CN104062438B - 一种鉴别浓度对蛋白质分子二级结构影响的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别浓度对蛋白质分子二级结构影响的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)借助Langmuir-Blodgett成膜技术，将待测蛋白质分子溶液滴加于亚相的表面，观察其能否形成Langmuir单分子膜；(2)若能够生成Langmuir单分子膜，自滴加时刻起，采集表面压力π随时间的变化曲线，即实时π-t动力学曲线；若π-t动力学曲线中的π表现为一上升的，并且最终呈一稳定数值的曲线，则该蛋白质的二级结构保持良好；若π-t动力学曲线中的π表现为一下降趋势，则表明蛋白质被溶剂化严重，二级结构被破坏。本发明可用于监测蛋白质分子构象的变化，操作简单。通过实时测定不同浓度下蛋白质分子的结构变化来调控设计新型免疫药物。同时，对于指导生产不同分子构象的乳制品具有重要商用价值。

Description

一种鉴别浓度对蛋白质分子二级结构影响的检测方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别浓度对蛋白质分子二级结构影响的检测方法，具体地说是一种通过采集蛋白质溶液在亚相表面形成Langmuir单分子膜过程的表面压力随时间(π-t)动力学曲线以及通过压缩Langmuir膜，获得表面压对单分子膜面积的(π-A)吸附等温线的方法，用以鉴别蛋白质分子构象变化。
背景技术
作为生命物质的基础，蛋白质具极其重要的地位。蛋白质不同的空间结构也决定了其功能的千差万别。了解蛋白质构象有利于利用他们的生物活性作用发展免疫科学和指导乳制品的生产制造。蛋白质的研究中，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)最为常见，在过去十几年里被广泛研究。其中，J.F.Foster在研究牛血清白蛋白水溶液因PH不同而引起的构象变化时，提出了一个经典模型：N(normal)→F(fast)→E(expanded)。因为在蛋白质构象变化过程中，包括空间位阻，范德华力，氢键，疏水效应，以及多肽和周围溶剂相互作用等多种作用力的相互作用。所以，对于通过捕捉蛋白质构象变化过程中瞬息即变的外貌变化来澄清蛋白质构象变化的机理是十分困难的。虽然许多实验和理论的工作都在加深我们对蛋白质构象转变的认识，但是蛋白质构象变化问题仍然没有得到很好的解决。(1:FosterJ.F.,SamsaE.G.,JournaloftheAmericanChemicalSociety1951,73,3187-3190.2:MasaruS.,JosephF.,Biochemistry1986,7,2172-2182.3:KhanM.Y.,Biochemical1986,236,307-310.4:FershtA.R.,DaggettV.,Cell2002,108,573-582.5:PereiraL.G.C.,TheodolyO.,BlanchH.W.,RadkeC.J.,Langmuir2003,19,2349-2356.6:BarbosaL.R.S.etal.BiophysicalJournal2010,98,147-157.7:BramantiE.,FerrariC.,AngeliV.,OnorM.,SynovecR.E.,Talanta2011,85,2553-2561.)
目前，在探究引起蛋白质构象变化的因素方面，主要有pH，离子强度，表面活性剂或脂肪类物质等方面因素。但是，对于蛋白质最常用的溶剂-水，是否会对蛋白质构象的转变产生影响则很少被研究。直到现在，蛋白质分子浓度变化是否会引起自身构象的变化这一课题鲜有研究。众所周知，不同结构构象的蛋白质在生物体中承担不同的角色，澄清其构象的变化对于研究其生物催化活性具有重要意义，已经有相关文献发表，但通过表面化学的方法，对于设计新型免疫药物、具有高活性的生物催化剂、高质量乳制品及相关的生产加工具有重要的现实意义。(1:ShenY.R.,Ostroverkhov,ChemicalReviews2006,106,1140-1154.2:McClellanS.J.,FransesE.,ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces2003,28,63-75.3:NoskovB.A.,etal.,Langmuir2010,26,17225–17231.3:BhattacharyaM.,JainN.,BhasneK.,KumariV.,MukhopadhyayS.,JournalofFluorescence2011,21,1083-1090.4:NoskovB.A.,MikhailovskayaA.A.,LinS.Y.,LoglioG.,MillerR.,Langmuir2010,26,17225-1723.5:WangJ.,BuckS.M.,ChenZ.,Analyst2003,128,773-778.6:LuJ.R.,SuT.J.,ThomasR.K.,JournalofColloidandInterfaceScience1999,213,426-437.)
发明内容
本发明是在提供一种蛋白质构象变化的检测方法。即借助Langmuir-Blodgett成膜技术，通过实时测定表面压(π)随时间(t)的动力学曲线(π-t),快速得出蛋白质的构象变化情况。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
(1)将待测蛋白质分子溶液借助Langmuir-Blodgett成膜技术制备血清白蛋白的Langmuir单分子膜；
(2)采集蛋白质分子形成Langmuir单分子膜过程的动力学数据；即实时测定Langmuir单分子膜表面压随时间的π-t动力学曲线；若π-t表现为一上升的、并且最终呈一稳定数值的曲线，则该蛋白质的二级结构保持良好；若π-t动力学表现为一下降趋势，这表明蛋白质被溶剂化严重，二级结构被破坏；分子中氢键断裂，取而代之的是与水分子形成分子间氢键，此时，蛋白质分子从原来的心形结构变成展开状，并伴随催化析氢活性的降低。
本发明所述蛋白质分子的Langmuir单分子膜的制备中以去离子水或磷酸盐缓冲液为亚相。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
(1)本发明发现，在外界因素(如温度、压力、pH值、离子强度、表面活性剂的加入等)恒定条件下，蛋白质溶液还会因自身浓度的不同而发生构象的转变；因此本发明采用LB成膜技术，通过采集蛋白质形成Langmuir单分子膜过程的Langmuir单分子膜表面压随时间的π-t动力学参数来鉴别蛋白质分子构象变化。
(2)本发明可用于监测蛋白质分子构象的变化，操作简单。通过实时测定不同浓度下蛋白质分子的结构变化来调控设计新型免疫药物。同时，对于指导生产不同分子构象的乳制品具有重要商用价值。
附图说明
图1是构建蛋白质Langmuir膜的示意图
图2是本发明水为亚相的π-t动力学曲线
图3是本发明水为亚相的π-A等温线
图4是本发明PH＝4.2的磷酸盐缓冲溶液π-t动力学曲线
图5是本发明PH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液π-t动力学曲线
图6是本发明的圆二色谱图(CD)
图7本发明的消弱全反射谱(FTIR)
图8本发明的原子力显微镜图(AFM)
图9本发明的原子力显微镜图(AFM)
图10本发明的电化学催化析氢
具体实施方式
本发明可用于鉴别浓度对蛋白质(牛血清白蛋白，人血清白蛋白，酪蛋白，乳白蛋白，乳球蛋白)分子二级结构的影响，以下实例以牛血清白蛋白为实例进行说明。
实施例1：
配置浓度为8.0ppm，体积为0.1mL的牛血清白蛋白溶液，将其滴加进盛有190mL去离子水的亚相中，测量表面压与时间的π-t动力学曲线，找出稳定成膜时间，由图2可以看到，表面压随时间的增长逐渐上升抬起，并在大于600min时，保持了动态平衡，表明Langmuir膜达到了可逆-平衡状态，说明稳定成膜时间为600min。通过对π-t的一级动力学拟合，获得表面分子对亚相的分配平衡常数Kd，并由热力学公式-△G＝RTlnKd计算出Langmuir膜的表面吉布斯剩余自由能(ΔG)。结果表明分配平衡常数Kd<1,说明蛋白分子仅有部分停留在A/W界面成膜，多数蛋白分子则分散在亚相；ΔG<10KJ/mol,说明BSA分子构象的变化不涉及化学键的形成。通过压缩Langmuir膜，记录表面压力对单分子膜面积的π-A吸附等温曲线，由图3看到有两个相转变点。第一个相变点为气态到液态扩张膜，第二个相变点为液态扩张膜到液态凝聚膜。相变点的最小抬起面积(MLA)定义为表面压恰好从零开始上升时BSA单位分子占有的面积，是一个理论值，该值可以对BSA蛋白分子尺寸结构进行定性描述。图中MLA值为9.0nm2。由图6CD谱显示，在208nm，221nm有两负峰，在193nm有一正峰，证明含有α-helix结构，而且其含量为31.5％。该CD同时可以得到β-sheet含量为23.5％，β-turn含量为4.3％，Randomcoil含量为28.9％。在该图中同时可以看到0.8ppm牛血清白蛋白溶液，在193nm没有出现峰，说明BSA在此低浓度下的基本为无序结构。0.8ppm下α-helix含量13.4％。β-sheet含量为25.0％，β-turn含量为20.1％，Randomcoil含量为41.5％，说明浓度降低α-helix含量逐渐降低，β-sheet，β-turn，Randomcoil含量相继增高，说明随浓度的降低，BSA分子构象确实发生了变化。CD谱的红移同时说明牛血清白蛋白内部分子键与水分子发生溶解或自组装，导致低浓度下牛血清白蛋白的无序结构。图7，FTIR谱图显示牛血清白蛋白的红外谱图分别在1658cm-1和1550cm-1出现表示酰胺I、酰胺II的峰。与该图中0.8ppm的BSA，在1640cm-1有一个水的强吸收峰，酰胺Ⅰ的峰比8.0ppm的峰更宽且出现红移现象，酰胺Ⅱ峰的消失证明了蛋白质构象的转变图8为AFM，图中显示了该浓度下BSA分子呈现出粗糙不平的表面结构，与图9浓度为0.8ppm的BSA分子相比较而言表面十分凹凸不平，说明随浓度的降低，BSA分子逐渐发生了构象的变化，表现出的形貌也趋于平坦。图10显示，催化析氢峰电位为-1.76V。较其他低浓度的BSA催化析氢峰电位值而言要偏正，说明高浓度下的BSA分子结构更有利于催化析氢反应的进行。
实施例2：
配置浓度为2.0ppm，体积为0.4mL牛血清白蛋白溶液，将其滴加进盛有190mL去离子水的亚相中，测量表面压与时间的π-t动力学曲线，找出稳定成膜时间，由图2可以看到，该实施例与实施例1规律一样，均表现出上升抬起，并最终成动态稳定。具体表现为，表面压随时间的增长逐渐上升抬起，并在大于600min时，保持了动态平衡，表明Langmuir膜达到了可逆-平衡状态，说明稳定成膜时间为600min。通过对π-t的一级动力学拟合,结合热力学公式-△G＝RTlnKd计算出Langmuir膜的表面吉布斯剩余自由能ΔG<10KJ/mol，说明BSA分子构象的变化不涉及化学键的形成。通过压缩Langmuir膜，记录表面压力对单分子膜面积的π-A吸附等温曲线，由图3看到有两个相转变点。第一个相变点为气态到液态扩张膜，第二个相变点为液态扩张膜到液态凝聚膜。相变点的最小抬起面积MLA值为为6.2nm2，较实施例1而言要小，说明随浓度降低，分子结构逐渐由心形结构逐渐呈铺展结构。
实施例3：
配置浓度为1.0ppm，体积为0.8mL的牛血清白蛋白溶液，将其滴加进盛有190mL去离子水的亚相中，测量表面压与时间的π-t动力学曲线，由图2可以看到，该实施例与实施例1，2规律不同，该浓度下BSAπ-t动力学曲线表现为水平，甚至有下降趋势，这一现象说明，该实施例中的BSA分子构与实施里1，2不同。通过对π-t的一级动力学拟合,结合热力学公式-△G＝RTlnKd计算出Langmuir膜的表面吉布斯剩余自由能ΔG<10KJ/mol，说明BSA分子构象的变化不涉及化学键的形成。通过压缩Langmuir膜，记录表面压力对单分子膜面积的π-A吸附等温曲线，由图3看到有两个相转变点。第一个相变点为气态到液态扩张膜，第二个相变点为液态扩张膜到液态凝聚膜。相变点的最小抬起面MLA值为5.8nm2，均小于8.0ppm*0.1mL和2.0ppm*0.4mLBSA的MLA。同样证实了随浓度降低BSA分子构象会逐渐铺展。图9AFM显示该浓度下BSA分子形貌较图8浓度为8.0ppm的BSA而言更为平坦，说明，随浓度降低BSA分子构象由心形逐渐转变为铺展的线状。图9显示，催化析氢峰电位为-1.79V。较实施例1BSA的催化析氢峰电位值而言要偏负，说明低浓度下的BSA分子结构更不利于催化析氢反应的进行。
实施例4：
配置浓度为2.0ppm，体积为0.1mL的牛血清白蛋白溶液，将其滴加进盛有190mL磷酸盐缓冲溶液(图4为PH＝4.2,图5为PH＝7.2)的亚相中，测量表面压与时间的π-t动力学曲线，图4显示在该磷酸盐缓冲PH＝4.2下BSAπ-t动力学曲线表现规律为上升抬起最终呈动态稳定。图5显示在该磷酸盐缓冲PH＝7.2下BSAπ-t动力学曲线表现规律为上升抬起最终呈动态稳定。由于BSA等电点两侧显示相反电性，我们将显示不同电性BSA测试π-t动力学曲线，依然得到了与亚相为水相的高浓度BSA(8.0ppm*1.0mL)的π-t动力学曲线的相同规律。说明BSA分子构象变化不是正负电的静电吸引造成。而是由于水的作用产生的较弱的分子间氢键所造成。
实施例5：
配置浓度为0.2ppm，体积为1.0mL的牛血清白蛋白溶液，将其滴加进盛有190mL磷酸盐缓冲溶液(图4为PH＝4.2,图5为PH＝7.2)的亚相中，测量表面压与时间的π-t动力学曲线，图4显示在该磷酸盐缓冲PH＝4.2下BSAπ-t动力学曲线表现规律为几乎没有上升抬起趋势，而是几乎一直处于水平状态。图5显示在该磷酸盐缓冲PH＝7.2下BSAπ-t动力学曲线表现规律为几乎没有上升抬起趋势，而是几乎一直处于水平状态。由于BSA等电点两侧显示相反电性，我们将显示不同电性BSA测试π-t动力学曲线，依然得到了与亚相为水相的低浓度BSA(1.0ppm*0.8mL)的π-t动力学曲线的相同规律。说明BSA分子构象变化不是正负电的静电吸引造成。而是由于水的作用产生的较弱的分子间氢键所造成。

Claims (1)

1.一种鉴别蛋白溶液浓度对蛋白质分子二级结构影响的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)借助Langmuir-Blodgett成膜技术，将待测蛋白质分子溶液滴加于亚相的表面，观察其能否形成Langmuir单分子膜；所述亚相为去离子水或磷酸盐缓冲液；
(2)若能够生成Langmuir单分子膜，自滴加时刻起，采集表面压力π随时间的变化曲线，即实时π-t动力学曲线；
若π-t动力学曲线中的π表现为一上升的，并且最终呈一稳定数值的曲线，则该蛋白质的二级结构保持良好；
若π-t动力学曲线中的π表现为一下降趋势，则表明蛋白质被溶剂化严重，二级结构被破坏；
所述蛋白质为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白中的任意一种。
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