是Zn2+结合的水分子的离子化,同时通过活性部位去质子而使活性部位再生(方程2),这一步是整个反应的控制步骤,且依靠细胞质中的缓冲介质来吸收质子。在这个步骤中,Zn2+离子作为路易斯酸使水分子的pKa值从14下降到7.0。
CA分子结构中主要有四个部分直接影响其催化作用,分别为Zn2+结合位点、基质联合区域、苏氨酸-199环、质子转移途径。Zn2+结合位点包含三个组氨酸残基,可以直接结合Zn2+,且每个组氨酸残基上连结的配位基(Gln-92、Asn-244和Glu-117)可以提供氢键以保证Zn2+的平衡。基质联合区域由一些六联非极性氨基酸组成,位于Zn2+结合位点之后,可以隔离CO2并将CO2引导至Zn2+结合的氢氧根离子处;苏氨酸-199环最重要的作用就是给Zn2+-OH-提供氢键来实现催化作用,转移了质子的残基这时候就接受水分子中的质子,再继续将质子提供给细胞质中的缓冲介质。由于其特殊结构及氨基酸构成,CA就可以快速的催化CO2和-之间的相互转化。
循环冷却水里有多种菌,所以用选择培养基养出来的不只有枯草芽孢杆菌,能产碳酸酐酶的细菌都可以在上述特殊选择培养基上生长,划线纯化后得到的是单一菌种。将单一菌种进行16S rRNA测序,可以知道它所属的种属。
从循环冷却水中筛选微生物,提取粗酶再投放到系统中能快速正常运作,不会因为条件变化过大而失去活性。在最初筛选细菌的时候需要测定酶活性,目的是从分离出的细菌中选出产碳酸酐酶量较多且活性较强的几株细菌,在工程使用中无需测活性,保证菌液OD600nm值在0.8以上,然后粗提取出碳酸酐酶即可。
实施例1本发明方法去除碳酸钙水垢
1)菌剂制备:取适量循环水系统冷却水,将其均匀涂布于含有60g/L碳酸钙、1μmol/LZnSO4的牛肉膏蛋白胨琼脂平板上,将平板置于34~37℃下培养24h,挑出长好的菌落并采用划线法进行纯化。
2)扩大培养:将步骤1)中纯化的微生物(枯草芽孢杆菌)接种到LB液体培养基中进行扩大培养至稳定期,培养温度为30±1℃,摇床转速为120r/min。
3)碳酸酐酶粗酶液提取:将2)中培养好的菌液在4℃、5000r/min下离心10min以除去细胞。向上清液中加入适量(NH4)2SO4使溶液饱和度达到70%,置于4℃下盐析12h后,在4℃下8000r/min离心30min得到蛋白质,将蛋白质沉淀溶解于25mmol/L、pH7.5的Tris-H2SO4缓冲液中,通过G-100葡聚糖凝胶柱,洗脱收集粗酶液,粗酶液透析48h后用DE-52离子交换柱分离纯化,洗脱液为100mmol/L、pH7.5的Tris-H2SO4缓冲液,收集酶活性较高的CA溶液,用聚乙二醇20000浓缩备用。
4)测定碳酸酐酶活性:在一个2℃的冷冻反应室中,往含有0.5mL煮沸或未煮沸碳酸酐酶粗酶液中注入4.5mL冰冷的CO2饱和水后,测定溶液pH下降的速度。酶活单位数由公式U=10[(T0/Te)-1]求得,T0为加入煮沸酶液测得的pH变化所需时间,Te为加入未煮沸酶液测得的pH变化所需时间。酶活性以每mg蛋白含有的酶活单位数(U/mg)表示,蛋白测定参照Lowry等的方法。
5)将碳酸酐酶粗酶液添加到结生了碳酸盐水垢的模拟水体中,震荡15min,再静止2h,肉眼可见碳酸盐类硬垢呈片状和粉状脱落。测定pH、水体总硬度、钙离子浓度和电导率,发现总硬度、钙离子浓度和电导率有明显上升,而pH则下降,证明微生物碳酸酐酶确实能增大碳酸盐垢溶解性。
加入碳酸酐酶前,模拟水体的pH8.78,硬度0.45mmol/L、电导率420μm/cm、钙离子浓度0.43mmol/L,加碳酸酐酶粗酶液,震荡15min,再静止2h后,测得pH7.93,硬度1.70mmol/L、电导率4896μm/cm、钙离子浓度1.64mmol/L。
实施例2本发明方法去除碳酸钙水垢
1)菌剂制备:取适量循环水系统冷却水,将其均匀涂布于含有60g/L碳酸钙、1μmol/LZnSO4的牛肉膏蛋白胨琼脂平板上,将平板置于34~37℃下培养24h,挑出长好的菌落并采用划线法进行纯化。
2)扩大培养:将步骤1)中纯化的微生物(枯草芽孢杆菌)接种到LB液体培养基中进行扩大培养至稳定期,培养温度为30±1℃,摇床转速为120r/min。
3)碳酸酐酶粗酶液提取:将2)中培养好的菌液在4℃、5000r/min下离心10min以除去细胞。向上清液中加入适量(NH4)2SO4使溶液饱和度达到70%,置于4℃下盐析12h后,在4℃下8000r/min离心30min得到蛋白质,将蛋白质沉淀溶解于25mmol/L、pH7.5的Tris-H2SO4缓冲液中,通过G-100葡聚糖凝胶柱,洗脱收集粗酶液,粗酶液透析48h后用DE-52离子交换柱分离纯化,洗脱液为100mmol/L、pH7.5的Tris-H2SO4缓冲液,收集酶活性较高的CA溶液,用聚乙二醇20000浓缩备用。
4)测定碳酸酐酶活性:在一个2℃的冷冻反应室中,往含有0.5mL煮沸或未煮沸碳酸酐酶粗酶液中注入4.5mL冰冷的CO2饱和水后,测定溶液pH下降的速度。酶活单位数由公式U=10[(T0/Te)-1]求得,T0为加入煮沸酶液测得的pH变化所需时间,Te为加入未煮沸酶液测得的pH变化所需时间。酶活性以每mg蛋白含有的酶活单位数(U/mg)表示,蛋白测定参照Lowry等的方法。
5)将碳酸酐酶粗酶液在结生了碳酸盐水垢的模拟水体中,并在水体中悬挂碳钢材质的挂片,挂片完全浸入溶液中,向模拟水体中投加酶制剂,5天后发现碳酸盐类硬垢呈片状和粉状脱落,对挂片进行电镜扫描,发现其表面结构并未发生大的改变,证明微生物碳酸酐酶能低腐蚀除垢。
实施例3处理某化工厂循环水系统管道内结生的水垢
处理前系统结垢严重,块状垢紧密贴合在系统内壁,导致管道堵塞,传热效率降低。将分泌胞外碳酸酐酶的微生物扩大培养至OD600nm值0.8以上,将粗提取出的碳酸酐酶投入工厂循环水系统中,正常运行10天后,发现系统内壁的块状垢呈现松散状,并随着循环水流的冲刷脱落到集水池中,管道堵塞现象有所改善,系统换热效率也有所提升。将集水池中沉淀的垢收集起来,发现其呈粉末状,检测结果其主要成分为碳酸钙、碳酸镁等碳酸盐。同时对处理后的循环水进行检测(表1),发现水质达到国家标准,说明经本发明的碳酸酐酶处理后不影响循环水的水质。
表1某化工厂循环水运行指标
Claims (9)
1.利用微生物胞外碳酸酐酶去除碳酸钙垢的方法,其特征在于:包括如下步骤:1)制备分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌菌剂;2)冷冻离心,盐析粗提取出含碳酸酐酶的粗酶液;3)将粗酶液加入到生了碳酸盐水垢的工业循环水中。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1)所述的制备分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌菌剂包括如下操作:取循环水系统冷却水,将其均匀涂布于含有60g/L碳酸钙、1μmol/L ZnSO4的牛肉膏蛋白胨琼脂平板上,将平板置于34~37℃下培养24h,挑出长好的菌落并采用划线法进行纯化;将纯化得到的菌种进行16S rRNA扩增,确定其种属;将确定后的菌种接种到LB液体培养基中进行扩大培养至稳定期,培养温度为29~31℃,摇床转速为120r/min。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤2)的操作具体如下:将1)中培养好的菌液在4℃、5000r/min下离心10min,取上清液,向上清液中加入(NH4)2SO4使溶液饱和度达到70%,置于4℃下盐析12h后,4℃8000r/min离心30min得到蛋白质沉淀,将蛋白质沉淀溶解于25mmol/L pH7.5的Tris-H2SO4缓冲液中,通过G-100葡聚糖凝胶柱,洗脱收集粗酶液。
4.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:在步骤2)中将粗酶液透析48h后用DE-52离子交换柱分离纯化,洗脱液为100mmol/L、pH7.5的Tris-H2SO4缓冲液,收集酶活性较高的CA溶液,用聚乙二醇20000浓缩备用。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于:在步骤2)中将粗酶液透析48h后用DE-52离子交换柱分离纯化,洗脱液为100mmol/L、pH7.5的Tris-H2SO4缓冲液,收集酶活性较高的CA溶液,用聚乙二醇20000浓缩备用。
6.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤1)中分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌为枯草芽孢杆菌和蜡样芽胞杆菌。
7.如权利要求3所述的方法,其特征在于:步骤1)中分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌为枯草芽孢杆菌和蜡样芽胞杆菌。
8.如权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤1)中分泌胞外碳酸酐酶的芽孢杆菌属细菌为枯草芽孢杆菌和蜡样芽胞杆菌。
9.权利要求1~8任一项所述的方法在去除工业循环水中碳酸钙垢的用途。
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