CN103966272A - 一种微藻净化污水及积累油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微藻净化污水及积累油脂的方法，属于污水处理与生物质合成技术领域。所述方法首先进行水华束丝藻的分离、培养和驯化，然后将其接种到富营养化水体中进行处理；通过设定合理的温度、相对湿度、光照强度和光照比参数，实现对富营养化水体中氮磷的有效去除，同时实现微藻中脂的积累收集。本发明提供的方法操作简便，成本低廉；水华束丝藻对环境的适应性强，并对不同浓度的富营养化污水均具有处理效果。

Description

一种微藻净化污水及积累油脂的方法

技术领域

本发明属于污水处理与生物质合成技术领域，具体涉及一种利用水华束丝藻这种水华藻种，对污水脱氮除磷并合成脂类的方法，适用于生活污水、农业污水、工业污水的处理与再利用。

背景技术

由于化石燃料的日益减少和温室气体的产生，寻找其他相对可再生的燃料能源具有很大意义。生物柴油是清洁、环境友好型可再生能源，具有广阔的发展前景。微藻生长快、周期短，光合效率高，生物质产量大，是未来生物柴油发展的趋势之一。

污水厂常规处理工艺，如活性污泥法、氧化沟工艺等可有效去除大部分的有机、无机污染物，但对氮磷的去除效果不高。磷的处理是特别难以从废水中去除。对于去除废水中的磷，与化学处理方法相比，以藻类为基础的处理方法已被认为是更有效率的方法。藻处理具有显著优势，它可以节约成本，并且利用的是更简单的技术。藻类细胞可以用来去除污水中富集的氮、磷等营养物质，并以有机物的形式将其储存在藻细胞中。因此若能将氮磷的去除与产能综合考虑，则可实现污水处理和资源利用的双重目的。

水华，是淡水水体中藻类大量繁殖的一种自然生态现象，是水体富营养化的一种特征，大部分湖泊水华以蓝藻为主。蓝藻是一种光和自养的原核微生物，生存范围很广，可以漂浮生活在各种水体中，对营养条件的要求也很低，而且容易进行基因重组、快速进行定位诱变、基因插入、基因替换和切除等。水华藻在营养条件充足时会大量繁殖，形成水华，使水体污染，鱼虾死亡，水道堵塞，严重影响水体生态系统的健康发展，降低水资源的利用效能，对人类的生产和生活造成严重的影响。除此之外，水华藻毒素也会严重影响水体的质量，危害人类的健康。现阶段主要有两种处理方式，一种是治理，降低藻细胞量；另一种是利用，以水华藻为原料提取或制备一些有价值的物质，如提取游离氨基酸、藻蓝蛋白、多糖，制备复混肥，超临界水气化制取氢气等。将水华藻类利用起来具有优势，用水华藻类生产生物燃料具有发展前景。

水华束丝藻是造成水华的一种代表藻类，属于蓝藻门藻殖段目束丝藻属。藻丝多数为直立的，常多数集合形成盘状或纺锤状群体，无鞘，顶端尖细，异形胞间生，孢子远离异形胞。水华束丝藻藻丝集合成束，少数单生，或直或略弯曲；细胞宽5～6μm，长5～15μm，圆柱形，具有气囊。水华束丝藻在我国分布广泛，生长于淡水中，是地球上最早发现的藻种。束丝藻是一种可以食用的蓝藻，可生产作为日常保健食品。由于束丝藻的藻丝体含有大量神经传递素苯乙胺(Phenylethylamine)，能增加人体脑部的多巴胺水平，进而促进内啡肽循环，使束丝藻成为一种现时的时兴健康食品原材料。

发明内容

本发明提供一种微藻净化污水及积累油脂的方法，利用水华束丝藻脱氮除磷合成脂类，具体方法步骤如下：

第一步：水华束丝藻的分离、培养和驯化。

从发生水华的水域采集大量生长的浮游藻类，经分离得到水华束丝藻后，置于灭菌之后的BG11液体培养基中培养，然后驯化。

水华束丝藻进行驯化条件为：温度15～25℃，光照度为3000～20000lx，光暗周期比为14h:10h，持续曝气，获得对数期的水华束丝藻细胞液。

第二步：水华束丝藻对富营养化水体的处理；

对数期的水华束丝藻细胞液，首先用0.45μm膜真空过滤，超纯水清洗，2500×g离心15min，抽滤离心洗涤过程重复三次。摇匀后用移液枪均匀加入需要处理的水体中，水体满足富营养化条件，包括水体市政污水、农业污水等。

设定温度(10℃～30℃)、相对湿度(30～70％RH)、光照强度(3000～22000lx)光照比(14h:10h)～(12h:12h)，将接种有水华束丝藻的富营养化的水体置于的人工气候培养箱内恒温恒湿培养，培养过程中不断曝气。

所述光照强度优选为12000lx。

第三步：污水处理过程参数监测；

测定440nm处的吸光度，当水华束丝藻达到稳定期或衰亡期，标志污水中氮磷去除接近终点，利用分光光度法或者离子色谱监测污水中氮磷的浓度。通过尼罗红染色荧光光谱法监测水华束丝藻的中性脂的含量的增长情况，中性脂的含量和尼罗红染色后的荧光强度呈显著相关。每日定时水华束丝藻藻液，加入尼罗红(0.1mg·mL^-1溶于丙酮)，在20℃下染色10分钟，使用荧光分光光度计监测微藻中脂的积累情况。激发和发射波长分别为480nm和580nm。微藻中脂在稳定期后期至衰亡期大量积累，污水中氮磷去除基本完成后1～2天，对微藻进行收集，获得微藻合成的脂。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供的是一种利用微生物处理污水的方法，操作简便，成本低廉；

(2)本发明提供的是一种利用水华微藻合成生物能源的方法，所用的水华束丝藻来源广泛，易于获得；

(3)本发明用的水华束丝藻属于引起水华的一种常见微藻，水华微藻属于有害藻种，目前关于这方面的利用研究较少，该方法可变废为宝；

(4)本发明提供的是一种利用水华微藻合成生物能源的方法，生物能源属于可再生能源，具有广阔的应用前景。

(5)本发明中水华束丝藻对环境的适应性强，并对不同浓度的富营养化污水均具有处理效果。附图说明

图1：本发明中测量得到的加入水华束丝藻细胞液的培养基中氮的去除率；

图2：本发明中测量得到的加入水华束丝藻细胞液的培养基中磷的去除率；

图3：本发明中得到的中性脂的荧光变化图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供一种微藻净化污水及积累油脂的方法，以水华束丝藻为例，所述方法包括如下步骤：

第一步：水华束丝藻的分离、培养和驯化。

水华束丝藻分布广泛，广泛存在于淡水中。水华爆发时，水体中往往存在水华束丝藻，并可能成为优势藻种。因而从发生水华的水域采集大量生长的浮游藻类，用消毒的纱布过滤。将所述藻类稀释得到藻液，用吸管将所述藻液滴在载玻片上，在显微镜下观察载玻片上的藻液，如果一滴藻液内含有两种及以上藻细胞则继续进行稀释，直到显微镜下观察到只有一种藻类细胞，观察藻细胞形态，根据藻种库图谱确认该藻种为水华束丝藻，用吸管将藻液置于灭菌之后的BG11液体培养基中培养。

水华束丝藻在使用之前要用接近实际中富营养化的条件进行驯化，使水华束丝藻适应富营养化条件下的水体。水华束丝藻的培养和驯化可在人工气候箱中，驯化条件为：温度15～25℃，光照度为3000～20000lx，光暗周期比为14h:10h，持续曝气。测定水华束丝藻的生长状况，获得对数期的水华束丝藻细胞液。

第二步：水华束丝藻对富营养化的水体的处理；

对于所述对数期的水华束丝藻细胞液，首先用0.45μm膜真空过滤，超纯水清洗，2500×g离心15min，重复上述的抽滤离心洗涤过程三次。摇匀后用移液枪将抽滤离心洗涤后获得的细胞液均匀接种到需要处理的水体中。所述水体满足富营养化条件，包括水体市政污水、农业污水等。

设定温度(10℃～30℃)、相对湿度(30～70％RH)、光照强度(3000～22000lx)光暗周期比(14h：10h)～(12h：12h)，将接种后的富营养化的水体置于人工气候培养箱内恒温恒湿培养，培养过程中不断曝气。微藻在生长过程中可利用水中的氮磷做为自身生长所需营养物质的来源，并将其合成为藻细胞的组成成分，微藻在生物量增长并合成脂类的同时也可达到去除水中过高氮磷浓度的效果，从而抑制水体的富营养化趋势。水华束丝藻可以适应不同强度的光照，生长适宜，其中最适光照为12000lx，与日照光强度接近，工业生产中不需要额外增加人工光照。水华束丝藻对温度的适应范围广，从10～30℃皆可，表现良好。在中低温条件下，相对其他藻种，具有明显的优势。

第三步：污水处理过程参数监测；

利用测定藻细胞的光密度与氮磷的浓度，判断污水净化过程完成状况。测定440nm处的吸光度，判断水华束丝藻生长情况，是否已达到稳定期或衰亡期，标志污水中氮磷去除接近终点。利用分光光度法或者离子色谱可以测定污水中氮磷的浓度，观察水华束丝藻去除氮磷的程度。微藻中脂在稳定期后期至衰亡期大量积累，通过尼罗红染色荧光光谱法监测水华束丝藻的中性脂的含量的增长情况，中性脂的含量和尼罗红染色后的荧光强度呈显著相关。到达稳定期末期或衰亡期，污水中氮磷去除基本完成后1～2天，对微藻进行收集，获得微藻合成的脂。可以间隔相同时间来取出50ml的藻液置于离心管中，在离心机中以4000转/min、20℃的条件离心20分钟，离心完成后取上清液，进行氮磷的分析，如图1和图2反映了水华束丝藻净化水体的过程。并每日取5ml水华束丝藻藻液，加入1ml DMSO(二甲基亚砜)，加入0.6ul尼罗红(0.1mg·mL^-1溶于丙酮)，在20℃下染色10分钟，使用荧光分光光度计进行分析。荧光分光光度计的激发和发射波长分别为480nm和580nm。水华束丝藻的荧光强度随时间的变化情况如如图3所示，表明脂在微藻中的积累。处理时间越长，荧光强度越大，表明脂的积累的量越大。

实施例1：

第一步：水华束丝藻的分离、培养和驯化。

从发生水华的水域采集大量生长的浮游藻类，用消毒的纱布过滤。将藻类稀释，用吸管将稀释的藻液滴在载玻片上，在显微镜下观察载玻片上的藻液，如果一滴藻液内含有两种及以上藻细胞则继续进行稀释，若是只有同种藻类细胞时，则用吸管将藻液冲入灭菌之后的BG11液体培养基中培养。

水华束丝藻在使用之前采用50％BG11培养基进行驯化，即培养浓度均为BG11配比的一半，使水华束丝藻适应富营养化条件下的水体。BG11培养基组成成分：1.50g/L NaNO₃，40mg/L K₂HPO₄，75mg/L MgSO₄·7H₂O，36mg/L CaCl₂·2H₂O，6mg/L C₆H₈O₇，6mg/LC₆H₁₀FeNO₈，1mg/L EDTANa₂，20mg/L Na₂CO₃，微量元素A5(2.86mg/LH₃BO₃，1.86mg/LMnCl₂·4H₂O，0.22mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.39mg/L Na₂MoO₄·2H2O，0.08mg/L CuSO₄·5H₂O，0.05mg/L Co(NO₃)₂·6H₂O)。

水华束丝藻的培养和驯化在人工气候箱中，驯化条件为：温度25℃，光照度为3000lx，光暗周期比为14h:10h，持续曝气。测定水华束丝藻的生长状况，获得对数期的水华束丝藻细胞液。

第二步：水华束丝藻对富营养化水体的处理；

对数期的水华束丝藻细胞液首先用0.45μm膜真空过滤，超纯水清洗，2500×g离心15min。抽滤离心洗涤过程重复三次。摇匀后用移液枪均匀加入满足富营养化的氮磷比不同的水体中。接种后将盛有接种了水华束丝藻的水体的三角瓶放置于温度10℃，光照周期14h：10h，光照强度3000lx，相对湿度30％RH的人工气候培养箱内恒温恒湿培养，培养过程中不断曝气。

第三步：污水处理过程参数监测；

利用测定藻细胞的光密度与氮磷的浓度，判断污水净化过程完成状况。测定440nm处的吸光度，判断水华束丝藻生长情况，是否已达到稳定期或衰亡期，标志污水中氮磷去除接近终点。利用分光光度法测定污水中氮磷的浓度，观察水华束丝藻去除氮磷的程度。脂的积累主要发生在稳定期后期至衰亡期，通过尼罗红染色荧光光谱法监测水华束丝藻的中性脂的含量的增长情况，中性脂的含量和尼罗红染色后的荧光强度呈显著相关。可以间隔相同时间来取出50ml的藻液置于离心管中，在离心机中以4000转/min，20℃的条件离心20分钟，离心完成后取上清液，进行氮磷的分析，如图1和图2反映了水华束丝藻净化水体的过程。每日定时取出50ml的藻液置于离心管中，在离心机中以4000转/min，10℃的条件离心20分钟，离心完成后取藻的沉积物，用PBS缓冲液(也称磷酸盐缓冲液)稀释到5ml，加入1ml DMSO，加入0.6ul尼罗红(0.1mg·mL^-1溶于丙酮)，在20℃下染色10分钟，使用荧光分光光度计进行分析。荧光分光光度计的激发和发射波长分别为480nm和580nm。综合氮磷的去除情况与脂的累积情况，得到利用水华束丝藻脱氮除磷合成脂类的最佳的氮磷比条件。

得到以下的结果：

水华束丝藻的脱氮除磷效果优异，随着时间的推移，氮磷的去除率增大。对磷的去除速度快，在前48h最终磷的去除率达90％以上，氮的去除率也达80％以上，水华束丝藻的脂积累情况良好，表现出较高的荧光强度，利用水华束丝藻脱氮除磷并合成脂类具有实际意义。适合水华束丝藻积累脂类的最佳氮磷比为16:1。

实施例2

第一步：水华束丝藻的分离、培养和驯化。

同实施例1，选取驯化温度15℃，光照度为20000lx，进行水华束丝藻分离、培养和驯化后，将处于对数生长期的水华束丝藻细胞液加入到锥形瓶中。

第二步：水华束丝藻对富营养化水体的处理；

将对数期的微藻接种到培养基中，选取氮磷比16:1的条件。将对数期的水华束丝藻细胞液首先用0.45μm膜真空过滤，超纯水清洗，2500×g离心15min。抽滤离心洗涤过程重复三次。摇匀后用移液枪均匀加入满足富营养化的氮磷比不同的水体中。接种后置于三角瓶内。将三角瓶放置于温度30℃，光照周期12h:12h，光照强度22000lx，相对湿度70％RH的人工气候培养箱内恒温恒湿培养，培养过程中不断曝气。

第三步：污水处理过程参数监测；

测定微藻的440nm处的吸光度以及氮磷的浓度，判断污水净化过程完成状况。通过尼罗红染色荧光光谱法监测水华束丝藻的中性脂的含量的增长情况。综合氮磷的去除情况与脂的累积情况，分析得到利用水华束丝藻在高温高光强条件下的脱氮除磷与合成脂类的效果。

得到的结果：

水华束丝藻的脱氮除磷效果优异，随着时间的推移，氮磷的去除率增大。水华束丝藻对不同温度的适应性良好，适合发展为脱氮除磷及生物能开发的藻种。

实施例3

第一步中选取驯化温度22℃，光照度为5000lx，光暗周期比为14h:10h，持续曝气，进行水华束丝藻分离、培养和驯化后，将处于对数生长期的水华束丝藻细胞液加入到锥形瓶中。

第二步中，水华束丝藻对富营养化水体的处理的条件选取氮磷比16:1，将三角瓶放置于温度15℃，光照周期14h：10h，光照强度3000lx，相对湿度50％RH的人工气候培养箱内恒温恒湿培养，培养过程中不断曝气。

其余部分同实施例1。试验结果显示，水华束丝藻的脱氮除磷效果优异，随着时间的推移，氮磷的去除率增大。水华束丝藻对不同温度的适应性良好，适合发展为脱氮除磷及生物能开发的藻种。

Claims (6)

1.一种微藻净化污水及积累油脂的方法，其特征在于：具体方法步骤如下：

第一步：水华束丝藻的分离、培养和驯化；

第二步：水华束丝藻对富营养化水体的处理；

第三步：污水处理过程参数监测；

测定440nm处的吸光度，当水华束丝藻达到稳定期或衰亡期，标志污水中氮磷去除接近终点，利用分光光度法或者离子色谱监测污水中氮磷的浓度；通过尼罗红染色荧光光谱法监测水华束丝藻的中性脂的含量的增长情况，中性脂的含量和尼罗红染色后的荧光强度呈显著相关；每日定时水华束丝藻藻液，加入尼罗红，在20℃下染色10分钟，使用荧光分光光度计监测微藻中脂的积累情况；激发和发射波长分别为480nm和580nm。微藻中脂在稳定期后期至衰亡期大量积累，污水中氮磷去除基本完成后1～2天，对微藻进行收集，获得微藻合成的脂。

2.根据权利要求1所述的一种微藻净化污水及积累油脂的方法，其特征在于：第一步具体为，从发生水华的水域采集大量生长的浮游藻类，经分离得到水华束丝藻后，置于灭菌之后的BG11液体培养基中培养，然后驯化；水华束丝藻进行驯化条件为：温度15～25℃，光照强度为3000～20000lx，光暗周期比为14h:10h，持续曝气，获得对数期的水华束丝藻细胞液。

3.根据权利要求1所述的一种微藻净化污水及积累油脂的方法，其特征在于：第二步具体为，首先用0.45μm膜真空过滤对数期的水华束丝藻细胞液，然后超纯水清洗，2500×g离心15min；摇匀后用移液枪均匀加入需要处理的富营养化水体中；

将接种有水华束丝藻的富营养化的水体置于的人工气候培养箱内恒温恒湿培养，培养过程中不断曝气；培养条件为：设定温度10℃～30℃、相对湿度30～70％RH、光照强度3000～22000lx，光照比(14h:10h)～(12h:12h)。

4.根据权利要求3所述的一种微藻净化污水及积累油脂的方法，其特征在于：所述光照强度为12000lx。

5.根据权利要求3所述的一种微藻净化污水及积累油脂的方法，其特征在于：第二步中所述的抽滤洗涤离心过程重复三次。

6.根据权利要求1所述的一种微藻净化污水及积累油脂的方法，其特征在于：所述富营养化水体中氮磷比为16:1。