CN104011062A - 用于生物柴油和生物乙醇生产的改造的生物量 - Google Patents

Abstract

本文涵盖的公开内容部分地涉及，用于增加植物生物量的能量密度的方法，其可用于生产可再生燃料，如生物柴油油和/或乙醇。在一方面，对于增强的糖积累的基因改造可以通过细菌酶蔗糖异构酶的过表达实现。从本文涵盖的公开内容的植物中提取的糖或油可用于工业用途，例如加热、生产生物燃料，如生物柴油燃料，或润滑应用。

Description

用于生物柴油和生物乙醇生产的改造的生物量

背景技术

对替代能源不断增长的需求可以至少部分地用植物来源的生物燃料油和/或乙醇的可再生供应来满足。要成为化石燃料的可行的替代，生物燃料应提供在生产中的净能量增益，具有环境效益，在经济上有竞争力，并且可大量生产而不减少粮食供应，减少粮食供应是现有生物燃料生产的不期望的副产品。

相对于化石汽油和柴油，两个主要的美国替代运输燃料，是从玉米籽粒淀粉发酵的乙醇和从大豆种子中提取的生物柴油油。玉米和大豆均是主要作物，国家粮食供应显著依赖它们。玉米乙醇比在其生产中的能源投入多获得25％的能源，而生物柴油多获得93％。相对于它们所替代的化石燃料，通过乙醇生产和燃烧的温室气体排放量降低12%并且通过生物柴油降低41％。生物柴油还比乙醇每净能量增益释放更少的空气污染物。生物柴油比乙醇的这些优点来自于较低的农业投入和原料至燃料的效率更高的转换。然而，根据希尔等（Proc Natl Acad Sci USA. 2006, 103(30):11206-11210）:11206-11210）最近的估计，甚至将美国所有的玉米和大豆的生产贡献给生物燃料也将只能满足汽油需求的12％和柴油需求的6％。

高生物量植物，特别是宽叶高生物量植物，具有很大的生物燃料的潜力。可以获得100-400吨/亩之间的低成本、高价值的生物量材料的植物是特别有用的，特别是当高成本、劳动力需求、化学试剂投入或者低生物量植物生产相关的地域限制均不存在时。

虽然已经研究了很多的植物作为替代能源资源，烟草（红花烟草（Nicotiana tabacum）和来自烟草属的其它种）大多已被忽视。与硬木树类似，在它已被切断之后，烟草将从其残余部分萌芽或重新发芽。萌芽使得在一年内可以多次收获，从而使其能够产生很高的生物量吨位。烟草可以在广泛的环境中不同种类的土壤上茂盛生长。烟草种子的产量达600kg/ha。烟草种子的含油量按重量计范围在36％和41％之间（Giannelos P N, Zannikos S, Stournas S, Lois E, Anastoloulos G.  Industrial Crops and Products 2002, 16:1-9），表明媲美传统的产油植物之一，如大豆或油菜籽的有效的油合成机制的存在。最近的实验表明，在大部分操作条件下，在性能参数和排放方面，烟草籽油可以部分替代石油柴油燃料，无需任何发动机改进和共混物预热（Gunstone F. D., Pollard M., In F. D. Gunstone, ed, Structured and Modified Lipids. Marcel Dekker, New-York, pp 155-184 (2001); Usta N., Biomass and Bioenergy 2005, 28: 77-86）。

理想情况下，支持国家的替代运输燃料的需求所需要的是从生长在农业边际土地上的低投入生物量，使用不涉及食品供应链的高生物量植物种类生产的生物燃料。

以植物油形式的植物脂质是主要的植物产品，在人类营养中具有很大的经济重要性，以及作为可再生原料用于各种工业产品和生物燃料。对替代能源不断增长的需求可以用植物来源的燃料油和/或乙醇的可再生供应来满足。植物代表生物燃料植物油的重要来源，因为许多物种积累油脂作为种子中主要储存组分。在种子中的植物储存油的主要形式是三酰基甘油酯（TAG），取决于不同的品种，其代表种子重量的15-50％。尽管积累在种子中，主要的油合成发生在绿色光合作用组织叶绿体中，并且糖作为主要的前体用于脂肪酸合成（Durret等，2008）。但是，油合成的主要底物是在绿色光合作用组织（叶和茎）中生成的碳水化合物，其随后在叶绿体中被代谢以产生游离脂肪酸和乙酰辅酶A单元，TAG的基本构建块。因此，植物叶子是对于TAG的构建块合成的主要场所，而且因为它已经被实验检验，油料种子中积累的TAG的量可通过在质体中产生的脂肪酸的量来部分确定。(Bao X, Ohlrogge J.  Plant Physiol. 1999, 120:1057-62)。TAG的最终储存发生在种子中称为油体的小球状的细胞器中（L. Planta, 1996, 208:503-511; Wahlroos T, Soukka J, Denesyuk A, Wahlroos R, Korpela T, Kilby N J.  Genesis. 2003, 35(2):125-132; Katavic V, Agrawal G K, Hajduch M, Harris S L, Thelen J J.; Proteomics. 2006, 16: 4586-4598）。TAG仅代表约0.2-0.3%的叶子生物量。我们最近的代谢改造努力[Andrianov 等, 2010]通过二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）加倍了从绿色生物量提取的脂肪酸的量（干重的6％），所述二酰基甘油酰基转移酶是三酰基甘油（TAG）脂类生物合成的关键酶[Jako C 等，2001]。此外，参见美国专利申请号2010/0184130（Koprowski等），其通过引用并入本文。在本研究的过程中，发明人确定通过DGAT过表达的脂质积累的倍增伴随着脂肪酸前体库的减少。此外，本发明人先前的对高糖品种烟草NC55的研究证明，在植物组织中初始较高的糖含量有利于更高的脂质积累。本发明人确定，限速因素如油生物合成前体的表达，例如增加糖（主要的油合成前体）的可获得性，可以校正不平衡，并支持TAG在绿色物质中更高的合成和储存。

在以前发表的研究中，Bornke等（2002）已发现，载有异麦芽酮糖合成酶基因的转基因烟草植株表现出多重严重的表型改变：成熟过程中幼叶卷曲和发育漂白区域，花呈畸形和不育。在他们的实验中，异麦芽酮糖被发现以高浓度存在于几个亚细胞区室中，加上一般毒性作用（Bornke F, Hajrezaei M, Heineke D, Melzer M, Herbers K, Sonnewald U. , Planta, 2002, 214, 3: 356-364）。也已表明编码蔗糖异构酶（其转化蔗糖成异麦芽酮糖）的细菌基因的过表达，显著增加在马铃薯块茎中的总糖量（Boernke等，2002a），并加倍在甘蔗中的总糖含量（Wu, Birch, 2007）。然而这种酶在烟草细胞的胞质中的表达导致植物发育的一些形态异常（Boernke等，2002b）。

发明简述

本文的公开内容部分地涉及，用于增加植物生物量的能量密度的方法，其可用于生产可再生燃料，如乙醇。本文涵盖的公开内容部分地涉及在其生物量中具有增强的糖和油（例如，三酰基甘油酯）的植物的用途，其增加代谢物库用于乙醇发酵。在一个实施方案中，高糖植物可以是天然选择的变体或基因改造用于更高的糖积累。具体而言，对于增强的糖积累的基因改造可以通过，例如，细菌酶蔗糖异构酶（SI）的过表达实现。增强的糖用作前体用于脂肪酸合成，脂肪酸是植物油的基本组分。糖浓度的增加将显著改善将植物生物量转化成乙醇的效率。从植物中提取的乙醇可以用于工业目的，例如生物燃料并且是重要的工业成分。

本公开部分地提供用于进一步增加植物生物量中糖含量的创新的代谢改造的方法。因为在植物生物量中的糖是可以很容易地发酵成乙醇的主要化合物，在一个实施方案中，本文的公开内容包括增加糖浓度以提高将植物生物量转化成乙醇的效率。虽然可在植物组织中积累的蔗糖的量是在严格的生理控制下，除了蔗糖之外，一些蔗糖异构体，如异麦芽酮糖（也称为6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖并且商品名PALATINOSE），也可以积累到高浓度。

在一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，相比未修饰的植物，其增强了在植物生物量中生物燃料合成前体的含量，其中所述基因表达盒包括：

a）至少一个转录调节核苷酸序列，其中所述转录调控核苷酸序列是：

     i）组成型启动子；

     ii）诱导型启动子

     iii）组织特异性启动子

     iv）发育调节的启动子

     v）核苷酸序列，其是任何在i）至iv）下先前提及的核苷酸序列的互补物或反向互补物，并且功能性地连接到其上；和

     vi）其组合物，

b）至少一个基因，相比未修饰的植物，其增强在植物生物量中的油生物燃料前体的含量，所述基因选自：

     i）编码SI的基因；

     ii）如图1所述序列；

     iii）编码淀粉酶的基因；

     iv）抑制淀粉合成的基因；

     和

     v）其组合。

在一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，其中所述的化学诱导型启动子选自四环素诱导型启动子、乙醇诱导型启动子以及激素诱导型启动子。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，其中所述转录调控核苷酸序列是选自下列的启动子：CaMV 35S、Rubisco、组蛋白基因启动子、泛素、criptic tCUP、VR-ACS1、CsVMV、ScBV、eLF4A-10和ibAGP1。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，其中所述基因表达盒增强植物生物量的糖生产。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，其中所述基因表达盒增强植物生物量的糖含量。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，其中所述基因表达盒增强植物生物量的糖生产和/或储存，由此增强植物生物量的生物燃料含量。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，其中所述基因表达盒靶向表达到植物液泡。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，其中所述至少一种糖增强基因的表达任选地与导入的或天然脂质生物合成基因的表达相一致。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，其进一步包括至少一种选自下列的额外的基因：酯酶、硫酯酶、月桂基-酰基载体蛋白硫酯酶、酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶、Sn-2酰基转移酶、Lec2、油质蛋白及其组合。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因表达盒，其中糖和/或脂质增强基因的协同表达导致发酵的糖和脂质在修饰的植物生物量中相比未修饰的植物升高的积累。在另一个实施方案中，本文所公开的是包括表达盒的载体。

在一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，相比未修饰的植物，其具有增强的在植物生物量中生物燃料前体的含量，其中所述基因表达盒包括：

a）至少一个转录调节核苷酸序列，其中所述转录调控核苷酸序列是：

     i）组成型启动子；

     ii）诱导型启动子

     iii）组织特异性启动子

     iv）发育调节的启动子

     v）核苷酸序列，其是任何先前提及的在i）至iv）下的核苷酸序列的互补物或反向互补物，并且功能性地连接到其上；和

     vi）其组合物，

b）至少一个基因，相比未修饰的植物，其增强在植物生物量中的油生物燃料前体的含量，所述基因选自：

     i）编码SI的基因；

     ii）如图1所述序列；

     iii）编码淀粉酶的基因；

     iv）抑制淀粉合成的基因；

     和

     v）其组合。

在一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其中所述生物合成前体是糖。在一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其包括至少一种糖和/或脂质增强基因。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其包括至少一种糖增强基因。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其中所述糖增强基因的表达任选地与导入的或天然脂质生物合成基因的表达相一致。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其中糖和脂质增强基因的表达导致发酵的糖和/或脂质在修饰的植物生物量中相比未修饰的植物升高的积累。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其用作原料用于同时或顺序生产乙醇和/或生物柴油燃料。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其通过过表达糖合成的酶，如细菌SI、淀粉降解酶如淀粉酶，导致糖的积累，或通过抑制淀粉合成进行改造。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其中相比未修饰的植物代谢流被改变，导致更高产量的糖和/或脂质的积累。

在一个实施方案中，本文所公开的是经基因修饰的植物的转基因植物产品、繁殖材料、细胞、器官、部分、愈伤组织、细胞培养物、转基因后代的种子。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其中所述基因修饰的植物选自单子叶植物、双子叶植物、烟草、玉米、豌豆、加拿大低酸油菜（canola）、芥菜、谷子、向日葵、大麻、柳枝稷、浮萍、甘蔗、高粱和甜菜。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其中所述基因修饰的植物选自烟草、大麻、柳枝稷以及浮萍。

在一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其相比于未基因修饰的植物具有增加的糖的量，并且其中所述基因修饰的植物是用基因表达盒进行基因修饰。在另一个实施方案中，本文所公开的是基因修饰的植物，其相比于未基因修饰的植物具有增加的油的量，并且其中所述基因修饰的植物是用基因表达盒进行基因修饰。

在一个实施方案中，本文所公开的是改造高油植物生物量的方法，所述方法使用相比于未修饰的植物具有升高的生物燃料合成前体含量的基因修饰的植物，作为宿主植物用于脂质的代谢改造，包括：a）将基因表达盒导入植物；和b）选择具有升高的油生物燃料前体含量的转基因植物。

在一个实施方案中，本文公开的是生产具有增强的能量含量的基因修饰的植物的方法，其中所述方法包括如下步骤：a）将基因表达盒导入到植物中；和b）选择具有增强的能量含量的转基因植物。

在一个实施方案中，本文公开的是生产相比对应的对照植物具有增强的糖含量的基因修饰的植物的方法，其中所述方法包括如下步骤：a）将基因表达盒导入到植物中；和b）选择具有增强的糖含量的转基因植物。在另一个实施方案中，本文所公开的是方法，其中所述生物合成前体是糖。在另一个实施方案中，本文所公开的是方法，其中所述糖增强基因的表达任选地与导入的或天然脂质生物合成基因的表达相一致。在另一个实施方案中，本文所公开的是方法，其中所述糖和/或脂质增强基因的协同表达导致发酵的糖和脂质在修饰的植物生物量中相比未修饰的植物升高的积累。在另一个实施方案中，本文所公开的是方法，其中所述基因表达盒增强植物生物量的糖含量。本文涵盖的公开内容进一步提供方法，其中所述基因表达盒增强植物生物量的糖生产，由此增加植物生物量的油含量。在另一个实施方案中，本文所公开的是方法，其中所述基因表达盒靶向表达到植物液泡。在另一个实施方案中，本文所公开的是方法，其中所述基因修饰的植物选自单子叶植物、双子叶植物、烟草、玉米、豌豆、加拿大低酸油菜、芥菜、谷子、向日葵、大麻、柳枝稷、浮萍、甘蔗、高粱和甜菜。在另一个实施方案中，本文所公开的是方法，其中所述经基因修饰的植物的生物量被用于生产生物柴油和生物乙醇两者。

在一个实施方案中，本文所公开的是生产生物乙醇的方法，其包括：提供包括基因表达盒的基因修饰的植物生物量；转化植物生物量为生物乙醇。在另一个实施方案中，本文所公开的是方法，其中所述基因修饰的植物生物量选自单子叶植物、双子叶植物、烟草、玉米、豌豆、加拿大低酸油菜、芥菜、谷子、向日葵、大麻、柳枝稷、浮萍、甘蔗、高粱和甜菜。

附图简述

本文公开内容结合下面的附图进行描述，其中相同的标号表示相同的元件，并且其中：

图1描绘了具有信号肽的密码子优化的蔗糖异构酶（异麦芽酮糖）基因序列的序列。图1A至1C显示蔗糖异构酶（异麦芽酮糖）基因的核苷酸序列。

图2描绘了在载体pUC57中的SI的表达盒。Car-sp是钙网蛋白信号肽并且Spo是sporamin蛋白液泡靶向信号。

图3描绘了用于在植物中表达SI的转化载体。

图4描绘了在转化的烟草中导入的SI基因的PCR分析。在用在CaMV 35S（33个品系）和Rubisco（25个品系）启动子的控制下的靶向液泡的SI基因的遗传转化后已产生58个转基因烟草品品系。通过PCR已证实来自每个转化（35S-SI和Rubiso-SI）的20个品系包含SI基因。植物PCR分析使用的引物包括：PalI-for1 (CTGCTAGCAGATTCAATCCAATTAGACTCCC)和PalI-rev1 (TAAAGATCCTGTCTAACCTTTGGATTATCCC)。片段大小是620bp。

图5描绘细菌SI的表达的分析，其导致异麦芽酮糖的积累。来自PCR阳性品系（参见图4）的样品已被收集用于糖分析，并且其结果如所示。如通过GC-MS检测的，异麦芽酮糖显示在选定的过表达在35S启动子（S）和Rubisco启动子（R）的控制下的PalI基因的烟草品系中。最好的表达品系已被选择用于进一步生长和种子生产表达靶向液泡的SI的烟草植株不显示任何可见的形态异常。

发明详述

本文所公开的是基因表达盒，其包括一种或多种基因，其中所述基因表达盒可以用于特异性改造烟草植物以提高一种或多种代谢产物的生产。在一个实施方案中，本文还公开至少一种从所述基因表达盒表达的肽，所述肽包括液泡靶向序列。本文还公开了基因改造的烟草植物，同时使用若干关键基因的组合用于增加糖和脂肪酸的积累。在一个先前的研究中，通过在Rubisco强启动子下二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）的过表达；和转录因子LEC2调节表达（Andrianov等, 2009），建立了具有双倍脂肪酸的量（6%干重）的烟草植株，所述二酰基甘油酰基转移酶是三酰基甘油酯（TAG）类的生物合成中的关键酶。在同一植物中使用遗传杂交或两个基因的同时转化结合两种性状可以导致油积累的进一步增加。根据得到的数据，很明显，这两个基因的过表达还伴随着脂肪酸前体库的减少以及在油体膜中利用的一些磷脂水平的提高。因此，在一个实施方案中，限速因子的表达可以纠正不平衡，并支持在绿色物质中更多的TAG合成和储存（Roesler等，1997）。   在一个实施方案中，来自拟南芥的脂质代谢的相应关键酶乙酰辅酶A羧化酶（ACC）在烟草中在强35S启动子的控制下过度表达，并使用相应的信号肽靶向至叶绿体。这在用于脂肪酸生物合成的前体库中应提供显著增加。在一个实施方案中，为了产生扩展的贮库（reservoir）用于TAG在叶组织中的储存，编码拟南芥油质蛋白蛋白质（OLE1）（所述油质蛋白与磷脂一起形成油体膜（Purkrtova等，2008））的基因，可以在烟草中在强力的组成型启动子的控制下表达。DGAT和OLE 1基因的组合将被转化到相同的植物中，产生累积效应，导致在储存油体中更高的TAG积累。此外，先前的研究证明，在植物组织中初始较高的糖含量有利于更高的脂质前体的积累。在一个实施方案中，本文涵盖的公开内容提供了组合物和用于提高在植物组织中的糖含量以积累用于脂质生物合成的前体的方法。

如本文中其它地方所提到的，Bornke等（2002）已发现，载有异麦芽酮糖合成酶基因的转基因烟草植株显示多个严重的表型的改变。在他们的实验中，如果没有正确引导，异麦芽酮糖没有靶向进入液泡，相反，它被发现在几个亚细胞区室中以升高的浓度存在，表明一般毒性作用。在一个实施方案中，为了实现在绿色生物量中更高的糖积累，转换蔗糖成其储存异构体异麦芽酮糖的细菌酶SI（Wu L, Birch RG, 2007），可以在三个不同的启动子（CaMV35S、RbcS以及WRKY53）之下在烟草中与液泡靶向信号一起表达，所述液泡靶向信号在本文中也称为“液泡靶向序列”。如本文更详细描述的，融合到目的蛋白的液泡靶向序列使得该融合蛋白在细胞中能够特定地传输和定位到液泡。

“液泡靶向序列”可以指核酸序列或氨基酸序列，取决于该术语使用的上下文。在一个实施方案中，液泡靶向氨基酸序列是通过液泡靶向核酸序列编码的氨基酸序列，其在一些实施方案中，包括在如本文所公开的基因表达盒中。

处理液泡靶向蛋白，例如大麦液泡巯基蛋白酶（aleurain）、凝集素、甘薯sporamin蛋白和烟草几丁质酶A的分子机制已经研究了超过二十年。已经表明，特异性的液泡分选信号，无论在植物液泡蛋白的N末端或C-末端前肽中，对于适当的识别和转运那些蛋白到靶向目的地是关键的（Dice JF.  Trends Biochem Sci, 1990, 15:305-309; Chrispeels MJ. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1991, 42: 21-53; Chrispeels MJ, Raikhel NV. Cell, 1992, 68: 613-616; Nakamura K and Matsuoka K.  Plant Physiol., 1993, 1O1 : 1-5）。

通过举例的方式，sporamin蛋白A的前体，沉积在液泡中的甘薯块根的贮藏蛋白，在膜结合的多核糖体中合成，并在成熟形式的N-末端具有37个氨基酸的附加肽，其可分为N-末端假定信号肽序列（残基-37至-17）和富含带电荷氨基酸的区段（残基-16至-1）（Hattori, T.,等，Plant Mol. Biol., 1985, 5, 313-320）。在转化的烟草细胞中，sporamin蛋白（甘薯的贮藏蛋白）前体的前肽(propeptid)，对于sporamin蛋白靶向液泡是需要的（Matsuoka K, Nakamura K., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991, 188: 834-838）。在一个实施方案中，sporamin蛋白A序列用于本文包括的组合物中。在一个实施方案中，sporamin蛋白B序列用于本文包括的组合物中。在一个实施例中，两个或更多个sporamin蛋白序列用在组合物中，其中所述组合物包括至少两种sporamin蛋白A序列，至少两种sporamin蛋白B序列，或至少一种sporamin蛋白A和一种sporamin蛋白B序列。在一个实施方案中，包含至少部分的sporamin蛋白A和/或至少部分的sporamin蛋白B的序列被用在本文所包括的组合物中。

通过另一个实例的方式，由诱导型GAL10启动子和sporamin蛋白的cDNA组成的融合基因导入酿酒酵母，导致甘薯贮藏蛋白sporamin成功递送到酵母细胞液泡中（Matsuoka K, Nakamura K. Plant Cell Physiology, 1992,33 ,4: 453-462）。还已经证明，通过识别专门氨基端前肽有利于来自大麦的sporamine在转基因烟草细胞液泡中的特异性积累（Schroeder M., Borkhsenious N., Matsuoka K, Nakamura K., and Raikhel N.  Plant Physiology, 1993, 101: 451-458）。

在一个实施方案中，液泡靶向序列包括大麦凝集素的C-末端前肽。大麦凝集素的C-末端前肽（Bednarek, S. Y., 等, Plant Cell,  1990, 2: 1145-1155）被证明会导致在转基因烟草中的突变蛋白的分泌，证明这些贮藏蛋白的前肽携带对于液泡靶向必需的序列。在一个实施方案中，液泡靶向序列包括烟草几丁质酶A的C-末端延伸。烟草几丁质酶A的短的C-末端延伸已显示作为液泡靶向信号发挥功能。其对于几丁质酶A的正确的液泡靶向是必要的并且足以靶向无关的，正常分泌的III型几丁质酶到液泡（J-M Neuhaus, 等, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1991, 88:10362-10366）。在一个实施方案增中，液泡靶向序列包括衍生自马铃薯蛋白酶抑制剂的N末端液泡靶向序列。靶向液泡通过使用衍生自马铃薯蛋白酶抑制剂的N末端液泡靶向序列实现，已知所述序列是组成型靶向在马铃薯块茎中液泡，并而在伤口诱导下，靶向番茄叶片中的液泡（C Murray, 等, Transgenic Research, 2002, 11, 2: 199-214）。

在本公开的一个实施方案中，提供了基因表达盒，相比未修饰的植物，其增强了在植物生物量中生物燃料合成前体的含量，其中所述基因表达盒包括至少一种液泡靶向序列。在另一个实施方案中，基因表达盒包括至少一种基因，相比未修饰的植物，其增强在植物生物量中的油生物燃料前体的含量，其中所述增强油生物燃料前体在植物生物量中含量的基因还包括至少一种液泡靶向序列。在一个实施方案中，包括编码至少一种液泡靶向序列的核酸序列的基因被表达以产生包括氨基酸液泡靶向序列的蛋白。在一个实施方案中，液泡靶向序列包括蛋白，所述蛋白被输送到其从中表达的细胞的液泡内并在其中积累。在一个实施方案中，液泡靶向序列包括蛋白，所述蛋白被输送到细胞的液泡内并在其中积累，所述细胞是蛋白在其中表达的细胞之外的细胞。

在一个实施方案中，液泡靶向序列包括图1A中所述序列的从核苷酸80到核苷酸125所述的序列。在一个实施方案中，液泡靶向序列包括图1A中所述序列的从核苷酸80到核苷酸125所述的序列的衍生物。在一个实施方案中，液泡靶向序列包括图1A中所述序列的从核苷酸80到核苷酸125所述的序列的至少一部分。

农杆菌介导的转化后，所得到的烟草植物可以通过PCR对导入基因的存在进行测试，并在温室中生长用于对在它们的生物量中积累的脂质和糖的数量和质量进一步的分析。脂质增强的植物可以通过简单的显微镜测试使用脂质特异性染料苏丹IV表征油体的数量和大小。精确的定量的脂质估计和脂肪酸组成分析，可以通过气相色谱-质谱（GC-MS）进行。在糖增强植物中的总糖含量可以通过折射计来进行评价，并且异麦芽酮糖可通过液相色谱进行测量。在对于最高的脂质和糖的含量进行初步选择后，对于新性状的遗传稳定最好的品系可以是自花授粉的。所得到的F1代植株的种子可用于选择高性能的同源品系，其可以进一步用于在交叉授粉中产生组合高脂质和高糖性状的烟草原料。在生成的植物中的详细代谢物的分析后，最好的高糖，高油品系的汁液可以进行发酵以评估乙醇产量。

在一个实施例中，提供了用于增加植物生物量的能量密度的方法，其可用于生产可再生燃料，如生物柴油油和/或乙醇。本文涵盖的公开内容可以提供，在转基因植物中，在其生物量中具有增强的油生物合成前体含量，如同时增强的糖和油（例如，三酰基甘油酯），这增加了用于乙醇发酵和/或增加油积累的代谢物的库，导致能量密度增加。本文涵盖的公开内容提供了转基因植物，作为技术上导入SI DNA序列表达的结果，其蔗糖转化成异麦芽酮糖。以这种方式，在其它可能性之外，SI DNA序列的表达导致能量密度增加。

在一个实施方案中，本公开依赖于使用具有增强的生物燃料的合成前体含量的植物，如在其生物量中同时增强的糖和油（例如，三酰基甘油酯），这增加了代谢产物的库用于乙醇发酵和增加油积累。增强的生物燃料合成前体的植物可以是自然选择的品种或基因改造的用于更高的增强的生物燃料合成前体积累。具体而言，对于增强的糖积累的基因改造可以通过，但不限于，细菌酶SI或淀粉酶的过表达实现。在一个实施方案中，用于增强糖积累的基因改造可以，通过过表达包括液泡靶向序列（其引导表达的酶到细胞中的一个或多个液泡）的细菌酶SI实现。在一个实施方案中，细胞包括中央液泡，并且所表达的包括液泡靶向序列的酶被定向到中央液泡。在一个实施方案中，细胞包括至少两个液泡，其中之一任选地是中央液泡，并且所表达的包括液泡靶向序列的酶被定向到中央液泡。在一个实施方案中，细胞包括至少两个液泡，其中之一任选地是中央液泡，并且所表达的包括液泡靶向序列的酶被定向到至少两个液泡。在一个实施方案中，细胞包括至少两个液泡，其中之一任选地是中央液泡，并且所表达的包括液泡靶向序列的酶被定向到每个液泡。

在一个实施方案中，增强的糖可以用作前体用于脂肪酸合成，所述脂肪酸是植物油的基本组分。从本文涵盖的公开内容的植物中提取的油可用于工业用途，例如加热、生产生物燃料，如生物柴油燃料，或润滑应用。如本文所用，术语“生物燃料合成前体”指，例如糖。

在一个方面，本公开涉及具有相比其未基因修饰的对应物，具有增加的生物燃料的合成前体的量的基因修饰的植物，并且其中所述基因修饰的植物是被基因修饰以刺激在绿色植物组织中相比其未基因修饰的对应物增加的生物燃料合成前体积累。此基因修饰的植物优选地具有第一基因的增加的表达，其在植物中增加例如，糖的生产，例如，但不限于，编码SI的细菌基因，所述序列如在图1中所述，编码SI的非细菌基因，编码淀粉酶的基因和抑制淀粉合成的基因。

在一个实施方案中，基因修饰的植物优选地具有第一基因的增加的表达，其在植物中增加例如，糖的生产，例如，但不限于，编码SI的细菌基因，所述序列如在图1中所述，编码SI的非细菌基因，编码淀粉酶的基因和抑制淀粉合成的基因，进一步其中所述基因包括液泡靶向序列。在一个实施方案中，定位于液泡中的SI可以作用于蔗糖以产生异麦芽酮糖。在一个实施方案中，液泡靶向SI在液泡中产生异麦芽酮糖。

在本领域中，已经证明，更高级的植物不容易导入或分解代谢细胞外异麦芽酮糖（Wu L, Birch R.  Plant Physiology,  2011, 157, 4: 2094-2101），表明植物细胞壁和膜对异麦芽酮糖具有很少或没有通透性。还已经表明，在转基因烟草中，异麦芽酮糖不穿透液泡，虽然它被发现以高浓度在其它细胞和亚细胞区室中（Bornke F, Hajrezaei M, Heineke D, Melzer M, Herbers K, Sonnewald U. Planta, 2002, 214, 3: 356-364）。此外，发现异麦芽酮糖，植物细胞的外源物质，不被蔗糖转运蛋白识别，尽管两者之间只有非常微小的结构差异（Srivastava A,  Ganesan S, Ismail I, Ayre B.   Plant Physiology,  2008, 148: 200-211）。

在一个实施方案中，第一基因可操作地连接到调节基因表达的第一启动子，如选自下列的启动子：组成型启动子、发育调节的启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。此基因修饰的植物还可以包括第二基因，其编码，例如，调节基因修饰的植物的种子发育的转录因子。第二基因可以是，例如，编码多肽的基因，其中所述多肽是参与脂质代谢的酶，特别是参与增加油积累的酶（Beisson等, Plant Physiol., 132(2), 681-697 (2003); Thelen and Ohlrogge, Metabolic Engineering, 4, 12-21 (2002); Baud 等, Plant J., 33(1), 75-86 (2003); Vigeolas 等, Plant Biotechnol. J., 5(3), 431-41 (2007)）。在优选的实施方案中，所述酶选自水解酶和酰基转移酶，并且其中所述基因可操作地与启动子连接。在另一个实施方案中，所述多肽是酯酶、硫酯酶、月桂基-酰基载体蛋白硫酯酶、酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶或Sn-2酰基转移酶。优选地，使用植物、酵母或动物来源的二酰基甘油酰基转移酶。第二基因可以可操作地连接第二启动子，优选诱导型启动子。

在另一个实施方案中，所述第二基因可以编码酯酶、硫酯酶、月桂基-酰基载体蛋白硫酯酶、酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶或Sn-2酰基转移酶。优选地，使用植物、酵母或动物来源的二酰基甘油酰基转移酶。

在一个实施方案中，所述基因修饰的植物已被修饰，以相比未修饰的植物增加在植物生物量中的生物燃料合成前体的含量。

在一个实施方案中，基因修饰的植物具有增加的编码多肽的基因的表达，其中所述多肽是参与糖代谢的酶，例如SI。具有SI活性的蛋白催化二糖蔗糖到其他二糖的异构化反应。在这种情况下，蔗糖的两个单糖单元之间的α1-β2糖苷键，即葡萄糖和果糖之间的糖苷键，被转换成两个单糖单元之间的另一种糖苷键。尤其是，SI，也称为蔗糖突变酶，催化重排成α1-α6-键和/或α1-α1键。二糖异麦芽酮糖作为异构化为α1-α6键的结果形成，而二糖海藻糖在重排成α1-α1键的过程中形成。在一个实施方案中，编码SI的基因是细菌基因。在一个实施方案中，编码SI的基因是非细菌基因。在一个实施方案中，编码SI的基因是合成的基因。在一个实施方案中，编码SI的基因包括图1中描述的核酸序列。在一个实施方案中，编码SI的基因是图1中描述的核酸序列。

其细胞中包含编码具有SI活性的蛋白的核酸序列的生物体的实例，尤其包括精蛋白杆菌属（Pro-taminobacter）、欧文氏菌属（Erwinia）、沙雷氏菌属（Serratia）、明串珠菌属（Leuconostoc）假单胞菌属（Pseudomonas）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和肠杆菌属（Enterobacter）的微生物。这里特别提及可以由这些微生物的下列实例组成：精蛋白杆菌（Protaminobacter rubrum） (CBS 547, 77)、大黄欧文菌（Erwinia rhapontici）(NCPPB 1578)、普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）(ATCC 15928)、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）(NCIB 8285)、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）NRRL B-521f (ATCC 10830a)、 嗜中酸假单胞菌（Pseudomonas mesoacidophila）MX-45 (FERM 11808 or FERM BP 3619)、放射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter） MX-232 (FERM 12397 or FERM BP 3620)、克雷伯氏菌亚种（Klebsiella subspecies）和肠杆菌亚种（Enterobacter species）。

在一个实施方案中，基因修饰的植物具有增加的编码多肽的基因的表达，其中所述多肽是参与糖代谢的酶，例如淀粉酶。淀粉酶是催化淀粉水解成糖的酶。淀粉酶水解淀粉中的内部α-1,4-糖苷键，主要是随机地，以生产小分子量的麦芽糖糊精。如本文所用，术语“淀粉酶”包括具有α-淀粉酶活性的酶（如，EC3.2.1.1类），例如，能够水解多糖内部α-1，4-葡聚糖链接的α-淀粉酶，包括能在碱性pH或酸性pH水解淀粉成糖的淀粉酶类。这些酶也被描述为那些实现在包含1,4 -α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中1,4 -α-D-糖苷键的外切水解（exohydrolysis）或内切水解（endohydrolysis）的酶。用于描述这些酶的另一个术语是“糖原酶”。

本文可用的α-淀粉酶根据从含淀粉的植物材料在α-淀粉酶的存在下液化得到的水解产物的数量和/或类型进行表征和分类。

α-淀粉酶类的合适的种类包括，例如，衍生自芽孢杆菌属（Bacillus sp.）（例如，如地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacien）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）），或黑曲霉的α-淀粉酶。

如本文所用，术语“植物”指整个植物、植物器官（即叶、茎、花、根等）、种子和植物细胞（包括组织培养细胞）及其后代。可以在本文涵盖的公开内容的方法中使用的植物的种类通常与适用于转化技术的高等植物的种类同样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，以及某些低等植物如藻类。合适的植物包括各种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体。术语“转基因植物”是指修饰以表达一种或多种基因的植物。虽然本文涵盖的公开内容中可以使用多种植物，本公开的基因修饰的植物优选选自烟草、玉米、豌豆、加拿大低酸油菜、芥菜、谷子、向日葵、大麻、柳枝稷、浮萍、甘蔗、高粱和糖用甜菜。优选地本文包括的植物选自烟草、大麻、柳枝稷和浮萍，因为它们不是对人类产生食物的农作物，并且因为它们可以在农业上的边际土地上种植。

术语“绿色生物量”指参与光合作用的植物的那些植物部分（例如，高等植物的茎和叶和水生植物如藻类）。

术语“基因修饰的”指其中的基因已被添加或修饰，以提供上述所需特性的植物。如本文所用，术语“基因”指无论单独或与其它元件组合能够在细胞中表达的元件或元件的组合。通常，基因包括（从5'到3'末端）：（1）启动子区，其包括能够在植物细胞中起作用的5'非翻译前导序列；（2）结构基因或多核苷酸序列，其编码所需的蛋白；以及（3）3'非翻译区，其通常导致转录终止和RNA序列的3'区的多聚腺苷酸化。这些元件的每一个通过顺序连接到邻近的元件被可操作地连接。在一个实施方案中，包括上述元件的基因通过标准的重组DNA方法被插入到植物表达载体中。在另一个实施方案中，包括上述元件的基因被插入到转化载体中。

如本文所用，“多肽”与蛋白、肽和肽片段可互换使用。“多肽”包括任何肽或蛋白，其包含两个或更多个通过肽键相互连接的氨基酸。如本文所用，该术语指短链，其也通常在本领域中被称为，例如，肽、寡肽和寡聚物，和较长链，其一般在本领域中被称为蛋白，其中有许多类型。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文所用，“启动子”指在结构基因表达的启动和调节中有活性的DNA序列。此DNA序列，通常在结构基因编码序列的上游，通过提供对RNA聚合酶和/或对于在正确的位点开始转录所需的其它元件的识别，控制所述编码区域的表达。

如本文所用，“多核苷酸”包括cDNA、RNA、DNA/RNA杂交体、反义RNA、核酶、基因组DNA、合成形式和混合的聚合物，正义和反义链，并且可通过化学或生物化学修饰以包含非天然的或衍生的、合成的或半合成的核苷酸碱基。此外，本文所涵盖的范围内包括野生型或合成的基因的改变，包括但不限于缺失、插入、一个或多个核苷酸的取代或对其它多核苷酸序列的融合，前提是在基因的一级结构中的这些变化基本上不改变所表达的多肽的活性。

如本文所公开的，“基本上同源的序列”包括那些与本文包括的多核苷酸具有至少大约50％同源性，优选至少约60％，更优选至少约70％同源性，甚至更优选至少约80％同源性，并且最优选至少约95％或更高同源性的多核苷酸。

在一个方面，本文涵盖的公开内容涉及具有相比其未基因修饰的对应物，具有增强的生物燃料合成前体的含量的基因修饰的植物，并且其中所述基因修饰的植物是被基因修饰以刺激在绿色植物组织中相比其未基因修饰的对应物增加的生物燃料前体和/或生物燃料积累。此基因修饰的植物优选地具有第一基因的增加的表达，其在植物中增加例如，糖的生产，例如，通过选自下列的多肽的表达：细菌SI、如在图1中所述的序列、非细菌SI、编码淀粉酶的基因和抑制淀粉合成的基因。在一个实施方案中，此基因修饰的植物优选地具有第一基因的增加的表达，其在植物中增加例如，糖的生产，例如，通过选自下列的多肽的表达：例如编码SI的基因，和/或如图1中所述的序列，进一步其中编码多肽的基因包括液泡靶向序列。此第一基因可操作地连接到调节基因表达的第一启动子，如选自下列的启动子：组成型启动子、发育调节的启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。

在一个实施方案中，基因修饰的植物具有增加的编码调节植物中种子发育的转录因子的基因的表达。这些转录因子可以涉及植物中的多种活性。具体而言，这种转录因子对开启胚胎发生程序从而导致种子的发育和成熟可以是必需的。优选地，所述转录因子可操作地与诱导型启动子连接。在另一个实施方案中，所述转录因子是LEC2 (Lotan T, Ohto M, Yee K M, West M A, Lo R, Kwong R W, Yamagishi K, Fischer R L, Goldberg R B, Harada J J. Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells. Cell. 1998 93(7):1195-205）或LEC1、FUS3或WR1。

如本文包括的基因修饰的植物也可以包括至少第二基因。所述第二基因可以选自例如水解酶和酰基转移酶，并且其中所述基因可操作地与启动子连接。在另一个实施方案中，所述多肽是酯酶、硫酯酶、月桂基-酰基载体蛋白硫酯酶、酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶或Sn-2酰基转移酶。优选地，使用植物、酵母或动物来源的二酰基甘油酰基转移酶。第二基因可以可操作地连接第二启动子，优选诱导型启动子。所述第二基因可以可操作地连接至少第二启动子，优选诱导型启动子。

第一和第二基因可以以任何顺序导入植物。例如，第一基因可以导入植物细胞中，随后筛选表达高水平的第一基因的细胞。任选地，这些植物细胞可以用于再生此阶段的植物。这些植物细胞可以随后用第二基因转化，随后选择表达高水平的第二基因的细胞。还可以采用该策略首先转化第二基因并且最后转化第一基因。在涵盖编码包括一个或多个液泡靶向序列的多肽的基因的实施方案中，所述液泡靶向序列优选地融合到目的蛋白的N-末端部分。然而，本领域技术人员将理解，鉴于本文所阐述的公开内容，即一个或多个液泡靶向序列可以融合到目的蛋白的不同位置，包括，但不限于，所述蛋白的C-末端，以及插入该蛋白的非末端部分。本领域技术人员将理解如何评价所获得的融合蛋白并确定任何该融合蛋白的完整性、活性和有用性。此类融合蛋白可以按原样使用，或进一步加工可用于从蛋白除去液泡靶向序列的一部分或全部。此类序列的去除可以故意进行，可以天然存在于细胞内，或可以通过两种方法的组合发生。本领域技术人员将理解如何从根据本公开制成的任何融合蛋白去除这样的序列。

另一个策略采用第一和第二基因两者单次转化（或导入）到植物中。第一和第二基因可以在单个载体或在两个分开的载体中转导。

然后选择以高水平表达两个基因的细胞，随后将该植物细胞再生成植株。

另一个策略采用将两种基因分开转化（导入）到两个不同的植物细胞集合中，随后将两个植物细胞集合再生成植株。这些转基因植物，然后彼此异花授粉以产生包含这两个基因的转基因植物。

根据另一个方面，本文涵盖的是携带本文涵盖的基因构建体的植物表达载体。本文包括的基因构建体包括多核苷酸，其增强生物燃料合成前体的含量。本文涵盖的基因构建体可以进一步包括编码水解酶、酰基转移酶和转录因子，例如月桂基-酰基载体蛋白硫酯酶、酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶、Sn-2酰基转移酶和LEC2的多核苷酸。调节控制元件可操作地连接到编码水解酶、酰基转移酶和转录因子基因的多聚核苷酸。调节控制元件的功能，通过示例的方式而不是限制，包括：避免基于同源性的基因沉默，增加水解酶、酰基转移酶和转录因子的基因表达水平，并诱导区室特异性积累等。

在一个实施方案中，调节控制元件可操作地连接到编码细菌SI、细菌pal、细菌pal I、如图1中所述序列、淀粉酶或抑制淀粉合成的多肽的多核苷酸。在另一个实施方案中，调节控制元件可操作地连接编码水解酶、酰基转移酶和转录因子，例如月桂基-酰基载体蛋白硫酯酶、酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶、Sn-2酰基转移酶和LEC2的多核苷酸。在一个实施方案中，调节控制元件包括翻译苜蓿花叶病毒的非翻译前导序列AMV活化因子、ER滞留信号KDEL或两者。

表达载体在本文中定义为在适当的宿主中，基因克隆拷贝的转录和它们的mRNA的翻译所需的DNA序列。这样的表达载体用于在植物中表达真核和原核基因。表达载体包括，但不限于，克隆载体、修饰的克隆载体，具体是，设计的质粒或病毒。

根据一个实施方案，提供了涵盖本文包括的一种或多种基因构建体的植物表达载体。本文涵盖的植物表达载体包含必要的元件，以完成植物的基因转化，使得该基因构建体以稳定的方式导入植物的遗传物质中，即，将允许该基因被传递到植物的子代的方式。表达载体的设计和构建影响基因构建体整合入植物基因组和基因被植物细胞表达的能力。

本文还包括的是根据本文涵盖的教导，从转化的植物制造生物燃料的方法。为了制造生物燃料，油可以从这些植物中提取，并可以被转化为生物燃料。独立于植物的种类，有几种方法用于从绿色生物量中提取油。一种方法是物理提取，这往往不使用溶剂萃取。它是使用几种不同类型的机械提取的“传统”的方式。榨油机压榨提取是常见的类型，如螺旋压榨机和冲压机提取方法。使用这些方法提取的油量变化很大，取决于植物材料和所采用的机械方法。机械提取通常比下面描述的溶剂萃取效率更低。

在溶剂萃取中，有机溶剂（如己烷）与至少所述基因修饰的植物的绿色生物量混合，优选在绿色生物量进行干燥并研磨后。当然，除了绿色生物量之外的植物的其他部分（例如，含油种子）也可以被研磨和混合入。溶剂溶解生物量中的油等，其中溶液然后通过机械作用（例如，用上述压榨方法）从生物量中分离。此分离步骤也可通过过滤进行（例如，使用压滤机或类似装置）或离心等。有机溶剂然后可以从油中（例如，通过蒸馏）分离。此第二分离步骤从植物获得油，并且可以获得可重复使用的溶剂，如果采用常规的蒸汽回收。

在一些实施方案中，生物柴油油可以从来自植物提取的油制成，所述植物根据本文涵盖的公开内容转化。生物柴油油目前从大豆种子按照严格的联邦规范（ASTM D6751）生产。通常，生物柴油通过酯基转移反应制成，其中植物油在氢氧化钠存在下与甲醇反应。该过程导致生产两种产品-甲基酯（化学名称为生物柴油）和甘油（有价值的副产品，通常销售用于肥皂和其它产品）。这样的常规方法可以适应于从烟草绿色生物量（或来自根据本公开转化的其它植物的其它绿色生物量）生产生物燃料的油。在被称为“碱炼”（Ericson, 1995）的得到确认的工业方法中，在进行酯交换步骤之前，将腐蚀性化合物和水添加到油。

对于根据本文涵盖的公开内容转化的植物，专门设计的表达载体可以允许DNA在宿主之间，例如细菌和植物细胞之间穿梭。根据一个实施方案中，所述表达载体包含用于在宿主细胞中自主复制的复制起始点、可选择标记物、有限数量的可用的限制性内切酶位点、一个或多个有活性的启动子以及额外的调节控制序列。

表达载体中优选的，在某些实施方案中，是那些包含可操作地连接到本文涵盖的待表达的多核苷酸的对于在宿主中表达有效的顺式作用控制区域的表达载体。适当的反式作用因子由宿主提供，通过互补载体提供，或在导入宿主后通过载体自身提供。

在这方面，在某些优选的实施方案中，表达载体提供用于特异性表达。这些特异性表达是可诱导的表达、细胞或器官特异性表达、宿主特异性表达或其组合。

在一个实施方案中，所述植物表达载体是基于农杆菌的表达载体。本领域已知各种方法以实现植物和植物组织的遗传转化，通过利用农杆菌介导的转化系统，即根癌农杆菌（A. tumefacien）和发根农杆菌（A. rhizogenesis）。农杆菌是冠瘿的病原体，冠瘿是双子叶植物和裸子植物的广泛的疾病，其在植物组织中在感染部位导致肿瘤或瘿的形成。农杆菌，通常在伤口部位感染植物，携带大的染色体外元件，称为Ti（肿瘤诱导）质粒。

Ti质粒包含对于肿瘤诱导所需的两个区域。一个区域是T-DNA（转移的DNA），其是最终被发现稳定转移到植物基因组DNA的DNA序列。另一区域是vir（毒力）区域，其涉及转移机制。虽然vir区对于稳定转化是绝对需要的，vir DNA实际上并不转移到受感染的植物。通过根癌农杆菌感染和单独的T-DNA的后续转移介导的植物细胞的转化已经有据可查。参见，即Bevan等，(1982) Int. Rev. Genet. 16:357，通过引用以其整体并入本文。

发根农杆菌也被用作用于植物转化的载体。这种细菌，在许多双子叶植物中刺激根毛的形成，携带大的染色体外元件称为Ri（根诱导）质粒，其以类似于根癌农杆菌的Ti质粒的方式发挥功能。使用发根农杆菌的转化已类似于根癌农杆菌的转化得到开发，并已成功用于转化本文所包括的植物。

农杆菌系统已被开发，以允许多种植物组织的常规转化。通过这种技术转化的代表性的组织包括，但不限于，烟草、番茄、向日葵、棉花、油菜籽、马铃薯、杨树、大豆等。这种技术可以用来修饰本说明书中早先所述具有绿色生物量的其它植物。

启动子负责调节DNA转录成mRNA。许多在植物细胞中发挥功能的启动子是本领域已知的，并且可以在如上述的本发明的实践中采用。这些启动子从各种来源获得，如，例如，植物或植物病毒，细菌等。

本文涵盖使用组成型启动子，诱导型启动子，或两者兼而有之。一般情况下，“诱导型启动子”是这样的启动子，其能够直接或间接激活一种或多种DNA序列或响应于诱导剂如化学试剂（如四环素，乙醇或植物激素）的基因的转录。在不存在诱导物的情况下，DNA序列或基因将不被转录。典型的蛋白因子，其特异性结合诱导型启动子以激活转录，以无活性形式存在，其然后通过诱导物直接或间接地转化为活性形式。诱导型启动子可以选自化学诱导型启动子，例如四环素诱导型启动子、乙醇诱导型启动子，以及激素诱导型启动子。

诱导型启动子也可以选自生理诱导型启动子，例如热诱导型启动子、伤口诱导型启动子、衰老诱导型启动子以及成熟诱导型启动子。

诱导型启动子使用本领域已知的任何方法确定。例如，该启动子可以可操作地与可测定的标记基因，如GUS（葡萄糖醛酸酶）连接，宿主可以用构建体改造；并且启动子在收获的组织中驱动标记基因的表达的能力和活性在各种条件下测定。

包含诱导型启动子的植物细胞通过外部施加诱导物到细胞或植物，例如通过喷洒、收获、浇水、加热或类似的方法暴露于诱导物。此外，诱导型启动子包括组织特异性启动子，其以组织特异性方式发挥功能以调节植物选定组织内目的基因的表达。这些组织特异性启动子的实例包括种子、花或根特异性启动子，是本领域熟知的启动子。

“组成型启动子”是指导基因在植物各个部分表达和在整个植物发育期间连续表达的启动子。

在一个实施方案中，启动子是组织特异性的。然而，非组织特异性启动子（即，那些诱导后在所有组织中表达的启动子）是优选的。更优选的是在非诱导状态下额外不具有或具有很低活性的启动子。更优选的是在诱导后额外具有非常高的活性的启动子。诱导型启动子中特别优选的是那些可通过易于操作的环境因素诱导以表达蛋白的启动子。

在一个实施方案中，一个或多个组成型启动子用于调节植物中基因的表达。

诱导型和/或组成型启动子的实例包括，但不限于，分离自花椰菜花叶病毒组（caulimovirus group）的启动子，例如花椰菜花叶病毒（cauliflower mosaic virus）35S启动子（ CaMV35S）、增强型花椰菜花叶病毒35S启动子（ enhCaMV35S）、玄参花叶病毒全长转录物启动子（FMV35S ）、分离自下列的启动子：叶绿素a/b结合蛋白、蛋白酶抑制剂（PI-I，PI-II）、防御应答基因、植物抗毒素生物合成、苯丙素类（phenylpropanoid）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、查耳酮合酶（ CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、白藜芦醇（芪）合酶、异黄酮还原酶（IFR）、萜类植物抗毒素、HMG辅酶A还原酶（HMG）、蓖麻烯合成酶（casbene synthetase）、细胞壁组分、木质素、苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脱氢酶（CAD）、咖啡酸O-甲基转移酶、木质素形成过氧化物酶、富含羟基脯氨酸的糖蛋白（HRGP）、富含甘氨酸的蛋白（GRP）、硫堇、水解酶、裂解酶、几丁质酶（PR-P，PR-Q）、I类几丁质酶、碱性的I类和II几丁质酶、酸性的Ⅱ类几丁质酶、双功能溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、拟南芥β-果糖苷酶、超氧化物歧化酶（SOD）、脂氧合酶、prot.、PR1家族、PR2、PR3、逆渗透蛋白（osmotin）、PR5、泛素、伤口诱导型基因、win1、win2（hevein样）、wun1、wun2、一氧化氮合酶、胭脂碱合成酶、ACC合成酶、HMG辅酶A还原酶hmgl、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶、HSP7033、水杨酸诱导型酸过氧化物酶、PR-蛋白、富含甘氨酸的蛋白质、茉莉酸甲酯诱导型vspB.sup.42、热休克基因、HSP70、冷胁迫诱导型、干旱，盐胁迫，激素诱导型赤霉素、α-淀粉酶、脱落酸、EM-1、RAB、LEA基因、乙烯、植物抗毒素生物合成基因或其组合。

上面提到的启动子仅通过许多可商购获得的和熟知的植物启动子的举例说明的方式列举，其对于本领域技术人员按照本公开的这一方面使用是可获得的。将理解，适合于例如，本文涵盖的公开内容的多核苷酸或多肽在植物中诱导、维持、繁殖或表达的任何其它植物启动子可以在本文涵盖的公开内容的这一方面中使用。

在另一个实施方案中，所述启动子是选自下组的启动子，其在整个绿色植物组织中尤其是叶子和茎中引导组成型基因表达。此组示例为植物病毒起源的强启动子，如来自花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子、木薯叶脉花叶病毒（CsVMV）启动子、甘蔗杆状病毒（ScBV）启动子，或类似的植物病毒启动子（Samac D A, Tesfaye M, Dornbusch M, Saruul P, Temple S J.  Transgenic Res. 2004 August; 13(4):349-61）。除了这些植物，启动子还可以是小亚基核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）的启动子，其驱动以光应答和昼夜方式的转基因（Tung S A, Smeeton R, White C A, Black C R, Taylor I B, Hilton H W, Thompson A J.  Plant Cell Environ. 2008 Apr. 23）。这些启动子还可以选自组蛋白基因启动子，例如H2B启动子（Rasco-Gaunt S, Liu D, Li C P, Doherty A, Hagemann K, Riley A, Thompson T, Brunkan C, Mitchell M, Lowe K, Krebbers E, Lazzeri P, Jayne S, Rice D.  Plant Cell Rep. 2003 February; 21(6):569-760）；另外，这样的启动子可以选自烟草eLF4A-10启动子（Tian L, Wu K, Hannam C, Latoszek-Green M, Sibbald S, Hu M, Brown D C, Mild B.  J Plant Physiol. 2005 December; 162(12):1355-66）或烟草隐蔽的组成型启动子tCUP（Foster E, Hattori J, Labbe H, Ouellet T, Fobert P R, James L E, Iyer V N, Mild B L.  Plant Mol Biol. 1999 September; 41(1):45-55）。另一个这种启动子是ibAGP1启动子（Kwak M S, Oh M J, Lee S W, Shin J S, Paek K H, Bae J M. A strong constitutive gene expression system derived from ibAGP1 promoter and its transit peptide. Plant Cell Rep. 2007 August; 26(8):1253-62）或控制来自绿豆的VR-ACS1的表达的启动子（Cazzonelli C I, McCallum E J, Lee R, Botella J R.  Transgenic Res. 2005 December; 14(6):941-67）。另一个这样的启动子是泛素启动子（Belknap W, Rockhold D, McCue K.  Biotechniques. 2008 May; 44(6):753-6）。

影响异源基因调控的核苷酸序列的实例包括增强子或活化区域，例如那些衍生自CaMV 35S启动、冠瘿碱合成基因或其它植物基因的启动子（U.S. Pat. Nos. 5,106,739; 5,322,938; 5,710,267; 5,268,526; 5,290,294）。在光合作用组织中有活性的启动子在绿色组织例如叶子和茎中赋予转录。最合适的是驱动只有或主要在这样的组织中表达的启动子。这类启动子的实例包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（RbcS）启动子，例如来自落叶松（Larix laricina）的RbcS启动子、松树cab6启动子（Yamamoto 等, Plant Cell Physiol., 35:773-778 (1994))、来自小麦的Cab-1启动子（Fejes 等, Plant Mol. Biol., 15:921-932 (1990)）、来自菠菜的CAB-1启动子（Lubberstedt 等, Plant Physiol., 104:997-1006 (1994)），来自水稻的cab1R启动子（Luan 等, Plant Cell, 4:971-981 (1992)），来自玉米的丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）启动子（Matsuoka等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9586-9596 (1993)）、烟草 Lhcb1*2启动子（Cerdan 等, Plant Mol. Biol., 33:245-255 (1997)）、拟南芥SUC2蔗糖-H+共转运蛋白启动子（Truemit等, Planta, 196:564-570 (1995)），以及来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子（psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS）。

影响异源基因调节的核苷酸序列的额外的实例包括，例如，WRKY序列。已经研究了两种WRKY转录因子基因：WRKY53在控制叶片衰老中发挥重要作用（Hinderhofer 等, "Identification of a Transcription Factor Specifically Expressed at the Onset of Leaf Senescence," Planta 213:469-473 (2001)；Miao 等, "Targets of the WRKY53 Transcription Factor and Its Role During Leaf Senescence in Arabidopsis," Plant Mol Biol 55:853-867 (2004)；Robatzek 等, "Targets of AtWRKY6 Regulation During Plant Senescence and Pathogen Defense," Genes Dev 16:1139-1149 (2002)），而抑制WRKY6表达对叶片衰老的无论发生或进展的影响不大（Hinderhofer 等, "Identification of a Transcription Factor Specifically Expressed at the Onset of Leaf Senescence," Planta 213:469-473 (2001)；Miao 等, "Targets of the WRKY53 Transcription Factor and Its Role During Leaf Senescence in Arabidopsis," Plant Mol Biol 55:853-867 (2004)；Robatzek 等, "Targets of AtWRKY6 Regulation During Plant Senescence and Pathogen Defense," Genes Dev 16:1139-1149 (2002)） 。

本文涵盖的公开内容的基因构建体还可以包括其它任选的调节元件，其调节以及造成表达。通常这样的调节控制元件通过控制转录来运行。这样的调节控制元件的实例包括，例如，增强子（如可能需要的翻译或转录增强子）、阻遏物结合位点、终止子、前导序列等。

这些元件的具体实例包括，但不限于，35S调节区域的增强子区域，以及从其它调节区域中获得的其它增强子，和/或ATG起始密码子和相邻序列。起始密码子必须与编码序列的阅读框同相，以确保整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子来自天然的和合成的各种来源。翻译起始区从转录起始区的来源，或从结构基因提供。该序列还衍生自选择以表达基因的启动子，并可以特异性修饰以增加mRNA的翻译。

非翻译前导序列衍生自任何适当的来源并且被特异性修饰以增加mRNA的翻译。在一个实施方案中，5'非翻译区是从选择以表达基因、基因的天然前导序列、待表达的编码区、病毒RNA、合适的真核基因或合成的基因序列等的启动子获得。在另一个实施方案中，本文涵盖的公开内容的基因构建体包括3U非翻译区。3U的非翻译区指包括含有多聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号的DNA区段的基因部分。多聚腺苷酸化信号通常表征为影响多聚腺苷酸轨向mRNA前体的3U末端的添加。

终止区或3'非翻译区用来引起转录终止和多聚腺苷酸化的核糖核苷酸向转录的mRNA序列的3'末端添加。终止区可以是天然的与启动子区域一起，天然的与结构基因一起，或者可以衍生自表达载体或另一来源，并且将优选地包括终止子和编码多聚腺苷酸化的序列。所述嵌合植物基因的合适的3'非翻译区包括，但不限于：（1）3'转录的非翻译区，包含农杆菌肿瘤诱导（Ti）质粒基因，如胭脂碱合酶（NOS）基因的多聚腺苷酸化信号，和（2）植物基因如大豆7S贮藏蛋白基因和豌豆核酮糖1,5-二磷酸羧化酶的小亚基等。

适当内含子的添加和/或编码序列的修饰以提高翻译也可以大幅度提高外源基因的表达。合适的内含子包括，但不限于，玉米HSP70内含子、玉米乙醇脱氢酶1内含子，和水稻肌动蛋白内含子。

在一个实施方案中，本文涵盖的公开内容的调节控制元件包括苜蓿花叶病毒的非翻译前导序列和Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）内质网滞留信号，其可操作地分别连接到重链的N-和C-末端。

已经显示，在至少一种蛋白的羧基末端包含KDEL或HDEL氨基酸序列通过植物内质网滞留的机制增强了对该蛋白的识别。参见Munro and Pelham (1987) Cell 48:988-997; Denecke等(1991) EMBO-J: 11:2345; Herman等(1991) Planta 182:305; 和Wandelt等(1992) The Plant Journal 2:181，其每个都通过引用整体并入本文。

为了帮助鉴定转化的植物细胞，本文所涵盖的公开内容的基因构建体可以进一步被操纵以包括可选择的标记基因，其在细菌、植物或两者中是有功能的。有用的可选择的标记物包括，但不限于，提供对抗生素的抗性的酶如氨苄青霉素抗性基因（Amp^r）、四环素抗性基因（Tc^r）、放线菌酮抗性L41基因、对抗生素G418赋予抗性的基因如衍生自细菌转座子Tn903的APT基因、抗生素潮霉素B抗性基因、庆大霉素抗性基因和/或卡那霉素抗性基因等，或除草剂，如草铵膦（phosphinotricine）。类似地，可以是提供用于生产可通过颜色变化识别的化合物（如GUS）或发光物（如荧光素酶）的酶。

可选择的标记基因可用于选择在本文涵盖的公开内容的转基因植物细胞，其中转基因细胞已将本公开的基因构建体的一个或多个拷贝整合于其中。可选择的或可筛选的基因提供了对携带目的基因的细胞的成功培养的另一种检查。转化的植物的愈伤组织可通过在包含例如，卡那霉素的培养基上培养细胞进行选择。

宿主植物进行遗传转化以包含本文涵盖的公开内容的一个或多个基因构建体。有很多因素影响植物转化的成功。表达载体的设计和构建影响外源基因整合入宿主植物基因组和外源基因被植物细胞表达的能力。基因构建体引入到其中的细胞的类型必须，如果整个植物都被恢复，是在适当的再生方案下适合于再生的类型。

编码所需基因的多核苷酸到植物宿主中的整合是通过涉及，例如，插入或置换方法的策略来实现。这些方法涉及利用，例如，直接末端重复、反向末端重复、双表达盒敲入、特定基因敲入、特定基因敲除、随机化学诱变、经由转座子的随机诱变等策略。该表达载体，例如，侧翼具有任何非必需的植物基因、细菌基因、转座子序列或核糖体基因的同源序列。优选侧翼序列是T-DNA末端重复序列。DNA然后使用标准技术通过在侧翼序列中发生的同源重组整合到宿主中。

在一个实施方案中，采用基于土壤杆菌的转化策略将所述基因构建体导入植物。这些转化优选使用二元农杆菌T-DNA载体（Bevan (1984) supra）和共培养方法（Horsch 等 (1985) Science 227:1229-1231，通过引用以其整体并入本文）。通常，土壤杆菌转化系统用于改造双子叶植物。农杆菌转化系统也可用于转化，以及转移DNA到单子叶植物和植物细胞。参见，例如Hernalsteen等 (1984) EMBO J. 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren等(1984) Nature 311:763-764; Grimsley等(1987) Nature 325:1677-179; Boulton等(1989) Plant Mol. Biol. 12:3140.; Gould 等 (1991) Plant Physiol. 95:426-434，其每个通过引用整体并入本文。

在其它实施方案中，也利用用于将重组核酸构建体导入植物和植物细胞的各种替代方法。其中目标是单子叶植物或植物细胞时，这些其它的方法是特别有用的。替代性的基因转移和转化方法包括，但不限于通过钙-聚乙二醇（PEG）或电穿孔介导的裸DNA的吸收的原生质体转化。参见例如Paszkowski等(1984) EMBO J. 3:2717-2722, Potrykus等(1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm等(1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828;和Shimamoto (1989) Nature 338:274-276，其每个通过引用以其整体并入本文。植物组织的电转化也公开于D'Halluin 等(1992) Plant Cell 4:1495-1505，通过引用以其整体并入本文。用于植物细胞转化的额外的方法包括微注射、碳化硅介导的DNA吸收(参见，例如Kaeppler等(1990) Plant Cell Reporter 9:415-418)和基因枪法(参见，例如Klein等(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; Gordon-Kamm等(1990) Plant Cell 2:603-618，其每个通过引用以其整体并入本文）。

在直接基因转移的情况下，所述基因构建体不使用土壤杆菌质粒转化到植物组织中。直接转化涉及外源遗传物质到植物细胞或原生质体的吸收。这种吸收可以通过使用化学试剂或电场增强。外源性材料可随后被整合到核基因组中。

在红花烟草（烟草）中原处进行直接转移的早期工作表明，外源DNA掺入并传递给子代植物。几种单子叶植物原生质体也通过此程序被转化，包括玉米和水稻。

脂质体融合也已被证明是用于转化植物细胞的方法。原生质体与携带所需基因的脂质体汇聚在一起。当膜融合时，外源基因转移到原生质体中。

可替代地，外源DNA可以通过微注射导入细胞或原生质体。在这种技术中，质粒DNA或DNA片段的溶液用细拉玻璃针直接注射入细胞。

用于直接基因转移的新近开发的方法涉及通过携带DNA的微弹轰击细胞。在此方法中，通常被称为粒子轰击，包被有外源DNA的钨或金粒子向靶细胞加速。粒子携带包被的DNA与它们穿透细胞。微粒加速已经成功地证明在培养中悬浮的细胞中，原生质体中，植物包括但不限于洋葱、玉米、大豆和烟草的未成熟胚中导致瞬时表达和稳定表达。

除了上述的方法，本领域已知大量的方法用于将克隆的DNA转移到广泛的植物物种中，包括裸子植物、被子植物、单子叶植物和双子叶植物。微小的变化使这些技术可应用于广泛的植物物种。

本文涵盖的公开内容进一步涉及转基因植物，包括整个植物、植物器官（即叶、茎、花、根等）、种子和植物细胞（包括组织培养细胞）及其用根据本文涵盖的公开内容的基因构建体转化的后代。

一旦植物细胞已被转化，有多种方法用于再生植物。再生的具体方法将取决于起始植物组织和待再生的具体植物物种。通常，转化的植物细胞培养在合适的培养基中，其包含选择剂诸如，如，抗生素，其中选择性标记物用来促进转化的植物细胞的鉴定。一旦愈伤组织形成，胚胎或芽的形成根据已知的方法通过使用合适的植物激素激励，并将芽转移至生根培养基用于植物再生。植物然后用于从种子或使用无性繁殖技术建立重复世代。所需的基因或基因产物在转化植物中的存在可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来确定。包含在这些方法中的是Southern、Northern和Western印迹技术，ELISA和生物测定。

在最近几年，从植物外植体衍生的愈伤组织再生许多植物种已成为可能。可以从愈伤组织再生的植物包括单子叶植物，例如，但不限于，玉米、水稻、大麦、小麦和黑麦，以及双子叶植物，例如，但不限于，向日葵、大豆、棉花、油菜籽和烟草。

向日葵是另一种植物，其可以与本文涵盖的公开内容的教导相一致进行修饰。向日葵是用于生产植物种子油的主要作物之一。不同于其他产油作物如大豆和油菜籽，向日葵，由于其大尺寸，还可以生成大量的绿色生物量。类似烟草，向日葵拥有强力的种子生物燃料合成途径，其可以使用本文涵盖的公开内容的基因修饰技术使用相同种类的基因修饰进行修饰并重新定位到绿色生物量。至少已开发了两种方案用于向日葵的农杆菌介导的转化，其还可以用来修饰向日葵，以包括与本公开一致的新的遗传修饰：(1) Weber S, Friedt W, Landes N, Molinier J, Himber C, Rousselin P, Hahne G, Horn R. Improved Agrobacterium-mediated transformation of sunflower (Helianthus annuus L.): assessment of macerating enzymes and sonication. Plant Cell Rep. 2003 January; 21(5):475-82. 2; 和(2) Muller A, Iser M, Hess D., Stable transformation of sunflower (Helianthus annuus L.) using a non-meristematic regeneration protocol and green fluorescent protein as a vital marker. Transgenic Res. 2001 October; 10(5):435-44。

工业大麻是另一种植物，其可以与本文涵盖的公开内容的教导相一致进行修饰。其可以在世界的很多区域中生长。在欧洲和加拿大，其已传统上被用作能源植物。例如，大麻（Cannabis sativa），俗称“大麻（hemp）”包括在1999年12月加州能源委员会的报告“Evaluation Of Biomass-To-Ethanol Fuel Potential In California”iv-3]中被认为是候选能源作物的潜在大田作物列表中。可以通过根癌农杆菌进行与本公开的教导一致的大麻的遗传转化[Feeney M., Punja Z. K. Hemp (Cannabis sativa L.). In: Methods Mol Biol 2006; 344:373-82]。

玉米是另一种植物，其可以与本文涵盖的公开内容的教导相一致进行转化。来自根据本发明修饰的玉米植株的玉米绿色生物量中积累的油的提取可以改善油生产的效率。用于玉米的基因转化的方法已经确立(Ishida Y, Hiei Y, Komari; Nat Protoc. 2007; 2(7):1614-1621)。可以采用这些相同的方法以制造本文涵盖的公开内容的新的基因修饰。

柳枝稷是另一种植物，其可以修饰以包含本文涵盖的公开内容的新的基因修饰。未修饰的柳枝稷是在美国能源署考虑下的主要能源植物的候选。已知大量的研究使用柳枝稷用于乙醇生产，但是在使用本文涵盖的公开内容的方法改善在柳枝稷中油含量之后，油和乙醇利用均是可能的。经由农杆菌的转化也是可以利用的[Somleva M. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.). In: Methods Mol Biol. 2006; 344:65-73]。

鸭杂草（浮萍属）水生植物浮萍具有独特、固有的特性，其为生物量生产提供巨大的价值，使得它可以被修饰以包括本文涵盖的公开内容的新的基因修饰。其优点包括：通用性、快速和灵活的操作、对设备的低资本成本、低运营成本和环境安全性。作为绿色植物，其具有油生产的类似途径，并且其油含量可以使用本文涵盖的公开内容的技术加以改进。开发了浮萍的农杆菌介导的转化[Yamamoto Y. T.等 In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 2001; 37:349-353]。

甘蔗、高粱和糖用甜菜已经用作用于生物乙醇的来源；[Hill. J.,等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103:11206-11210]，但基因修饰这些植物以包含本文涵盖的公开内容的新的基因修饰，以增加这些植物的绿色生物量中的油，可以增加总的能量效率。基于本文涵盖的公开内容进行它们的基因修饰后，从甘蔗、高粱和甜菜的油生产可以是经济可行的。描述了对于甘蔗[Shrawat A. K., Lorz H.  Plant Biotechnol J. 2006, 4(6): 575-603. Review]和糖甜菜[Golovko A. E., Dovzhenko A. A., Gleba Yu. Yu.  Tsitol Genet. 2005, 39(3): 30-6. Review.]的遗传转化。已建立了用于高粱的遗传转化的几种技术（Casas A M, Kononowicz A K, Zehr U B, Tomes D T, Axtell J D, Butler L G, Bressan R A, Hasegawa P M.;  Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Dec. 1; 90(23):11212-6. 2: Zhao Z Y, Cai T, Tagliani L, Miller M, Wang N, Pang H, Rudert M, Schroeder S, Hondred D, Seltzer J, Pierce D.;  Plant Mol Biol. 2000 December; 44(6):789-98. 3: Gao Z, Xie X, Ling Y, Muthukrishnan S, Liang G H.;  Plant Biotechnol J. 2005 November; 3(6):591-9）。

可以理解，多肽经常含有通常被称为“天然存在的”氨基酸的20种氨基酸之外的氨基酸，并且许多氨基酸，包括末端氨基酸，可以在给定的多肽中修饰，或者通过天然过程，如加工和其它翻译后修饰，或者通过化学修饰技术。

修饰可以发生在多肽的任何地方，包括肽骨架，氨基酸侧链和氨基或羧基末端。多肽中氨基或羧基基团或两者通过共价修饰的封闭，发生在天然或合成的多肽中。这些修饰也可以存在于本公开的多肽中。通常，修饰的性质和程度由宿主细胞的翻译后修饰能力和存在于所述多肽的氨基酸序列中的修饰信号确定。可以理解，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于多肽中的几个位点。

多肽的结构中的变化可以作为等位基因变异自然发生，如上文所述，例如由于遗传多态性，或者可通过人为干预（即，通过克隆的DNA序列的突变）产生，例如诱导的点、缺失、插入和取代突变体。在氨基酸序列中微小的变化通常是优选的，例如保守氨基酸替换、小的内部缺失或插入，以及在分子末端的添加或缺失。

可以基于例如，Dayhoff等（1978）Atlas of Protein Sequence and Structure, Natl. Biomed. Res. Found. Washington, D.C.的模型设计取代 。这些修饰可以导致氨基酸序列中的变化，提供沉默突变，修饰限制性位点，或提供其它特异性突变。

本公开还涵盖包括对应和编码本公开的基因的多核苷酸的植物。核酸序列使用本领域熟知的自动系统合成或衍生自基因库。

可以理解，对DNA和RNA已经进行了多种多样的修改，其满足了本领域技术人员已知的很多有用的目的。本文涵盖的公开内容的多核苷酸包括多核苷酸的化学、酶学或代谢修饰的形式。

本文涵盖的多核苷酸编码，例如，结构基因的编码序列，以及额外的编码或非编码序列。额外的编码序列的实例包括，但不限于，编码分泌序列的序列，如前-、原-或前原-蛋白序列。额外的非编码序列的实例包括，但不限于内含子和非编码5'和3'序列，如转录的，非翻译序列，其在转录和mRNA加工中发挥作用，包括剪接和多聚腺苷酸化信号，例如，用于核糖体结合和mRNA的稳定性。

本文涵盖的多核苷酸还编码多肽，其是成熟蛋白加上额外的氨基或羧基末端氨基酸，或成熟多肽内的氨基酸（例如当成熟形式具有一个以上多肽链时）。这些序列在，例如，蛋白从前体到成熟形式的加工中发挥作用，可以促进蛋白运输，延长或缩短蛋白半衰期或有利于蛋白检测或生产的操作等。额外的氨基酸可以通过细胞酶从成熟蛋白上加工掉。

总之，本文涵盖的多核苷酸编码，例如，成熟蛋白、成熟蛋白加前导序列（其可称为前蛋白）、具有一个或多个非前蛋白前导序列的原序列（prosequence）的成熟蛋白的前体或前原蛋白（preproprotein）（其是原蛋白的前体，具有前导序列和一个或多个原序列，其通常是在加工步骤过程中去除从而产生有活性和成熟形式的多肽）。

本文涵盖的多核苷酸包括如本文所用术语多核苷酸或多肽的一个或多个“变体”。变体包括核苷酸序列与另一个参考多核苷酸不同的多核苷酸。一般地，差异是有限的，从而参考和变体的核苷酸序列总体上密切相似，而且在许多区域中是相同的。如下文所指出的，变体的核苷酸序列中的变化可以是沉默的。即，它们可以不改变由多核苷酸编码的氨基酸序列。当改变限于此类沉默变化时，变体将编码与参考具有相同氨基酸序列的多肽。

变体的核苷酸序列中的变化可以改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。这样的核苷酸变化可以导致在由参考序列编码的多肽中氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。根据本文涵盖的公开内容的一个实施方案，本文涵盖的公开内容的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列中相比野生型或哺乳动物衍生的肽的氨基酸序列没有改变。

本公开进一步涉及杂交到本文所述序列上的多核苷酸。根据本文涵盖的公开内容的术语“在严格条件下杂交”如通过Sambrook 等(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1.101-1.104所描述的使用。优选地，当用1％SSC和0.1％SDC在50摄氏度，优选在55℃，更优选在62℃，最优选在68℃清洗一小时后，仍然观察到阳性杂交信号，则给出了根据本公开的严格杂交。例如在该清洗条件下与本文所公开的任何序列所示的核苷酸序列或与在遗传密码的退化内其相应的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列是根据本文涵盖的公开内容的核苷酸序列。

本文涵盖的多核苷酸包括与多核苷酸或其转录活性片段具有至少约50%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多核苷酸序列同一性的多核苷酸序列。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，出于最优比较目的比对序列（即，对于与第二核酸序列的最优比对，在第一氨基酸或核酸序列中可以引入缺口）。然后比较在相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被在第二序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置的数目的函数（即，%同一性=相同重叠位置的数目/位置总数目X100）。在一个实施方案中，该两个序列是相同长度的。

两个序列之间的百分比同一性的确定还可以使用数学算法实现。所利用的用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性实例是Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268的算法，如在Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877中所修饰。该算法并入Altschul等(1990), J. Mol. Biol. 215:403-410的NBLAST和XBLAST程序。可以使用NBLAST程序，评分=100，字长=12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本文涵盖的公开内容的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序，评分=50，字长=3进行BLAST蛋白搜索，以获得与本文涵盖的公开内容的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中所述使用缺口BLAST。

可替代地，可以使用PSI-Blast进行迭代搜索，其检测两分子（Id.）之间的远缘关系。当使用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序（即XBLAST和NBLAST程序）的默认参数（参见WWW<dot>NCBI<dot>NLM<dot>NIH<dot>GOV）。用于比较序列的数学算法的另一个优选的、非限制性的实例是Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17的算法。该算法并入ALIGN程序（2.0版本），其是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序用于比较PAM120权重残留表的氨基酸序列时，可以使用12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。在一个可替代的实施方案中，可以使用NA-MULTIPLE-ALIGNMENT 1.0程序，使用5的缺口权重和1的缺口长度权重，获得比对。

本发明将参考下列实施例更详细的进行阐释，但应当理解本发明不视为被其所限制。

实施例

实施例1：植物转化表达盒的构建

用于SI的表达构建体在pUC57中制造。表达载体的组装描绘于图2。pUC57载体是已知的并且可以从 Genscript(GenScript USA Inc. 120 Centennial Ave Piscataway, N.J. Catalog #SD1176-50 ug)获得。为了避免高糖浓度对植物发育的干扰，SI酶的表达靶向液泡。为了在绿色生物量中实现更高水平的糖可利用性，转化蔗糖成其储存异构体异麦芽酮糖的细菌酶SI已在烟草中在两种不同的启动子（CaMV35S和Rubisco (RbcS)）下表达。

实施例2：植物转化

根据描述的方案（Ko等（2000）），烟草叶外植体（Nicotiana tabacum cv. Wisconsin）用于农杆菌介导的转化（根癌农杆菌EHA105），在基于MS的培养基上选择和再生（Hiatt等(1989) Nature 342:76-78）。使用携带例如SI的载体通过农杆菌介导的植物转化生成烟草转基因品系。在包含卡那霉素（100 微克/ml）的MS培养基上选择独立的转基因品系。转基因烟草品系后来保持在土壤中，并随后通过自花授粉获得世代（T1和T2）。

组成型表达，例如，SI的转基因植物可以随后与可诱导地表达，例如，酯酶、硫酯酶、月桂基-酰基载体蛋白硫酯酶、酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶、Sn-2酰基转移酶的转基因植物异花授粉，以产生包含两种基因的转基因植物。

实施例3：转基因植物的分子表征

可以使用每种转基因品系的基因组DNA使用与上述相同的引物进行表达的基因的PCR扩增。在用在CaMV 35S（33个品系）和Rubisco（25个品系）启动子的控制下的靶向液泡的SI基因的遗传转化后已产生58个转基因烟草品品系。通过PCR已证实20个来自每种转化（CaMV 35S-SI和Rubisco-SI）的品系包含SI基因，PCR分析的实例表示在图4中，其显示在转化的烟草中诱导的SI基因的PCR分析。最好的表达品系已被选择用于进一步生长和种子生产 。

实施例4：SDS-PAGE和蛋白印迹分析

一克烟草叶组织在液氮中与包含蛋白酶“完全”抑制剂混合物（cocktail）（Roche, Indianapolis, Ind.）的100微升提取缓冲液（50 mM Tris, pH 7.5, 250 mM蔗糖）一起研磨。40μg可溶性蛋白（10μl）通过12%SDS-PAGE解析并根据制造商的推荐使用mini-Protean IITM系统(Bio-Rad Labs, Hercules, Calif.)转移到Immobilon-P转移膜（Millipore Corp., Bedford, Ma.）上。使用与HRP-缀合的第二抗体一起孵育然后用"SuperSignal"化学发光底物（Pierce, Rockford, Ill.）处理检测信号。

实施例5：糖生产的检测和测量

在转基因植物或植物细胞中的糖的量可以通过已知技术确定，例如通过氨基酸和/或糖的提取，随后是气相色谱-质谱（GC-MC）或液相色谱-质谱（LC-MS）。如果需要，可以通过GC-MS、LC-MS、核磁共振和/或其它已知技术验证糖的结构。在糖增强植物中的总糖含量可以通过折射计来进行评价，并且异麦芽酮糖将通过液相层析进行测量。

实施例6：油生产的检测和测量

为了估计在烟草中对脂肪酸生物合成的效果，示例了两种类型的分析。首先，烟草生物量的三酰基甘油酯（TAG）级分可以使用LC-MS检验，其不仅允许相对于在野生型烟草中在转基因品系中TAG的定量，而且允许在个体植物中TAG组成的确定。第二，总脂肪酸酯，其构成在柴油发动机中使用的生物燃料油，可以在提取的脂肪酸与酸性甲醇（Rogozinski，1964）酯化后通过气相色谱（GC）定量。对于这两种测试，脂肪酸可以分离自从3个月大的植物收集的冷冻干燥的样品，使用修饰的正己烷提取或经典的氯仿-甲醇分离（Bligh, Dyer 1959） 。

如本文所讨论，虽然烟草（红花烟草和来自烟草属的其它种）是上述实施例的主题，其它植物可以根据本文涵盖的公开内容的教导进行修饰，使用基于其高生物量生产和/或积累油的能力的相同技术。

所有本文参考的专利和文献在此以其整体并入本文。

本领域技术人员将理解，对于上面所示和描述的示例性实施方案可以进行变化而不偏离其广泛的发明构思。

因此，可以理解，本发明并不限于所示和描述的示例性实施方案，但它目的是覆盖在如权利要求所定义的本发明的精神和范围内的修改。

例如，示例性实施方案的具体特征可以是也可以不是所要求保护的发明的一部分，并且所公开的实施方案的特征可以组合。

除非本文具体提出，术语“一”、“一个”和“该”不局限于一种元素，而应被理解为意指“至少一个” 。

如本文中所使用的术语“约”指一个值，该值是其所指值的+/-10％，除非在任何具体实施方案或实例中另有定义。

通过非限制性实施例的方式，术语“约50％的水”是指范围从45％到55％的水的量。

应当理解的是，至少一些本发明的描述已被简化以集中于那些用于清楚理解本发明相关的元素，同时为清楚起见，消除了那些本领域技术人员将理解也可以包括本发明的一部分的其他元素。

然而，因为这样的元素是本领域熟知的，并且因为它们并不一定利于更好地理解本发明，本文没有提供这些元素的描述。

Claims (43)

1.基因表达盒，相比未修饰的植物，其增强了在植物生物量中生物燃料合成前体的含量，其中所述基因表达盒包括：

a）至少一个转录调节核苷酸序列，其中所述转录调控核苷酸序列是：

     i）组成型启动子；

     ii）诱导型启动子

     iii）组织特异性启动子

     iv）发育调节的启动子

     v）核苷酸序列，其是任何在i）至iv）下先前提及的核苷酸序列的互补物或反向互补物，并且功能性地连接到其上；和

     vi）其组合物，

b）至少一种选自下列的基因：

     i）编码蔗糖异构酶（SI）的基因；

     ii）如图1所述序列；

     iii）编码淀粉酶的基因；

     iv）抑制淀粉合成的基因；

     和

     v）其组合。

2.权利要求1的基因表达盒，其中所述诱导型启动子选自四环素诱导型启动子、乙醇诱导型启动子和激素诱导型启动子。

3.权利要求1的基因表达盒，其中所述转录调控核苷酸序列是选自下列的启动子：CaMV 35S、Rubisco、组蛋白基因启动子、泛素、criptic tCUP、VR-ACS1、CsVMV、ScBV、eLF4A-10和ibAGP1。

4.权利要求1的基因表达盒，其中所述基因表达盒包括至少一种基因，当所述基因表达后增强植物生物量的糖生产。

5.权利要求1的基因表达盒，其中所述基因表达盒包括至少一种基因，当所述基因表达后增强植物生物量的糖含量。

6.权利要求1的基因表达盒，其中所述基因表达盒包括至少一种基因，当所述基因表达后增强植物生物量的糖生产和/或储存，由此增强植物生物量的油含量。

7.权利要求1的基因表达盒，其中所述基因表达盒包括至少一种基因，当所述基因表达后包括至少一种液泡靶向序列。

8.权利要求1的基因表达盒，其中所述至少一种糖增强基因的表达任选地与导入的或天然脂质生物合成基因的表达相一致。

9.权利要求1的基因表达盒，其进一步包括至少一种选自下列的额外的基因：酯酶、硫酯酶、月桂基-酰基载体蛋白硫酯酶、酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶、Sn-2酰基转移酶、Lec2、油质蛋白及其组合。

10.权利要求1的基因表达盒，其中转录调节核苷酸序列和至少一种基因的协同表达导致相比未修饰的植物在修饰的植物生物量中发酵的糖和脂质的升高的积累。

11.包括权利要求1-10任一项的表达盒的载体。

12.基因修饰的植物，其相比未修饰的植物在植物生物量中具有增强的生物燃料前体含量，所述基因修饰的植物包括基因表达盒，其中所述基因表达盒包括：

a）至少一个转录调节核苷酸序列，其中所述转录调控核苷酸序列是：

     i）组成型启动子；

     ii）诱导型启动子

     iii）组织特异性启动子

     iv）发育调节的启动子

     v）核苷酸序列，其是任何在i）至iv）下先前提及的核苷酸序列的互补物或反向互补物，并且功能性地连接到其上；和

     vi）其组合物，

b）至少一种选自下列的基因：

     i）编码SI的基因；

     ii）如图1所述序列；

     iii）编码淀粉酶的基因；

     iv）抑制淀粉合成的基因；

     和

     v）其组合。

13.权利要求12的基因修饰的植物，其中所述至少一种基因表达增强糖含量的多肽。

14.权利要求12的基因修饰的植物，其包括至少一种糖和/或脂质增强基因。

15.权利要求12的基因修饰的植物，其包括至少一种糖增强基因。

16.权利要求12的基因修饰的植物，其中所述糖增强基因的表达任选地与导入的或天然的脂质生物合成基因的表达相一致。

17.权利要求12的基因修饰的植物，其中所述转录调节核苷酸序列和至少一种基因的协同表达导致相比未修饰的植物在修饰的植物生物量中发酵的糖和/或脂质的升高的积累。

18.用于乙醇和/或生物柴油燃料生产的原料，所述原料包括权利要求12的基因修饰的植物。

19.权利要求12的基因修饰的植物，其包括至少一种SI和至少一种淀粉降解酶。

20.权利要求12的基因修饰的植物，其包括至少一种基因，相比未修饰的植物，所述基因的表达改变植物中的代谢流，导致更高产量的糖和脂质的积累。

21.权利要求12的基因修饰的植物的转基因植物产品、繁殖材料、细胞、器官、部分、愈伤组织、细胞培养物、转基因后代的种子。

22.根据权利要求12的基因修饰的植物，其中所述基因修饰的植物选自单子叶植物、双子叶植物、烟草、玉米、豌豆、加拿大低酸油菜（canola）、芥菜、谷子、向日葵、大麻、柳枝稷、浮萍、甘蔗、高粱和甜菜。

23.根据权利要求12的基因修饰的植物，其中所述基因修饰的植物选自烟草、大麻、柳枝稷以及浮萍。

24.基因修饰的植物，其相比未基因修饰的植物具有增加的糖的量，并且其中所述基因修饰的植物包括权利要求1的基因表达盒。

25.基因修饰的植物，其相比未基因修饰的植物具有增加的生物燃料的量，并且其中所述基因修饰的植物包括权利要求1的基因表达盒。

26.改造高生物燃料植物生物量的方法，所述方法使用相比未修饰的植物具有升高的生物燃料合成前体含量的基因修饰的植物作为宿主植物，用于脂质的代谢改造，包括：

a）将权利要求1的基因表达盒导入植物；和

b）选择具有升高的油生物燃料前体含量的转基因植物。

27.产生相比相应的对照植物具有增强的糖含量的基因修饰的植物的方法，

其中所述方法包括步骤：

a）将权利要求1的基因表达盒导入植物；和

b）选择具有增强的糖含量的转基因植物。

28.权利要求27的方法，其中所述生物合成前体是糖。

29.权利要求27的方法，其中所述糖增强基因的表达任选地与导入的或天然的脂质生物合成基因的表达相一致。

30.权利要求27的方法，其进一步包括步骤：

c）至少一种糖增强基因和至少一种脂质增强基因的协同表达，

其中所述协同表达导致相比未修饰的植物在修饰的植物生物量中发酵的糖和脂质的升高的积累。

31.权利要求27的方法，其进一步包括步骤：

c）来自基因表达盒的一种或多种多肽的表达，

其中所述来自基因表达盒的一种或多种多肽的表达增强植物生物量的糖含量。

32.权利要求27的方法，其进一步包括步骤：

c）来自基因表达盒的一种或多种多肽的表达，

其中所述来自基因表达盒的一种或多种多肽的表达增强植物生物量的糖含量，并且任选地，增强植物生物量的油含量。

33.权利要求27的方法，其中所述从基因表达盒表达的一种或多种多肽包括液泡靶向序列，其使多肽靶向植物液泡。

34.权利要求27的方法，其中所述基因修饰的植物选自单子叶植物、双子叶植物、烟草、玉米、豌豆、加拿大低酸油菜、芥菜、谷子、向日葵、大麻、柳枝稷、浮萍、甘蔗、高粱和甜菜。

35.生产生物柴油或生物乙醇的方法，所述方法包括权利要求27的方法，所述方法进一步包括将基因修饰的植物的生物量转化以生产生物柴油或生物乙醇的步骤。

36.生产生物柴油和生物乙醇的方法，其包括：

a）提供包括权利要求1的基因表达盒的基因修饰的植物生物量；

b）转化植物生物量成生物柴油和生物乙醇。

37.权利要求38的方法，其中所述基因修饰的植物生物量选自单子叶植物、双子叶植物、烟草、玉米、豌豆、加拿大低酸油菜、芥菜、谷子、向日葵、大麻、柳枝稷、浮萍、甘蔗、高粱和甜菜。

38.基因表达盒，相比未修饰的植物，其增强了在植物生物量中生物燃料合成前体的含量，其中所述基因表达盒包括：

a）至少一个转录调节核苷酸序列，其中所述转录调控核苷酸序列是：

     i）组成型启动子；

     ii）诱导型启动子

     iii）组织特异性启动子

     iv）发育调节的启动子

     v）核苷酸序列，其是任何在i）至iv）下先前提及的核苷酸序列的互补物或反向互补物，并且功能性地连接到其上；和

     vi）其组合物，

b）至少一个基因，相比未修饰的植物，其增强在植物生物量中的生物燃料合成前体的含量，所述基因选自：

     i）编码SI的基因；

     ii）如图1所述序列；和

     iii）其组合；

其中增强植物生物量中生物燃料合成前体含量的基因包括至少一种液泡靶向序列。

39.权利要求28的基因表达盒，其中所述至少一种液泡靶向序列选自：sporamin蛋白、液泡前肽、大麦液泡巯基蛋白酶液泡前肽、凝集素液泡前肽、烟草几丁质酶液泡前肽、大麦凝集素的C-末端前肽、烟草几丁质酶A的C-末端延伸和N末端马铃薯蛋白酶抑制剂液泡靶向序列。

40.权利要求38的基因表达盒，其中所述至少一种液泡靶向序列包括编码SI的基因。

41.权利要求38的基因表达盒，其中所述至少一种液泡靶向序列包括编码一个SI的基因。

42.生产相比相应的对照植物具有增强的异麦芽酮糖含量的基因修饰的植物的方法，其中所述方法包括步骤：

a）将权利要求38的基因表达盒导入植物；和

b）选择具有增强的异麦芽酮糖含量的转基因植物。

43.基因表达盒，相比未修饰的植物，其增强植物生物量中生物燃料合成前体的含量，其中所述基因表达盒包括至少一种基因，相比未修饰的植物，所述基因增强植物生物量中油生物燃料前体的含量，所述基因选自：

i）编码SI的基因；

ii）如图1所述序列；和

iii）其组合；

其中增强植物生物量中生物燃料合成前体含量的基因包括至少一种液泡靶向序列。