CN103966261B - 可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其制备方法和应用，其中制备方法包括：将重组质粒mbp‑nfsB‑EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中；以及培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系，所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系即为可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，其中，所述重组质粒mbp‑nfsB‑EGFP中携带的mbp基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用该方法能够有效制备获得可特异性清除髓鞘组织、引起髓鞘脱失且能够稳定遗传的转基因斑马鱼，并且在甲硝唑的作用下，该转基因斑马鱼幼鱼的少突胶质细胞可以被特异性清除，使其出现髓鞘脱失的病理改变，并伴有运动功能下降，进而，该转基因斑马鱼能够为活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制，以及相关药物筛选提供有力的动物模型。

Description

可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及斑马鱼模型的制备方法与应用，具体地，涉及可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其制备方法和应用。更具体地，本发明涉及制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法、可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其在髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或再生机制研究，以及筛选用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物中的应用。

背景技术

髓鞘是保护、支持和营养轴突的膜性结构，在中枢神经系统，髓鞘由成熟的少突胶质细胞伸出突起包绕轴突形成；而在外周神经系统则由施万细胞构成。髓鞘的主要功能是起绝缘作用，介导神经冲动的正常、快速传递，是神经系统发挥功能的结构基础。在人类，当髓鞘在遗传因素和/或外在环境因素作用下受到损伤，即引起以多发性硬化为主要表现的脱髓鞘疾病，除髓鞘脱失外，还出现神经轴突退化，患者出现不同程度的感觉、运动和识别等功能丧失。

截至目前，髓鞘脱失的机制不明，利用动物模型深入研究髓鞘的损伤与再生是一个有效途径。然而，目前用于髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或髓鞘再生机制和相关药物筛选研究的动物模型，仍有待改进。

发明内容

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

斑马鱼发育快速、胚胎透明，髓鞘结构特征、形成过程及基因表达方式与哺乳动物高度相似，是研究髓鞘损伤与再生的理想动物模型。然而，目前还未见关于髓鞘损伤或髓鞘脱失的斑马鱼模型的报道，利用转基因技术建立髓鞘损伤或髓鞘脱失的斑马鱼模型是活体研究髓鞘损伤和再生机制的新途径。

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效制备可特异性清除髓鞘组织、获得髓鞘脱失的转基因斑马鱼模型的方法。

进而，发明人做了大量工作，最终发现将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼，髓鞘碱性蛋白基因启动子驱动绿色荧光蛋白，能够成功构建可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼Tg（mbp:nfsB::EGFP）。进而，在甲硝唑的作用下，可以特异性清除幼鱼的少突胶质细胞，使其出现髓鞘脱失的病理改变，并伴有运动功能下降。该转基因斑马鱼Tg（mbp:nfsB::EGFP）将为深入活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制提供有力的动物模型。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法。根据本发明的实施例，该方法包括如下步骤：将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中；以及培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系，所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系即为可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，其中，所述重组质粒mbp-nfsB-EGFP中携带的mbp基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地，所述mbp基因（即髓鞘碱性蛋白基因）启动子的核苷酸序列如下所示：

ataataacaa tcccaactcc atgttgcaga tgctgagatg tgactactgc aaatgaacac 60

ggtgtgatat tgatgccgaa acaatatatt gtgcagccct acaataaacc ttggattaaa 120

gtgcatattg acggtcctat gaatttactt tagatgatta catttcaaat ggaatgacag 180

aaatatttca gattttgtta caaataatga ataataaata taaattaata aactcaatgt 240

ctgattagta ctttgcactg ctacagtaat acttaatttg ttcagattta aaggtgattt 300

ttcaatattt agattttttt aaaccctcca tgttttcaaa tatttgtcca tgctaacaac 360

ccatgcaatg gaaatcattg attagatgga aatccatcta atcaatggat tatgtataaa 420

gaaataaggt ggtttagtat tggggtgaat taaacattta tcgtcatttt tatcacagtt 480

atactaacat atacttactc ccatgaccat ttaataaaaa tattatctta taatgatgaa 540

taaacaagca ttctttaaac tccactgtaa aaaaactcac aaagctaaag ttatttacat 600

ttaaacacgt tttacatctt tcagcacatc ctagtttaga tttcctattt gaaatcacat 660

gccatcattt tttaaatcgc tgcgtgtcta tatttgattg tatatgacat tgactggatg 720

tgtttacaaa ctcatcattt ctgcctttta tttcctgaac tatttcacat gcatgcctca 780

ttattttagc ctatgcatgt ttacccagtt gtctggattt ctagcttgaa tgaatttcct 840

cttctaatga cctcgtggca aacatcttaa ggacaaagaa aattgcagct gcacatctgg 900

ccgaacacag caaaggtaaa cctttattta tatgatcaaa aatgtcagtt ttgtgacatt 960

tcagtgcagg aacaacaaca aaaagagaca ttttttgaaa aaagtgaatg aataaataat 1020

aaaagcagaa tgttttacta tggaacactg tggcctttgt ttgctggcca tacttgcatc 1080

acaaacaact gtcaattgtt tgacaaaagg cagcaaaaaa cagcacacta aagccaacaa 1140

cgtttttacc ctcgacagag acagatttgt ccatgtgttc ataacgtttt ctctgaaaag 1200

aaccatgctg agtatcacac acagcagttg gttaatgaat tgcaaagtca ctggaaatta 1260

atttgcagat atttcaagac ttggagcgaa cagagcaagc ggggcgaatg cagattgcaa 1320

cgtttatctg ggatacaaat tacagcacct acttcaagaa atcaatccaa gaactcgttc 1380

ggcatctcaa ggccaaaatt tatcaatgaa ataaacaaag gcgtgtagcg taacatcatc 1440

aacgtctcga tcatcttgcg tgatgaatga aacatggagt ggtttgtctg cagatgacaa 1500

tttcaaactc ttacatgttt gcaatgcacc atatgtgatc cctcaacgta aactatttgt 1560

ataatgaaca tgagtcacca caacaatggt ttgattgtgc caaagccgtt cttcgatgtg 1620

ctctgcttct ttctcataga caggccttgt tgttctgggc tcaagtcggg gcagatgtgg 1680

actagaacaa tagcagctcc ttttatcaga gagcagggta gtgacaccct ccgcgggcac 1740

acagggctcg aaagaatgcc tggcaccagc ccagtatcac tgacgctatt gcaggcccac 1800

ctcatctcct gtgatgccat gcaacggagg ggacgacacc ttcaaaggcc agcccttcgt 1860

gcttagaagc gccgaagact atcgagaagg tttgcagaan sdarcgtctc cagagcggac 1920

tttggattga gcggagaagg acatac(SEQ ID NO.1) 1946

发明人惊奇地发现，利用本发明的方法，能够有效制备获得可特异性清除髓鞘组织、引起髓鞘脱失的转基因斑马鱼Tg（mbp:nfsB::EGFP）。此外，根据本发明的实施例，上述制备获得的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，在甲硝唑的作用下，幼鱼的少突胶质细胞可以被特异性清除，使其出现髓鞘脱失的病理改变，并伴有运动功能下降，进而，该转基因斑马鱼Tg（mbp:nfsB::EGFP）能够为活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制，以及相关药物筛选提供有力的动物模型。

另外，根据本发明上述实施例的制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述重组质粒mbp-nfsB-EGFP是通过如下步骤构建获得的：通过BamHI和NcoI酶切、T4连接酶连接，将SEQ ID NO.1所示的mbp基因启动子克隆到已知质粒pgrna-nfsB-EGFP中。

根据本发明的实施例，进一步包括：从pCS2FA-转座酶通过mMESSAGE mMACHINE系统制备Tol2转座酶mRNA。

根据本发明的实施例，将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中，包括：将2μl、25ng/μl的重组质粒mbp-nfsB-EGFP和2μl、35ng/μl的Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼胚胎中。由此，能够有效提高转基因效率，以及F0阳性个体的比率。

根据本发明的实施例，通过以下步骤培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系：利用荧光显微镜对经过转化的斑马鱼进行筛选，以便确定F0阳性个体，其中，所述经过转化的斑马鱼中在脊髓两侧有呈线状分布、表达绿色荧光蛋白细胞的个体即为F0阳性个体；常规养殖所述F0阳性个体至具备繁殖能力，并将具备繁殖能力的F0阳性个体与野生型斑马鱼进行交配，以便获得F1代斑马鱼；利用荧光显微镜对所述F1代斑马鱼进行筛选，以便确定F1阳性个体，其中，所述F1代斑马鱼中在脊髓两侧有呈线状分布、表达绿色荧光蛋白细胞的个体即为F1阳性个体；将所述F1阳性个体与野生型斑马鱼个体进行交配，以便得到稳定遗传的转基因斑马鱼品系。

具体地，根据本发明的另一些实施例，本发明的制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法，还可以包括以下步骤：

（1）克隆mbp基因启动子，制备重组质粒mbp-nfsB-EGFP，通过PCR方法扩增斑马鱼髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，mbp）基因启动子，其长度为1.9kb，包含第一个外显子，序列为SEQ ID NO.1，扩增引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，用BamHI、NcoI和T4连接酶将mbp启动子替换到pgrna-nfsB-EGFP质粒上；

（2）制备Tol2转座酶mRNA，从pCS2FA-转座酶通过mMESSAGE mMACHINE系统制备Tol2转座酶mRNA；

（3）胚胎转化与筛选，将2μl质粒mbp-nfsB-EGFP和2μl Tol2转座酶mRNA在1～4细胞期共注射到野生型（AB系）斑马鱼胚胎中。具体步骤如下：配制10μl工作液，包括mbp-nfsB-EGFP2μl，Tol2转座酶mRNA2μl，酚红（Phenol Red）2.5μl，DEPC水3.5μl。表达载体mbp-nfsB-EGFP和Tol2转座酶mRNA工作浓度分别为25ng/μl和35ng/μl。其中，酚红仅用于指示颜色，以确定是否注射成功。将工作液放入显微注射针内（由玻璃毛细管拉制而成），利用显微注射仪，在1～4细胞期将工作液注射到野生型（AB系）斑马鱼胚胎中，注射的位置在卵黄囊内靠近细胞极处，注射体积为1ml/胚胎。在96hpf，利用荧光显微镜筛选F0，沿脊柱两侧分布有串珠样绿色荧光蛋白阳性信号分布的个体被认定为F0阳性个体。常规养殖F0阳性个体至具备繁殖能力，与野生型（AB系）交配，以便获得F1代斑马鱼，然后用同样方法筛选F1代斑马鱼，以确定F1阳性个体，。F1阳性个体再与野生型（AB系）个体交配，以便得到稳定遗传的转基因斑马鱼品系Tg(mbp:nfsb::EGFP)。

根据本发明的一些实施例，进一步包括：利用原位杂交技术对所述F0阳性个体和所述F1阳性个体进行假阳性检测。由此，能够避免发育过程中的色素沉着产生假阳性荧光信号影响最终结果。根据本发明的另一些实施例，利用原位杂交技术对所述F0阳性个体和所述F1阳性个体进行假阳性检测进一步包括：在E3孵化液中加入0.003%的1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea，PTU，Sigma）至6dpf（授精的天数），收集幼鱼，以4%多聚甲醛固定，以mbp mRNA标记少突胶质谱系细胞，然后，按照原位杂交标准化流程进行幼鱼整体原位杂交，确定阳性转基因个体。其中，阳性信号的定位与GFP阳性信号一致时，表明GFP标记的细胞为少突胶质细胞谱系细胞，即阳性转基因个体。

根据本发明的实施例，进一步包括：使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，以便获得少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼。

其中，根据本发明的一些具体示例，使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，进一步包括：利用细胞培养板培养所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMSO-E3孵化液，于28.5℃下避光培养5天，以便获得经过处理的转基因斑马鱼品系；将所述经过处理的转基因斑马鱼品系以DMSO-E3孵化液清洗3次、每次5min，其中，所述甲硝唑DMSO-E3孵化液的配制方法为将甲硝唑溶于所述DMSO-E3孵化液，所述甲硝唑的工作浓度是5mM，所述DMSO-E3孵化液为添加了0.2体积%DMSO的E3孵化液。其中，本发明所采用的与斑马鱼养殖等相关表达方式例如“E3孵化液”等均为本领域常规术语，其具体含义或组成等可参见下文提供的标准化方案：Westerfield,M.Thezebrafish book:aguide for the laboratory use of zebrafish(Brachydanio rerio)1993,Eugene,OR:M.Westerfield，通过参照将其全文并入本文。例如，本发明所述的的E3孵化液为60μg/ml海盐。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼。根据本发明的实施例，该可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼是通过前面所述的方法制备获得的。

发明人发现，该可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，在甲硝唑的作用下，幼鱼的少突胶质细胞可以被特异性清除，从而出现髓鞘脱失的病理改变。进而，发明人又对上述出现髓鞘脱失病理改变的转基因斑马鱼进行了行为学评价：于10dpf（受精的天数）时期收集清洗后的甲硝唑处理组和对照组（未经甲硝唑处理的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼）幼鱼，放入含1ml/孔E3孵化液的48孔板（每孔一条幼鱼），每次每组八条，重复三次；开始实验前幼鱼首先适应环境15min，再让幼鱼在孔板中自由运动，以孔板上方架设的摄像机记录视频10min，以Ethovision XT软件分析视频，绘出运动轨迹图，并通过总运动距离、平均运动速度两个指标进行定量统计分析。结果发现，甲硝唑处理组的总运动距离和平均运动速度显著低于对照组，即与对照组相比，髓鞘损伤造成斑马鱼运动能力下降。进一步验证了斑马鱼髓鞘损伤造成斑马鱼运动能力下降。

换言之，发明人发现，本发明的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，能够稳定遗传，不仅能够特异性地标记髓鞘组织，还能在甲硝唑的作用下特异性造成髓鞘的损伤，并伴有运动能力下降，其在一定程度上能够模拟人类髓鞘脱失的病理改变和功能变化，进而，该转基因斑马鱼能够用作活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制，以及相关药物筛选的动物模型。

这是因为，Mbp基因特异性表达在少突胶质细胞谱系细胞，即中枢神经系统的少突胶质细胞和周围神经系统的施旺氏细胞，本发明的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼（即Tg（mbp:nfsB::EGFP））转基因斑马鱼以绿色荧光蛋白（EGFP）驱动mbp启动子，同时携带了nfsB细胞毒性基因（其编码硝基还原酶（Nitroreductase，NTR）），因此这个模型具有两个优势：第一，通过上述方法制备得到的该转基因斑马鱼可以稳定遗传，由于斑马鱼个体小，产卵量大，因此容易获得大量遗传背景和表型一致的实验动物个体，这就为筛选新的药物或治疗方法打下了坚实的基础；第二，髓鞘细胞不仅被绿色荧光蛋白特异性标记，而且可以经甲硝唑的处理被特异性、可逆性、可控性清除，不仅适合于有关髓鞘形成的研究，还可以诱导髓鞘细胞的损伤进而恢复，从而深入研究髓鞘损伤和再生的机制。

由此，根据本发明的又一方面，本发明还提供了前面所述的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼在髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或再生机制研究，以及筛选用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物中的应用。即该可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，在甲硝唑的作用下，幼鱼的少突胶质细胞可以被特异性清除，使其出现髓鞘脱失的病理改变，并伴有运动功能下降，进而，该转基因斑马鱼能够用作活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制，以及相关药物筛选的动物模型。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种筛选用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：根据权利要求前面所述的方法，制备获得可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼；使用甲硝唑对所述可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼进行处理，以便获得少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼；以及在存在所述药物的条件下，对所述少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼进行培养，并基于培养前后所述少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼的运动能力的变化情况对所述药物进行筛选，其中，所述少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼培养后相对于培养前运动能力提高，为所述药物能够用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的指示。由此，利用该方法能够有效地筛选治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物。其中，需要说明的是，可以以总运动距离和平均运动速度作为指标衡量斑马鱼的运动能力。

其中，根据本发明的实施例，使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，进一步包括：利用细胞培养板培养所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMSO-E3孵化液，于28.5℃下避光培养5天，以便获得经过处理的转基因斑马鱼品系；将所述经过处理的转基因斑马鱼品系以DMSO-E3孵化液清洗3次、每次5min，其中，所述甲硝唑DMSO-E3孵化液的配制方法为将甲硝唑溶于所述DMSO-E3孵化液，所述甲硝唑的工作浓度是5mM，所述DMSO-E3孵化液为添加了0.2体积%DMSO的E3孵化液。

此外，需要说明的是，本发明将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA经显微注射至斑马鱼胚胎中，筛选并鉴定得到能够稳定遗传的转基因斑马鱼后，该转基因斑马鱼中的待清除细胞被荧光蛋白特异性标记，并携带NTR，进而将转基因斑马鱼暴露在一定浓度的甲硝唑（metronidazole，Mtz）中，因Mtz仅对NTR表达阳性产生细胞毒性作用，而导致该种细胞的特异性清除。本发明的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼作为动物模型的有点在于：1.甲硝唑容易通过水进入斑马鱼体内，在5dpf以后的斑马鱼中即可应用，通常使用浓度为1-5mM，即使在10mM下对成体鱼的存活和正常生活没有明显影响]；2.清除作用快速，在甲硝唑作用后12-72小时实现细胞清除，通过荧光蛋白观察或免疫组化等方法容易观察清除效果；3.清除过程可逆，脱离甲硝唑后，24小时后细胞开始复原，但不同细胞复原时间各异。从而，本发明的转基因斑马鱼能够被精准地特异性清除少突胶质细胞和/或施旺氏细胞，从而引起髓鞘组织特异性缺失，进而能够有效用作髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或再生相关研究的动物模型。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的mbp-nfsB-EGFP重组质粒的示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例，转基因后斑马鱼脊椎周围表达绿色荧光蛋白的情况；

图3显示了根据本发明一个实施例，利用mbp原位杂交检测荧光蛋白的表达部位结果图；

图4显示了根据本发明一个实施例，甲硝唑处理前后对少突胶质细胞的影响的检测结果图；以及

图5显示了根据本发明一个实施例，表示髓鞘损伤对斑马鱼运动能力的影响的检测结果图。

需要说明的是，本发明所述的重组质粒mbp-nfsB-EGFP的结构均如图1所示。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

一、实验材料和方法

1、实验动物

按标准化方案（可参照：Westerfield,M.The zebrafish book:a guide for thelaboratory use of zebrafish(Brachydanio rerio)1993,Eugene,OR:M.Westerfield，通过参照将其全文并入本文）养殖野生型斑马鱼（AB品系），水温28.5℃，光照/黑暗周期为14h/10h，成体斑马鱼产卵后收集胚胎，养殖于E3孵化液，以受精的小时数（hours post-fertilization，hpf）或受精的天数（days post-fertilization，dpf）表示胚胎和幼鱼的发育阶段。

2、转基因斑马鱼的制备

通过Tol2系统制备转基因斑马鱼Tg（mbp:nfsB::EGFP）。

2.1构建mbp-nfsB-EGFP重组质粒

通过PCR方法扩增斑马鱼髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，mbp）基因启动子，一个启动子长度为1.9kb，序列见SEQ ID NO.1，包含第一个外显子，其引物序列为：正向引物：5’-CGCCGGGATCCATAATAACAATCCCAACTC-3’(SEQ ID NO.4)，反向引物：5’-CGCCGCCATGGGTATGTCCTTCTCCGCTCA-3’(SEQ ID NO.5)；另一个启动子长度为2.2kb，序列见SEQ ID NO.2，包含第一个外显子，其引物序列为：正向引物：5’-CGCCGGGATCCTGCTGAGATGTGACTACTG-3’(SEQ ID NO.6)，反向引物：5’-CGCCGCCATGGGCTCTGTGCCTATAAACTGC-3’(SEQ ID NO.7)；第三个启动子长度为1.9kb，序列见SEQ ID NO.3，不包含第一个外显子，其引物序列为：正向引物：5’-CGCCGGGATCCCGATCCGTCTACGA CTCTA-3’(SEQ ID NO.8)，反向引物：5’-CGCCGCCATGGCCATGGGGTGTTGATCTGT-3’(S EQ ID NO.9)。

PCR反应条件为：

利用质粒pgrna-nfsB-EGFP（携带progranulin-a启动子，Dr.Hitchcock惠赠），用BamHI和NcoI将progranulin-a启动子切除，再通过T4连接酶将mbp启动子连接到质粒上，得到质粒mbp-nfsB-EGFP（如图1所示），测序鉴定。

2.2Tol2转座酶mRNA的制备

从pCS2FA-transposase通过mMESSAGE mMACHINE系统（Ambion,Foster City,CA）制备Tol2转座酶mRNA。

2.3基因的转化和斑马鱼的筛选

配制10μl工作液，包括mbp-nfsB-EGFP2μl，Tol2转座酶mRNA2μl，酚红（PhenolRed）(Sigma）2.5μl，DEPC水（Promega）3.5μl。表达载体mbp-nfsB-EGFP和Tol2转座酶mRNA工作浓度分别为25ng/μl和35ng/μl。酚红仅用于指示颜色，以确定是否注射成功。将工作液放入显微注射针内（由玻璃毛细管拉制而成），利用显微注射仪（MPPI-3，Applied ScientivicInstrumentation Inc.(ASI),OR,USA），在1～4细胞期将工作液注射到野生型（AB系）斑马鱼胚胎中，注射的位置在卵黄囊内靠近细胞极处，注射体积为1ml/胚胎。在96hpf，利用SZX10体视荧光显微镜（Olympus，Japan）筛选F0，在脊髓两侧有呈线状分布、表达绿色荧光蛋白细胞的个体被认定为F0阳性个体：注射mbp启动子序列为SEQ ID NO.1的mbp-nfsB-EGFP质粒的个体，EGFP阳性率为70%；注射mbp启动子序列为SEQ ID NO.2的mbp-nfsB-EGFP质粒的个体没有出现EGFP阳性个体；注射mbp启动子序列为SEQ ID NO.3的mbp-nfsB-EGFP质粒的个体，EGFP阳性率为30%。因此选择注射mbp启动子序列为SEQ ID NO.1的mbp-nfsB-EGFP质粒的F0阳性个体进行后续实验。常规养殖F0阳性个体至具备繁殖能力，与野生型（AB系）交配，同样方法筛选F1，确定F0中的建系者（founder）。F1携带者再与野生型（AB系）个体交配，GFP阳性个体的比例在50%左右，共得到两个稳定遗传的转基因斑马鱼品系Tg(mbp:nfsb::EGFP)，分别命名Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk002和Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk003。

以下所有提及的实验均以Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk002为实验对象。

3、转化基因的检测

为避免发育过程中的色素沉着产生假阳性荧光信号，采用原位杂交技术进行检测。在E3孵化液中加入0.003%的1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea，PTU，Sigma）至6dpf。收集幼鱼，以4%多聚甲醛固定。以mbp mRNA标记少突胶质谱系细胞。

幼鱼整体原位杂交过程如下：从线性化质粒合成反义核糖核酸，以DIG RNAlabeling kit（Roche Diagnostics,Indianapolis,IN）体外转录制备地高辛标记的探针。探针工作浓度为2ng/μl，55℃过夜杂交，阴性对照为不能杂交上的正义链探针。第二天，浸洗幼鱼后，加入碱性磷酸酶抗体，4℃过夜。第三天，以NBT/BCIP(Roche)作为显色底物，阳性信号呈紫蓝色。

当阳性信号的定位与GFP阳性信号一致时，说明GFP标记的细胞为少突胶质细胞谱系细胞。

4、少突胶质细胞的清除

在5dpf对Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk002幼鱼进行甲硝唑处理。将甲硝唑（metronidazole,Mtz,M3761,Sigma）溶于0.2体积%DMSO-E3孵化液（即DMSO-E3孵化液中DMSO含量为0.2体积%），工作浓度为5mM。幼鱼放在六孔板中，每孔加入5ml5mM Mtz溶液，28.5℃避光处理5天，对照组加入等量0.2体积%DMSO-E3孵化液。终止Mtz处理后，实验组和对照组均以E3孵化液清洗3次、每次5min。

5、行为学检测

行为学实验在10dpf进行。收集清洗后的甲硝唑处理组和对照组幼鱼，放入含1ml/孔E3孵化液的48孔板（每孔一条幼鱼），每次每组八条，重复三次。实验方法如下：开始实验前幼鱼首先适应环境15min，再让幼鱼在孔板中自由运动，以孔板上方架设的摄像机记录视频10min，以Ethovision XT软件（Noldus Information Technology,Wageningen,Netherlands）分析视频，绘出运动轨迹图，并通过总运动距离、平均运动速度两个指标进行定量统计分析。

6、照相和图像处理

以BX51荧光显微镜（Olympus）筛选转基因斑马鱼，部分阳性个体以FV1000共聚焦显微镜（Olympus）照相。原位杂交图像以SZX10体视显微镜和附设的DP72照相机获取图像。

二、实验结果

1、mbp启动子驱动少突胶质细胞谱系的细胞特异性表达绿色荧光蛋白

需要说明的是，髓鞘碱性蛋白由mbp基因编码，是神经髓鞘组织内的主要蛋白质。mbp特异性表达于分化成熟的少突胶质细胞谱系细胞，包括中枢神经系统的少突胶质细胞和周围神经系统的雪旺氏细胞，因此，mbp常作为追踪观察髓鞘标志基因。

上述所构建的转基因斑马鱼Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk002自4dpf开始，EGFP信号首先出现在腹侧后脑、侧线神经和脊髓。腹侧后脑EGFP信号呈散在分布，而躯干部位EGFP表达沿脊髓和侧线神经呈线状连续性分布（图2A）。5dpf（图2B）和6dpf（图2C），脊髓处的EGFP表达进一步增强。10dpf（图2D）、15dpf（图2E）和20dpf（图2F）的Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk002仍有绿色荧光蛋白沿脊髓强烈表达。对4-6dpf的Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk002进行mbp原位杂交，结果显示，mbp-表达细胞的位置与EGFP一致（图3A-3C）。这些结果说明，Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk002的EGFP特异性表达于少突胶质细胞谱系细胞。图标尺：图2A-2C，100μm；图2D-2F，1mm。

2、甲硝唑处理可以特异性清除Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk002的少突胶质细胞

甲硝唑处理前，5dpf的对照组（图4B）和Mtz处理组Tg(mbp:nfsB-EGFP)^nk002（图4A）均见EGFP表达。将Tg(mbp:nfsB::EGFP)^nk0025dpf幼鱼在5mM的Mtz溶液处理5天，在10dpf，对照组的脊髓处仍见EGFP表达（图4D），而Mtz处理组脊髓部位的荧光信号明显减弱直至消失（图4C）。以5mM Mtz处理5天，可以特异性清除脊髓的少突胶质细胞，在斑马鱼幼鱼造成髓鞘脱失。图标尺：100μm。

3、髓鞘损伤造成斑马鱼运动能力下降

为了明确斑马鱼髓鞘脱失后能否引起功能改变，我们对10dpf清除髓鞘细胞的幼鱼进行了行为学测试。结果表明，Mtz处理组的运动轨迹与对照组差别明显，对照组明显运动活跃。以总运动距离、平均运动速度两个指标进行定量分析，结果显示，Mtz处理组总运动距离和平均运动速度显著低于对照组（图5）。以上结果显示，在Mtz处理造成幼鱼髓鞘损伤后，斑马鱼的运动能力下降。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中；以及

培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系，所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系即为可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，

其中，所述重组质粒mbp-nfsB-EGFP中携带的mbp基因启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒mbp-nfsB-EGFP是通过如下步骤构建获得的：通过BamHI和NcoI酶切、T4连接酶连接，将SEQ ID NO.1所示的mbp基因启动子克隆到已知质粒pgrna-nfsB-EGFP中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：从pCS2FA-转座酶通过mMESSAGE mMACHINE系统制备Tol2转座酶mRNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中，包括：将2μl、25ng/μl的重组质粒mbp-nfsB-EGFP和2μl、35ng/μl的Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼胚胎中。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下步骤培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系：

利用荧光显微镜对经过转化的斑马鱼进行筛选，以便确定F0阳性个体，其中，所述经过转化的斑马鱼中在脊髓两侧有呈线状分布、表达绿色荧光蛋白细胞的个体即为F0阳性个体；

常规养殖所述F0阳性个体至具备繁殖能力，并将具备繁殖能力的F0阳性个体与野生型斑马鱼进行交配，以便获得F1代斑马鱼；

利用荧光显微镜对所述F1代斑马鱼进行筛选，以便确定F1阳性个体，其中，所述F1代斑马鱼中在脊髓两侧有呈线状分布、表达绿色荧光蛋白细胞的个体即为F1阳性个体；

将所述F1阳性个体与野生型斑马鱼个体进行交配，以便得到稳定遗传的转基因斑马鱼品系。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：利用原位杂交技术对所述F0阳性个体和所述F1阳性个体进行假阳性检测。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，以便获得少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，进一步包括：

利用细胞培养板培养所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系，其中每孔加入5ml 5mM甲硝唑DMSO-E3孵化液，于28.5℃下避光培养5天，以便获得经过处理的转基因斑马鱼品系；

将所述经过处理的转基因斑马鱼品系以DMSO-E3孵化液清洗3次、每次5min，

其中，所述甲硝唑DMSO-E3孵化液的配制方法为将甲硝唑溶于所述DMSO-E3孵化液，所述甲硝唑的工作浓度是5mM，所述DMSO-E3孵化液为添加了0.2体积％DMSO的E3孵化液。