CN104027823B - 一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法，通过一锅法制备多肽修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体过程中，磁性纳米粒子聚集体尺寸可调；磁性纳米粒子聚集体表面可一步修饰生物活性基团；制备方法操作简单，效率高，成本低，使用安全。解决了常规制备过程中修饰方法复杂，胶体稳定性较差等问题。
Description
技术领域
本发明公开一种一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法，属于造影剂的制备方法技术领域。
背景技术：
目前USPIO造影剂的制备方法主要为水相化学沉淀法和有机热分解法。水相化学沉淀法该方法简便易行，但对粒子尺寸和尺寸分散性的调控较差，因此其获得的粒子多具有较大的分散度。而有机热解法制备的USPIO粒子尽管尺寸分布均匀，可以较好的解决20nm以下USPIO粒子的制备问题，但其规模化制备目前还存在一些问题，如修饰方法复杂，胶体稳定性较差等。同时目前USPIO的包覆和表面修饰多利用葡聚糖等多糖类大分子来提高其胶体稳定性，保障其在体内正常循环代谢，但其和氧化铁粒子表面作用力较弱，包覆稳定性较差，而且表面不具有特异性的基团，能通过被动的被网状内皮细胞或淋巴细胞吞噬而进入组织，缺乏特异性。
从目前的研究趋势看，开发适于规模化生产、能够较好的调控USPIO粒子尺寸、尺寸分散性和表面性质的制备方法对基于USPIO的MRI造影剂的研发和应用具有重要意义。同时，鉴于新型造影剂的开发更强调主动性、特异性造影功能，因此，本发明通过改进的水相化学沉淀法，可以“一锅”实现尺寸可控的USPIO合成及生物小分子的特异性修饰。
发明内容：
本发明公开一种一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法，解决了常规制备过程中修饰方法复杂，胶体稳定性较差等问题。
本发明提供一种一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法，具体步骤包括：
1）在55℃~65℃下，将不同分子量的多肽分子和Fe（II）和Fe（III）铁盐混合溶于水中，形成络合物溶液；其中，
多肽分子与Fe（II）和Fe（III）铁盐总和的摩尔比为（5~10）：1；
Fe（II）和Fe（III）铁盐的摩尔比为1：2；
2）在60oC下向步骤1）得到的络合物溶液中加入浓氨水，氨水与铁盐的摩尔比为5：1；
3）将步骤2）混合溶液在80oC、1000转/分条件下机械搅拌下反应30分钟，得多肽修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体；
4）将步骤3）所得产物溶于保存在20毫升0.05摩尔pH值为7.3的HEPES缓冲溶液中。
所述的多肽分子选自与Fe离子具有较好络合能力且具有一定生物活性的聚氨基酸分子，包含聚赖氨酸（分子量70000～1500000KD）、聚天冬氨酸（分子量4000～9000KD）、聚谷氨酸（分子量20000～50000KD）等；
所述的Fe（II）铁盐，指的是水溶性亚铁盐，如氯化亚铁、硫酸亚铁、硝酸亚铁、草酸亚铁等；
所述的Fe（III）铁盐，指的是水溶性铁盐，如、硫酸铁、硝酸铁、草酸铁等。
所述的超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体的尺寸可通过改变多肽分子的分子量以及多肽分子和铁盐比例来调控；聚集体尺寸随多肽分子量增大而增大，在6nm～200nm间调控。
本发明多肽修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的效果证明：
通过透射电镜、激光粒度仪等测试了所合成的纳米粒子的大小及胶体稳定性，并以日本大耳兔及Balb/c小鼠为动物模型，测试了所得造影剂的生物相容性，生物毒性及其造影能力。
透射电镜(TEM)观察结果表明，多肽修饰前后USPIO纳米粒子的尺寸和形貌无明显变化，统计结果表明，激光粒度仪测量大部分粒子尺寸范围为6～14nm。共沉淀方法制备的USPIO胶体稳定性较差，在溶液中易于聚集而发生沉淀。多肽修饰后的USPIO胶体聚集沉淀速度明显减慢，因此胶体稳定性得到了提高。电位测量结果(图2)表明，随着多肽修饰量的增加，USPIO表面负电荷增加，在多肽浓度为0.020mol／L时达到最低点，进一步增加多肽的浓度，其表面负电荷又略有减少。不同pH下电位测量结果表明，USPIO的等电点为7；而用0.020mol／L的多肽修饰后，USPIO等电点降低到2，与多肽侧链羧基的pKa(2.27)相近，表明此时多肽在USPIO表面形成了比较致密的修饰层。多肽修饰后，USPIO表面负电荷增加，等电点从pH中性区移至酸性区，有利于改善USPIO在生理条件下的胶体稳定性。
核磁检测及图像数据处理和分析
扫描参数：重复时间(TR)=800ms，回波时间(TE)=45ms，激励次数(NEx)=1，采集7幅基准图像(pHase)后，注射对比剂．PWI原始图像转到AW4.2工作站进行数据处理，计算公式为
SRRmax(％)=[(S10一SIpeak)／S10]×100％；△R2 *=-In(SIt／SI0)／TE
式中，SRRmax为最大信号下降的百分比，S10为灌注前的信号强度，SIpeak为灌注成像中兴趣区信号的最小值．△R2 *表示T2*弛豫率的变化(即1／T2*的变化率)，SIt表示对比剂首次通过期间任一时间点的兴趣区信号强度，TE为PWI时的回波时间。
选用日本大耳兔为模型实验动物，将不同浓度多肽修饰的USPIO注射入兔体内，并在相同条件下进行脑部核磁成像。当多肽浓度较低(0.004mol／L)时，脑灰质和脑白质核磁信号的SRRmax值和T2*弛豫率变化(△R2 *)均为零，未观察到增强效果．当多肽浓度增加到0.010mol／L时，脑灰质和脑白质的SRRmax值分别为70.00和45.00，表现了一定的增强效果。当多肽浓度为0.020mol／L时，脑灰质和脑白质的SRRmax进一步增加到83.00和76.00。当多肽浓度达到0.030mol／L时，脑灰质和脑白质的SRRmax下降到33.0和50.00。脑灰质和脑白质的核磁信号弛豫率变化(△R2 *)也表现出同样的规律，在修饰浓度为0.020mol／L时达到最大值0.044和0.042。
日本大耳兔局部脑血容量(rCBV)磁共振成像图见图3：图中(左)未应用造影剂；(右)应用造影剂。
本发明积极效果在于：
通过一锅法制备多肽修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体过程中，磁性纳米粒子聚集体尺寸可调；磁性纳米粒子聚集体表面可一步修饰生物活性基团；制备方法操作简单，效率高，成本低，使用安全。
附图说明
图1为本发明透射电镜照片；
图2为聚赖氨酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的磁性质测试图；
图3为日本大耳兔局部脑血容量(rCBV)磁共振成像图，(左)未应用造影剂；(右)应用造影剂。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1：
制备聚天门冬氨酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子
1、将含有5.6mmol/LFeCL3和11.2mmol／LFeCL2的150ml水溶液混合形成络合物。
2、将溶液加热至55℃后，在步骤（1）所得溶液中通N2气除氧。
3、在通N2气条件下迅速加入12.5mLNH3·H2O，加入4000KD的PASP使其浓度为0.020mmol／L，用0.1mol／HCL将溶液pH调至3.5后，将步骤2）混合溶液在80oC、1000转/分条件下机械搅拌下反应30分钟即得到PASP修饰的USPIO。
4、将步骤3）所得产物保存在20毫升0.05摩尔pH值为7.3的HEPES缓冲溶液中。
激光粒度仪测量结果表明，PASP修饰的USPIO粒径为6-14nm，以日本大耳兔为模型，脑灰质和脑白质的SRRmax为83.00和76.00，脑灰质和脑白质的核磁信号弛豫率变化(△R2 *)为0.044和0.042。透射电镜照片参见图1。
实施例2：
制备聚赖氨酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子
1、将含有5.6mmol/LFe(NO3)3和11.2mmol／LFe(NO3)2的150ml水溶液混合形成络合物。
2、将溶液加热至60℃后，在步骤（1）所得溶液中通N2气除氧。
3、在通N2气条件下迅速加入12.5mLNH3·H2O，加入分子量1500000KD的PLL使其浓度为0.020mmol／L，用0.1mol／HCL将溶液pH调至3.5后，将步骤2）混合溶液在80oC、1000转/分条件下机械搅拌下反应30分钟即得到PLL修饰的USPIO。
4、将步骤3）所得产物保存在20毫升0.05摩尔pH值为7.3的HEPES缓冲溶液中。
激光粒度仪测量结果表明，PLL修饰的USPIO粒径为175-200nm，以日本大耳兔为模型，脑灰质和脑白质的SRRmax为70.00和45.00，脑灰质和脑白质的核磁信号弛豫率变化(△R2 *)为0.030和0.018。
实施例3，
制备聚谷氨酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子
1、将含有5.6mmol/LFe2(SO4)3和11.2mmol／LFeSO4的150ml水溶液混合形成络合物。
2、将溶液加热至65℃后，在步骤（1）所得溶液中通N2气除氧。
3、在通N2气条件下迅速加入12.5mLNH3·H2O，加入分子量20000KD的PGA使其浓度为0.020mmol／L，用0.1mol／HCL将溶液pH调至3.5后，将步骤2）混合溶液在80oC、1000转/分条件下机械搅拌下反应30分钟即得到PGA修饰的USPIO。
4、将步骤3）所得产物保存在20毫升0.05摩尔pH值为7.3的HEPES缓冲溶液中。
激光粒度仪测量结果表明，PGA修饰的USPIO粒径为50-86nm，以日本大耳兔为模型，脑灰质和脑白质的SRRmax为33.00和55.00，脑灰质和脑白质的核磁信号弛豫率变化(△R2 *)为0.034和0.031。
实施例4，
制备聚赖氨酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子
1、将含有5.6mmol/LFe2(C2O4)3和11.2mmol／LFeC2O4150ml的水溶液混合形成络合物。
2、将溶液加热至60℃后，在步骤（1）所得溶液中通N2气除氧。
3、在通N2气条件下迅速加入12.5mLNH3·H2O，加入分子量20000KD的PGA使其浓度为0.020mmol／L，用0.1mol／HCL将溶液pH调至3.5后，将步骤2）混合溶液在80oC、1000转/分条件下机械搅拌下反应30分钟即得到PLL修饰的USPIO。
4、将步骤3）所得产物保存在20毫升0.05摩尔pH值为7.3的HEPES缓冲溶液中。
激光粒度仪测量结果表明，PLL修饰USPIO粒径为110-135nm，以日本大耳兔为模型，脑灰质和脑白质的SRRmax为24.00和38.00，脑灰质和脑白质的核磁信号弛豫率变化(△R2 *)为0.025和0.023。
通过以下实验证明本发明的积极效果：
通过透射电镜、激光粒度仪等测试了所合成的纳米粒子的大小及胶体稳定性，并以日本大耳兔为动物模型，测试了所得造影剂的生物相容性及其造影能力。
表1不同分子量多肽修饰的磁性造影剂的粒径分布及最佳浓度
透射电镜(TEM)观察结果表明，参见图1，多肽修饰前后USPIO纳米粒子的尺寸和形貌无明显变化，统计结果表明，激光粒度仪测量大部分粒子尺寸范围为6～200nm（参见表1）。共沉淀方法制备的USPIO胶体稳定性较差，在溶液中易于聚集而发生沉淀。多肽修饰后的USPIO胶体聚集沉淀速度明显减慢，因此胶体稳定性得到了提高。电位测量结果（参见图2）表明，随着多肽修饰量的增加，USPIO表面负电荷增加，在多肽浓度为0.020mol／L时达到最低点，进一步增加多肽的浓度，其表面负电荷又略有减少。不同pH下电位测量结果表明，USPIO的等电点为7；而用0.020mol／L的多肽修饰后，USPIO等电点降低到2，与多肽侧链羧基的pKa(2.27)相近，表明此时多肽在USPIO表面形成了比较致密的修饰层（参见表1）。多肽修饰后，USPIO表面负电荷增加，等电点从pH中性区移至酸性区，有利于改善USPIO在生理条件下的胶体稳定性。
核磁检测及图像数据处理和分析
扫描参数：重复时间(TR)=800ms，回波时间(TE)=45ms，激励次数(NEx)=1，采集7幅基准图像(pHase)后，注射对比剂．PWI原始图像转到AW4.2工作站进行数据处理，计算公式为
SRRmax(％)=[(S10一SIpeak)／S10]×100％；△R2 *=-In(SIt／SI0)／TE
式中，SRRmax为最大信号下降的百分比，S10为灌注前的信号强度，SIpeak为灌注成像中兴趣区信号的最小值．△R2 *表示T2*弛豫率的变化(即1／T2*的变化率)，SIt表示对比剂首次通过期间任一时间点的兴趣区信号强度，TE为PWI时的回波时间。
选用日本大耳兔为模型实验动物，将不同浓度多肽修饰的USPIO注射入兔体内，并在相同条件下进行脑部核磁成像。当多肽浓度较低(0.004mol／L)时，脑灰质和脑白质核磁信号的SRRmax值和T2*弛豫率变化(△R2 *)均为零，未观察到增强效果．当多肽浓度增加到0.010mol／L时，脑灰质和脑白质的SRRmax值分别为70.00和45.00，表现了一定的增强效果。当多肽浓度为0.020mol／L时，脑灰质和脑白质的SRRmax进一步增加到83.00和76.00。当多肽浓度达到0.030mol／L时，脑灰质和脑白质的SRRmax下降到33.0和50.00。脑灰质和脑白质的核磁信号弛豫率变化(△R2 *)也表现出同样的规律，在修饰浓度为0.020mol／L时达到最大值0.044和0.042（参见表2）。
表2不同分子量多肽修饰的磁性造影剂的造影效果
日本大耳兔局部脑血容量(rCBV)磁共振成像图见图3：图中(左)未应用造影剂；(右)应用造影剂。
Claims (2)
1.一种一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法，具体步骤包括：
1）在55℃~65℃下，将不同分子量的多肽分子和Fe（II）和Fe（III）铁盐混合溶于水中，形成络合物溶液；其中，
多肽分子与Fe（II）和Fe（III）铁盐总和的摩尔比为（5~10）：1；
Fe（II）和Fe（III）铁盐的摩尔比为1：2；
2）在60oC下向步骤1）得到的络合物溶液中加入浓氨水，氨水与铁盐的摩尔比为5：1；
3）将步骤2）混合溶液在80oC、1000转/分条件下机械搅拌下反应30分钟，得多肽修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体；
4）将步骤3）所得产物溶于保存在20毫升0.05摩尔pH值为7.3的HEPES缓冲溶液中；
所述的多肽分子选自与Fe离子具有较好络合能力且具有一定生物活性的聚氨基酸分子，为分子量70000～1500000KD的聚赖氨酸、分子量4000～9000KD的聚天冬氨酸、分子量20000～50000KD的聚谷氨酸；
所述的Fe（II）铁盐，指的是水溶性亚铁盐，为氯化亚铁、硫酸亚铁、硝酸亚铁、草酸亚铁；
所述的Fe（III）铁盐，指的是水溶性铁盐，为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、草酸铁。
2.根据权利要求1所述的一锅法制备多肽修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体的方法，其特征在于：
所述的超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体的尺寸可通过改变多肽分子的分子量以及多肽分子和铁盐比例来调控；聚集体尺寸随多肽分子量增大而增大，在6nm～200nm间调控。
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