CN104055785A - 人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物的应用。提高皮肤表皮祖细胞活性和成纤维细胞活性，促进细胞增殖，促进胶原纤维蛋白分泌，减少基质金属蛋白酶表达，对于皮肤创伤愈合和损伤组织修复具有十分重要的作用。寻找一种能提高皮肤表皮祖细胞和成纤维细胞活性，促进胶原纤维蛋白分泌，减少基质金属蛋白酶表达的物质，能有效加快皮肤创伤愈合和损伤组织修复。首先培养皮肤角质祖细胞(KPCs)和人皮肤成纤维细胞(HDFs)，然后试用不同剂量人参皂苷Rd，利用MTT、流式细胞术、RT-PCR和Western blot等实验方法，证实人参皂苷Rd处理后KPCs和HDFs细胞活性增强，I-型胶原纤维蛋白分泌增加，MMP1表达减少；有促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复的功能。利用人参皂苷Rd开发为一种促进皮肤创伤愈合和组织修复的新药。

Description

人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物的应用。

背景技术

加快皮肤创伤愈合和损伤组织修复是一个古老的医学课题，其中，加快皮肤创伤愈合是外科学研究中的热点。创伤愈合和组织修复是各种修复细胞增殖、分化、迁移、凋亡的过程，也是多种细胞因子相互作用的过程。研制促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复的药物，对提高组织自我修复能力，缩短创伤愈合时间，增强机体活力有重要意义。

在创伤愈合组织修复过程中，(1)免疫细胞炎症反应是创伤愈合和组织修复的基础。虽然炎症反应不直接参与创伤愈合和组织修补，但是，它能通过调节多种细胞因子分泌，增强免疫细胞活性和功能，产生氧自由基和释放溶酶体，清除坏死组织和异物，防止感染发生，为创伤愈合修复细胞的活动创造条件。(2)成纤维细胞和细胞外基质对创伤愈合和组织修复起主要作用。成纤维细胞是构成肉芽组织的主要细胞成分之一，能合成和分泌胶原、纤维连接蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和透明质酸等多种细胞外基质。细胞外基质对细胞的形态、细胞的生长和分化有重要调节功能。(3)内皮细胞和新血管为创伤愈合和组织修复提供保障。内皮细胞是形成毛细血管的主要细胞，为创伤组织提供足够的氧和营养物质，保证创伤愈合。内皮细胞还能分泌多种细胞因子，参与创伤组织的修复与调控。(4)角质细胞活化和上皮再生对创伤愈合和组织修复有重要作用。创伤愈合是由上皮组织中角质形成细胞的迁移来完成，使暴露的创伤重新被上皮覆盖，角质形成细胞能通过分泌细胞因子，直接或间接参与创伤修复与调控。

总之，(1)(3)为创伤愈合和损伤组织修复提供基础条件，(2)(4)是创伤愈合和损伤组织修复主体成分，增强皮肤成纤维细胞和皮肤角质祖细胞活性是加速皮肤创伤愈合和损伤组织修复的关键。筛选能促进皮肤成纤维细胞和皮肤角质祖细胞增殖，加快胶原蛋白分泌的活性成分，对研制促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物十分重要。

文献报道，人参提取物能提高人皮肤成纤维细胞(HDF)活性，并具有明显的抗氧化作用。人参皂苷Rg1衍生物人参皂苷F1能抵抗紫外线诱导的人皮肤角质细胞凋亡。人参皂苷Rb1能促进皮肤烧伤创面愈合过程中的血管生成。大量实验证据表明，人参中具有预防皮肤损伤，促进皮肤再生的活性成分。

我们在人参中寻找到一种增强皮肤成纤维细胞活性，促进胶原蛋白产生，减少胶原蛋白降解，加快皮肤角质祖细胞分裂，从而促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复的活性成分。

发明内容

本发明的目的是提供一种人参皂苷Rd,在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物中应用。

实验结果显示，增强皮肤成纤维细胞活性，促进胶原蛋白分泌和加快皮肤角质祖细胞分裂对促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复具有十分重要的作用。人参皂苷Rd能显著促进HDFs细胞增殖、迁移、Ⅰ-型胶原蛋白表达和分泌；促进KPCs活性增强、细胞分裂加快。

首先在实验室培养HDFs和KPCs，试用三种不同浓度的人参皂苷Rd细胞培养液处理HDFs和KPCs，应用MTT和ELISA等实验方法，观察到细胞活性均能显著增强，增殖加快。应用RT-PCR和Western blot等实验方法，观察到Ⅰ-型胶原蛋白表达分泌增加，MMP1表达分泌减少。

有益效果:提高机体自我修复能力，加快皮肤创伤愈合，缩短创伤愈合时间，恢复机体功能。在战地急救、意外伤害救护和外科手术中有重要意义。人参皂苷Rd能提高HDFs和KPCs活性。增加Ⅰ-型胶原蛋白分泌，抑制MMP1表达。具有提高皮肤创伤愈合和损伤组织修复的能力，能在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复的药物中应用。

附图说明

图1为经Rd处理后，MTT检测KPCs细胞活性。

图2为经Rd处理后，MTT检测HDFs细胞活性。

图3为经Rd处理后，RT-PCR检测HDFs细胞Ⅰ-型胶原mRNA表达水平。

图4为经Rd处理后，Western blot检测HDFs细胞Ⅰ-型胶原蛋白水平。

图5为经Rd处理后，RT-PCR检测HDFs细胞MMP1mRNA表达水平。

图6为经Rd处理后，Western blot检测HDFs细胞MMP1蛋白水平。

具体实施方式

1.KPCs和HDFs细胞培养

分别用6孔培养板在角质细胞生长培养基(KGM2)和10％胎牛血清DMEM培养基中接种KPCs(4×10⁴)和HDFs(3×10⁴)两种细胞。之后更换无血清培养基，过夜。再用不同浓度人参皂苷Rd分组处理。在KGM2或DMEM完全培养基中37℃、5％CO₂恒温培养箱培养24小时。

2.MTT实验

经不同浓度人参皂苷Rd分组处理后的KPCs和HDFs，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)，所加入MTT溶液约为培养基体积的5％。37℃、5％CO₂恒温培养箱培养2小时。离心后弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)，摇床低速振荡，酶联免疫检测仪595nm测量各组吸光值。

3.RT-PCR检测

经不同浓度人参皂苷Rd分组处理HDFs24小时后,使用Trizol提取细胞中总RNA，通过测量260nm和280nm处OD值，检测所提取RNA量以及纯度。根据Takara公司提供的RT-PCR试剂盒说明进行反转录和扩增实验，引物序列如下：I-型胶原上游引物为5′-TAGGGTCTAGACATGTTCAGCTTTGT-3′,下游引物为5′-GTGAGGGGTGGGATGTCTTCGT-3′；MMP1上游引物为5′-AGATGTGGAGTGCCTGATGT-3′,下游引物为5′-CTAGGGTACATCAAAGCC-3′；GAPDH上游引物为5′-CGATATCCCTCCAAAATCAA-3′,下游引物为5′-TGTGGTCATGAGTCCTCCCA-3′。选用退火温度分别为95℃、54℃和72℃。使用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物量。检测I型胶原和MMP-1各组灰度值。

4.Western blotting检测

HDFs细胞接种于6孔培养板，细胞密度2×10⁵，过夜。无血清培养24小时。用不同浓度的人参皂甙Rd处理24小时，检测I型胶原和MMP-1。用细胞被裂解缓冲液Ⅰ处理后4℃离心13000rpm15min。收集上清。巴德福特法酶标仪测定样品中的总蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭，MMP1(1:1000)，抗胶原(1:1000)处理。膜漂洗后二抗孵育，用TBST缓冲液水平摇床漂洗，暗室PVDF膜X光曝光及显影。

5.结果分析

(1)人参皂苷Rd促进KPCs和HDFs细胞增殖

用三组不同浓度人参皂苷Rd培养皮肤角质祖细胞(KPCs)和人皮肤成纤维细胞(HDFs)24小时，均能不同程度提高两种细胞活性，并有浓度依赖性，人参皂苷Rd高浓度组促进KPCs和HDFs活性增强程度更加明显(图1、图2)。人参皂苷Rd促进KPCs和HDFs细胞增殖对损伤组织修复和皮肤创伤愈合有重要作用。

(2)人参皂苷Rd促进HDFs细胞Ⅰ-型胶原mRNA表达和蛋白产生

人生皂苷Rd除促进HDFS增殖和迁移增外，还提高Ⅰ-型胶原mRNA的表达水平和蛋白水平(图3、图4)。胶原蛋白是主要细胞间质，在皮肤创伤愈合与损伤组织修复过程中，发挥重要功能。由于纤维细胞会随着结缔组织间质移动，由胶原蛋白纤维形成的立体结构可以协助纤维细胞聚集，能加快损伤组织的修复。

(3)人参皂苷Rd抑制HDFs细胞MMP1mRNA表达和蛋白产生

人参皂苷Rd能降低MMP1mRNA表达水平。Western blot分析显示，也显著降低了MMP1蛋白水平(图5、图6)。在伤口愈合初期，MMP1对清除坏死组织，预防组织感染有重要作用。在组织修复期间，抑制MMP1表达，能防止结缔组织过度分解，对加快皮肤创伤愈合和损伤组织修复。

综上可以看出，人参皂苷Rd通过增加皮肤角质细胞和人皮肤成纤维细胞活性，促进其增殖；提高对HDFs细胞Ⅰ-型胶原mRNA的表达水平和蛋白水平；抑制MMP1表达，能加快皮肤创伤愈合和损伤组织的修复。

Claims (1)

1.人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物中的应用，其特征是人参皂苷Rd可提高皮肤角质祖细胞和人皮肤成纤维细胞活性，促进增殖，增加I-型胶原纤维蛋白分泌，抑制MMP1表达，从而促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复。