CN104031840A - 一株普通小球藻 - Google Patents

Abstract

一株普通小球藻，它涉及一株普通小球藻。本发明的藻株为Chlorella vulgaris JSC-6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2014167。该藻株生长迅速，并能够在氮源缺乏的条件刺激下大量累积藻体内的碳水化合物，藻体水解后获得的糖类可以作为发酵原料，是一种环境友好型生物质原料。该藻株可以利用温室气体CO₂作为原料，在混营培养条件下，经过10天的培养，碳水化合物含量占细胞干重的53.8％，其具有培养周期短，碳水化合物含量高等优点，适合应用在工业生产过程中。

Description

一株普通小球藻

技术领域

本发明与生物能源领域相关，具体涉及一株普通小球藻。

背景技术

能源是关系到全球发展的限制性因素，全球80％以上的能源需求来自于化石燃料。而温室气体CO₂大量排放至大气所引发的全球变暖问题越来越受到广泛的关注。国际能源署在2009年的年度报告中提到，2020年之前，国际化石燃料的消耗将达到峰值。

藻类是地球上最早进行光合作用的生物体，能够利用CO₂和光能，并在多种水体中生长，甚至可以利用废水和废气进行培养。目前，由于世界能源不断消耗以地球上化石能源的有限性，从战略上考虑，藻类成为极具优势的新型能源。

近几年来，有研究人员提出了“Photonol”的概念。“Photonol”是指直接将太阳能转化成发酵终端产物，而藻类的单细胞结构使其易于将太阳能转化为化学能，因此藻类自然就成为缓解全球变暖并合理利用太阳能的理想的选择之一，也因此藻类作为第三代发酵生产原料开始应用于研究领域。首先，藻类在自然界中广泛存在，既可以生长在江河湖泊中，也可以在盐碱、滩涂等不适合农作物生长的地方生长，还可以生长在受污染的水体中甚至可以利用氮磷含量较高的废水进行生长，因此，藻类原料既可以用来解决水体污染问题又不会与粮食作物竞争陆地资源。其次，多数藻类同植物一样，利用CO₂通过光合作用进行生长，可以在缓解温室气体所造成的环境问题的同时利用太阳能。藻类光合效率高，光能转化率理论上可达10％以上。第三，藻类生长周期短于陆生植物，回收周期短，为原料的稳定供应提供保障。第四，藻类为单细胞结构，纤维素含量低于秸秆，而通过一些培养策略可以使葡萄糖大量累积。因此，相比于秸秆，藻类原料的预处理经济简单，糖回收率高。

富含碳水化合物的藻体是优质的发酵原料，然而对于能够累积碳水化合物的藻种却未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株普通小球藻。

本发明的一株普通小球藻，它为普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2014年4月28日，保藏号为CCTCC NO：M2014167。

本发明的普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6分离于台湾南部淡水水域，分类属于绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，小球藻科，小球藻属，普通小球藻，其特征为单细胞，常单生，球形，直径2～10μm，无鞭毛，无性繁殖，可耐20～30℃和强光照。在培养过程中，培养液体颜色为均匀的绿色。该小球藻培养周期短，碳水化合物含量高，适合应用在工业生产过程中作为快速稳定的发酵原料。

本发明的普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6分离于台湾南部淡水水域，其分离方法如下：取台湾南部淡水水域水样进行镜检，发现含有藻类后开始分离；取100mL水样，加入100mL BG-11培养基混匀，在25℃，100μmol/m²/s光照强度下培养，培养过程中通入0.2vvm含有2.5％的CO₂的空气。当培养液体颜色变绿后，用接种环沾取培养液体在BG-11固体培养基上划线培养，培养条件为温度25℃，光照强度100μmol/m²/s，培养20天左右，挑取单菌落在BG-11固体培养基上划线培养；反复划线转接，直至获得纯藻种。

本发明的中促进普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6藻体成分中碳水化合物累积的培养方法，是按以下步骤进行的：

一、前培养：用接种环在固体培养基上刮取少量普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6，置于前培养基中在25～28℃，100μmol/m²/s光照强度下培养5～7天，得前培养的藻液；

二、将前培养的藻液离心后，在无菌操作台中弃去上清液，用培养基回溶，震荡混匀后植入培养基中，按接种量为0.6g/L的条件接种，批次培养；培养过程中连续通入含有质量百分含量为2.5％的CO₂的气体，CO₂通入量为0.2vvm，温度控制在25～28℃，光照强度为150μmol/m²/s，光暗比为24h：0h，待小球藻消耗尽培养环境内的氮源后，继续培养时间7～10天；

其中，前培养基配制如下：取BG-11培养基，加入浓度为0.3g/L的乙酸溶液，调pH至7.5；

培养基配制如下：取Basal Medium，加入浓度为0.3g/L的乙酸溶液，浓度为丁酸溶液，调pH至7.5；

本发明的普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6藻体中碳水化合物含量的检测方法是按照以下步骤进行的：

(1)藻体中碳水化合物的提取方法：取冻干后保存于-80℃的普通小球藻(Chlorellavulgaris)JSC-6藻粉，称取0.1g于试管中，记录所称量藻粉重量，同时分别称取0.1g葡萄糖、木糖和阿拉伯糖用于校正；向称取后的试管中加入3mL72％(w/w)硫酸溶液，置于30℃水浴中不断搅拌60min，使藻粉完全溶于72％(w/w)硫酸溶液中；水浴后，加入84mL蒸馏水，使体系中的硫酸浓度为4％(w/w)，在121℃下高温高压消解20min；

(2)藻水解液中碳水化合物的检测方法：将得到的水解液用CaCO₃溶液调pH至中性，以0.45μm滤膜过滤两次，使用高效液相色谱检测藻水解液中的葡萄糖，木糖和阿拉伯糖的含量；色谱柱使用0.008N H₂SO₄作为流动相，流速为0.4mL/min，柱温70℃；

(3)藻体中碳水化合物含量的计算：

$f_G=\frac{C_G}{\frac{{\mathrm{\χ}}_G}{87}\×1000}$

f_G：葡萄糖校正因子；

C_G：HPLC测定的葡萄糖浓度，g/L；

χ^G：葡萄糖称重，g；

$f_X=\frac{C_X}{\frac{{\mathrm{\χ}}_X}{87}\×1000}$

f_X：木糖校正因子；

C_X：HPLC测定的木糖浓度，g/L；

χ^X：木糖称重，g；

$f_A=\frac{C_A}{\frac{{\mathrm{\χ}}_A}{87}\×1000}$

f_A：阿拉伯糖校正因子；

C_A：HPLC测定的阿拉伯糖浓度，g/L；

χ^A：阿拉伯糖称重，g；

${\mathrm{wt}}_G\%=\frac{C_G}{\frac{\mathrm{\χ}}{87}\×1000}$

wt_G％：葡萄糖占细胞干重的百分比，％；

C_G：HPLC测定的葡萄糖浓度，g/L；

χ：藻粉称重，g；

${\mathrm{wt}}_X\%=\frac{C_X}{\frac{\mathrm{\χ}}{87}\×1000}$

wt_X％：木糖占细胞干重的百分比，％；

C_X：HPLC测定的木糖浓度，g/L；

χ：藻粉称重，g；

${\mathrm{wt}}_A\%=\frac{C_A}{\frac{\mathrm{\χ}}{87}\×1000}$

wt_A％：阿拉伯糖占细胞干重的百分比，％；

C_A：HPLC测定的阿拉伯糖浓度，g/L；

χ：藻粉称重，g；

wt％＝wt_G％+wt_X％+wt_A％

wt％：碳水化合物含量占细胞干重的百分比，％。

本发明具有以下有益效果：

本发明的普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6在氮元素缺乏前，藻体中碳水化合物含量占细胞干重的20.1％；缺氮后，藻体中的碳水化合物含量迅速增加，在第10天时，藻体中碳水化合物含量占细胞干重的53.8％。

附图说明

图1本发明普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6显微照片；

图2培养过程中藻体中碳水化合物含量；其中，为氮源含量曲线；为pH变化曲线；为乙酸含量变化曲线；为丁酸含量变化曲线；A为阿拉伯糖含量；B为木糖含量；C为葡萄糖含量；D为氮源含量变化曲线。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一株普通小球藻，它为普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2014年4月28日，保藏号为CCTCC M2014167。

本实施方式的普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6在氮元素缺乏前，藻体中碳水化合物含量占细胞干重的20.1％；缺氮后，藻体中的碳水化合物含量迅速增加，在第10天时，藻体中碳水化合物含量占细胞干重的53.8％。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实例一：混营培养条件下小球藻藻体中碳水化合物累积

A、前培养：配制BG-11培养基，加入浓度为0.3g/L的乙酸溶液，调pH至7.5，从预先划线培养的平皿上刮取适量藻体接入培养基中，磁力搅拌，通入CO₂培养数天，每天监测藻体细胞浓度，直至达到所需细胞浓度。

表1BG-11培养基配方

表2为表1中的微量元素配方

B、培养：配制Basal Medium，加入浓度为0.3g/L乙酸溶液，浓度为0.8g/L丁酸溶液，调pH至7.5；根据前培养细胞浓度计算所需前培养后的藻液体积，将前培养后的藻液置于灭菌的离心管中，6000r/min条件下离心3min；在无菌操作台内弃去上清液，并用配制好的培养基回溶藻体，并转入培养基中培养；

C、培养条件：接种量为0.6g/L，批次培养，培养体积1L，培养过程中连续通入含有2.5％CO₂的气体，CO₂通入量为0.2vvm，温度控制在25～28℃，光照强度150μmol/m²/s，培养时间10天，缺氮时间7天。在培养过程中每天取样，监测藻的生长状况以及氮源利用情况；缺氮后每天取样品，离心后弃去上清液，在-50℃条件下冻干48h，冻干后的样品保存于-80℃等待测量。

表3小球藻Chlorella vulgaris JSC-6在培养过程中的生长状况

根据实例一可以看出，在混营培养条件下，该小球藻生长迅速，仅需三天，即可达到确缺氮培养的状态，大大缩短了累积碳水化合物所需的时间。

实例二：藻体中碳水化合物含量的测定

(1)藻体中碳水化合物的提取方法：取保存于-80℃的藻粉，称取0.1g左右于试管中，记录所称量藻粉重量，同时分别称取0.1g左右葡萄糖，木糖，阿拉伯糖用于校正。向称取后的试管中加入3mL72％(w/w)硫酸，30℃水浴中不断搅拌60min，使藻粉完全均匀溶于72％硫酸中；水浴后，加入84mL蒸馏水，使体系中的硫酸浓度为4％(w/w)，在121℃下高温高压消解20min；

(2)藻水解液中碳水化合物的检测方法：将得到的水解液用CaCO₃调pH至中性，以0.45μm滤膜过滤两次，使用高效液相色谱检测藻水解液中的葡萄糖，木糖和阿拉伯糖的含量；色谱柱使用0.008N H₂SO₄作为流动相，流速为0.4mL/min，柱温70℃；

(3)藻体中碳水化合物含量的计算：

$f_G=\frac{C_G}{\frac{{\mathrm{\χ}}_G}{87}\×1000}$

f_G：葡萄糖校正因子；

C_G：HPLC测定的葡萄糖浓度，g/L；

χ^G：葡萄糖称重，g；

$f_X=\frac{C_X}{\frac{{\mathrm{\χ}}_X}{87}\×1000}$

f_X：木糖校正因子；

C_X：HPLC测定的木糖浓度，g/L；

χ^X：木糖称重，g；

$f_A=\frac{C_A}{\frac{{\mathrm{\χ}}_A}{87}\×1000}$

f_A：阿拉伯糖校正因子；

C_A：HPLC测定的阿拉伯糖浓度，g/L；

χ^A：阿拉伯糖称重，g；

${\mathrm{wt}}_G\%=\frac{C_G}{\frac{\mathrm{\χ}}{87}\×1000}$

wt_G％：葡萄糖占细胞干重的百分比，％；

C_G：HPLC测定的葡萄糖浓度，g/L；

χ：藻粉称重，g；

${\mathrm{wt}}_X\%=\frac{C_X}{\frac{\mathrm{\χ}}{87}\×1000}$

wt_X％：木糖占细胞干重的百分比，％；

C_X：HPLC测定的木糖浓度，g/L；

χ：藻粉称重，g；

${\mathrm{wt}}_A\%=\frac{C_A}{\frac{\mathrm{\χ}}{87}\×1000}$

wt_A％：阿拉伯糖占细胞干重的百分比，％；

C_A：HPLC测定的阿拉伯糖浓度，g/L；

χ：藻粉称重，g；

wt％＝wt_G％+wt_X％+wt_A％

wt％：碳水化合物含量占细胞干重的百分比，％。

表4培养过程中普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6细胞内碳水化合物含量

实例二说明该种小球藻能够在缺氮后快速累积体内的碳水化合物，碳水化合物含量高达53.8％，且水解后83％以上为葡萄糖，木糖和阿拉伯糖含量低。相比于木糖含量相对较高的秸秆类发酵原料，该种小球藻更易于破胞水解且葡萄糖收率大，是更为优质的发酵原料。

Claims (1)

1.一株普通小球藻，其特征在于它为普通小球藻(Chlorella vulgaris)JSC-6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2014年4月28日，保藏号为CCTCC NO：M2014167。