CN1039716C - 通过色谱分离制备(6s)叶酸衍生物的工业方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过在一个色谱柱上，色谱分离两个(6R，S)非对映异构体来制备(6S)叶酸衍生物的工业方法，其中分离剂是在pH为大约5的缓冲溶液中的白蛋白。
Description
本发明涉及一种通过在柱上，用色谱方法分离非对映异构体混合物来制备(6S)叶酸衍生物的工业方法，特别地涉及一种制备这里分别称为“MTHF”和“FTHF”的5-(甲基)-(6S)-四氢叶酸和5-(甲酰)-(6S)-四氢叶酸的工业方法。MTHF和FTHF是生理大分子，它们连同不稳定的6，10-亚甲基-四氢叶酸和四氢叶酸，构成了活体内叶酸的活性形式，通常称为叶酸共因子。
从药物学的观点来看，MTHF和FTHF可用于各种形式的叶酸盐缺乏症，作为通常的肝保护剂，更近一些时期以来，用于抗肿瘤药物。
MTHF和FIHF以及常用的药物学上可接受的衍生物用下式其中：X＝CH3或CHO和R1和R2是H，NH4 +，碱金属和碱土金属，R1和R2可以彼此相同或彼此不同。
具有式(I)的化合物含有两个不对称的碳原子，因此可以四种非对称异构体形式存在。
众所周知，通常当存在立体异构体的药物形式时，它们中只有一种是活性的，另一些则是非活性的，甚至是有害的。在本发明中，众所周知的活性形式是(6S)。
进行了一些研究，涉及工业上制备和/或分离两种非对称异构体，以及直接合成(6S)形式。
由于最终产品的结构脆弱性，立体定向合成MTHF和FTHF的(6S)形式，以及分离两种(6R，S)非对称异构体显露出困难。
在GB-A-1,572,138专利和CH-A-496,012专利中，分别描述了MTHF和FTHF的立体异构混合物的合成。
为了分离如此获得的(6S)非对称异构体，有可能将立体异构体转变为相应的5-甲氧羰基衍生物或者转变成为其它的具有手性中心的衍生物：以这样一种方式，利用在适宜的溶剂中的不同的溶解度，有可能将两种非对映异构体(6R)和(6S)分开(JCS，CHEMCOMM470，1987；EP0266042)。
但是所说的方法有点复杂，而且产率极低。
另一种分离的方法基于，或者(6R，S)混合物(EP0,367,902；WO8808,844)或者它们的中间体(EP348,841)的多重结晶，但产率总是很低。
近来，通过部份结晶和任选地水解或减少5，10-亚甲基-(6R，S)四氢叶酸中间体，获得了MTHF和FTHF的立体异构体混合的的分离(US5006655)。该中间体难于处理，并且使其与有害有毒的溶剂如甲酸相隔离。
一种用于分离(6S)形式的方法公开在PCT/EP88/00341(WO88/08844)上，其中立体异构体混合物的钙盐或镁盐的溶液用一种胺来处理，阳离子盐作为草酸盐发生沉淀，并且通过部份结晶化和再转化成为钙盐或镁盐而得到所要求的产品。
表现的产率相当低，并且该方法涉及几个成盐和结晶步骤。
在一个进一步的分离工艺中，加入外消旋的混合物，如钙盐(EP367,902)，连同一些有机和无机盐，特别是碘化钠，于是获得一种产品，其纯度很高，但是产率又相当差，这从工业的观点来看确实是无意义的。
有关分离FTHF异构体的进一步的方法，参见Choi等人的，Analytical Biochem.Vol.168，pp398-404(1968)，按照Choi等人的文章，使用了牛血清白蛋白〔Bovin Serum Albumin(BAS)〕。与硅胶相混合的柱。
至于洗脱，使用了磷酸盐缓冲液，其pH值在6.4和8.4之间，优选的是7.4。
按照Choi等人的方法所得到的洗脱液，含有极低量的(6S)异构体，仅对分析目的有用。
Choi等人的方法用于工业条件下，由于溶解差，结果进入柱的溶液会停留时间很长：于是工业生产率会很低，因为必需极长时间地使用柱，以获得可接受的分离，或者另一方面，使得溶液在同一柱中经历几个循环，这就导致混合物降解的可能性增加，并且试剂的消耗量很大。
令人惊奇地发现，根据本发明，沿用Choi等人的技术，但是对(6R，S)混合物的洗脱来说，使用pH值范围极窄(在5.0和5.5之间)的缓冲溶液，可获得具有工业产率的(6S)异构体的拆分，成本低廉，步骤简单。
的确，如果使用两个用白蛋白混合硅胶的工业柱，分别按照Choi等人的方法和本发明的方法来拆分(6R，S)混合物，则所获得的(6S)异构体的产率分别是低于5％，和不低于20％。
除了从(6R，S)混合物中分离(6S)异构体的上述方法之外，还努力直接合成(6S)异构体。
按照EP-A-356,984专利，(6S)异构体的合成采用一种方法，基于7，8-二氢叶酸的5-6双键的立体定向氢化作用。
当在NADP的存在下，用二氢叶酸盐(dihydrogolate)还原酶进行所说的氢化作用时，获得很好的转化，但是所说的方法很复杂，从工业的观点上来看，根本没有用。
已尝试了其它种类的立体定向氢化作用，其中使用合适的催化剂，但是结果总是很差。(TETRAHEDRON42，117，1986)
最后，迄今无价廉的方法，可以工业的规模获得MTHF和FTHF的(6S)异构体。至于实用的药物学用途，(6S)MTHF和(6S)FTHF并不用其本身，通常用其钙盐。
按照众所周知的技术，进行这样的转变，例如按照US-A-2,688,018专利所公开的方法，以及Weast所著的“Handbook ofChemistry and Physics”(第57版，B-100页)。
通过一种方法，将(6R，S)MTHF或(6R，S)FTHF的混合物分开成为分别的(6S)异构体，按照该方法，在一个色谱柱中，装入白蛋白水溶液，然后用第一缓冲溶液进行洗涤，装入式(I)的衍生物的非对映异构体混合物的水溶液，然后用第二缓冲溶液进行洗脱，从而得到(6S)非对映异构体，第一次洗脱得到FTHF，以及第二次洗脱得到MTHF，其特征在于它的溶液中的白蛋白的浓度在0.1％(wt)至10％(wt)之间，以及其衍生物溶液的浓度在0.1％(wt)至10％(wt)之间，所说的缓冲溶液的pH值在4.8至5.8之间。
更优选地，白蛋白和非对映异构体混合物的水溶液，用pH值在4.8和5.8之间的缓冲溶液洗涤。
进一步优选地，硅胶的颗粒度在25μm和60μm之间，在35μm-45μm之间较好。
有利的是，所说的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液，其浓度在0.05M和0.15M之间，它的水溶液中的所说的白蛋白的浓度为大约1％(wt)，以及在其溶液中的一种非对映异构体混合物为大约5％(wt)，而白蛋白选自由猪、牛、羊、兔、鸡和鸡蛋的 白蛋白所组成的组。
显然，按照本发明的方法，各阶段中所用的缓冲溶液可以彼此相同，也可以彼此不同。可用作缓冲溶液的有：邻苯二甲酸盐(phtha-late)，磷酸盐，乙酸盐等等，优选的是磷酸盐。
根据一种优选的方法，使用0.05M的磷酸盐缓冲溶液来洗脱色谱柱，其中事先装入(6R，S)-甲基-四氢叶酸，钙盐。对(6R，S)甲酰基-四氢叶酸，钙盐的情形，装入0.15M的磷酸盐缓冲溶液。
最后，根据本发明，有可能将分离方法的生产率提高至工业水平，进行洗脱的时间被缩短。
下面参照优选实施例详细地描述本发明，应该理解，本发明并不为这些特殊的实施例所限制。
在下面实施例中所提到的产率用一个重量值来表达，这里它相应于一个光学产率(optical yield)。实施例1
一个工业柱，直径为0.90m，高为6.0m，其中装有硅胶，硅胶颗粒直径为35/45μm，悬浮在含有0.1％(wt)巯基乙醇的，pH值为5的0.15M的缓冲溶液中，直至几乎完全填满(5.5m的高度等于大约3600g硅胶的体积)。
手性物质的制备按下列方式进行：在洗脱液中出现280nm的UV吸收后，将蛋清白蛋白溶液(含量为1％，在0.15M的磷酸盐缓冲溶液中，pH值为5.0)装入该柱中。在硅胶上吸收的白蛋白的量等于200/400kg。用1000l的0.15M的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱，再用10000l的0.15M的pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液衍脱，最后用10000l的0.15M的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱。然后加入5kg的，流速为200/400l/h的5％的5-甲酰-(6R，S)四氢叶酸钙溶液。再用0.15M的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱。收集500l份。
(6S)部份先于(6R)部份洗脱出。洗脱部分可以用装有流动孔(flowing cell)的偏光计来线性控制，然后用HPLC精确地测定剂量。分离出足够纯的部份以用于所需目的。收集纯的部份，并用公知方法盐化。产率：1.9kg(28％)的(6S)叶酸盐滴定度：HPLC＞98％光学纯度：＞97％实施例2：
在本实施例中，以工业规模再现了Choi等人的方法。
使用了相同的柱，以及制备静止相的相同的方法，所用方法如实施例1。
用1000l的0.15M的pH值为7的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱。向柱中加入大约5kg的，流速为200/400l/h的5％的(6R，S)叶酸钙溶液。用pH值为7的磷酸钙缓冲溶液进行洗脱。收集500l部份。
分离不令人满意；纯化循环重复四次，以试图获得部份分离。
因分离不佳而放弃原文。实施例3
使用了与实施例1相同的柱，以及制备静止相的相同的方法，但这里使用猪血清白蛋白(PSA)。产率：1.5g(30％)的(6S)叶酸钙HPLG滴定度：＞98％光学纯度：＞97％实施例4
使用了与实施例1相同种类的柱，但是这里使用脱气水用于制备静止相，以及吸收和洗脱的下一个相。
用10000l的pH值为5.2的0.05M的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，加入10kg的，流速为200/400l/h的5％的(6S)-甲基-四氢叶酸溶液，再用pH值为5.2的0.05M的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集500l部份。
(6S)部份光于(6R)部份洗脱出。分离出足够纯的部份以用于所需目的，用公知方法收集并处理之。产率：3.9kg(39％)的(6S)甲基四氢叶酸钙HPLC滴定度：＞97％光学纯度：＞97％
Claims (8)
1.一种通过在色谱柱上，用色谱方法分离式(I)的叶酸衍生物的(6R，S)非对映异构体混合物来制备(6S)异构体的工业方法：
其中：
X＝CH3或CHO以及
R1和R2是H，NH+，碱金属和碱土金属，R1和R2可以彼此相同或彼此不同；
其中在一个色谱柱中，装入白蛋白的水溶液，然后用pH7的缓冲溶液进行洗涤，再用pH5的缓冲溶液洗涤，装入式(I)的衍生物的非对映异构体混合物的水溶液，然后用第二缓冲溶液进行洗脱，从而得到(6S)非对映异构体，第一次洗脱得到FTHF，以及第二次洗脱得到MTHF，其特征在于溶液中的白蛋白的浓度在0.1％(wt)和10％(wt)之间，以及衍生物溶液的浓度在0.1％(wt)和10％(wt)之间，所说的第二缓冲溶液的pH值在4.8至5.8之间。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于，所说的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液，其浓度在0.05M至0.15M之间。
3.按照权利要求1的方法，其特征在于，所说的色谱柱中装有硅胶，其颗粒度在25μm和60μm之间。
4.按照权利要求3的方法，其特征在于，硅胶的颗粒度在35μm和45μm之间。
5.按照权利要求1的方法，其特征在于，水溶液中的所说的白蛋白的浓度为大约1％(wt)，以及所说的非对映异构体混合物的浓度为大约5％(wt)。
6.按照权利要求1的方法，其特征在于，所说的白蛋白选自由猪、牛、羊、兔、鸡和鸡蛋的白蛋白所组成的组。
7.按照权利要求1的方法，其特征在于，所说的白蛋白水溶液缓冲在pH值4.8-5.8间。
8.按照权利要求1的方法，其特征在于，所说的非对称异构体混合物的所说水溶液缓冲在pH值4.8-5.8间。
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