CN103964567B - 一种木质素过氧化物酶制剂去除药物及个人护理品类污染物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木质素过氧化物酶制剂去除药物及个人护理品类污染物的方法，属于污染物生物处理技术领域。其步骤为：(1)采集污水测定pH值，再添加磷酸-柠檬酸盐缓冲液调节并维持水样pH为3-5.5，分析污水中PPCPs的含量，并通过向水样中添加PPCPs，使污水中污染物的浓度为0.01mM；(2)调节反应体系温度至25-40℃，依次向反应器中投加0.5-1.5mM的藜芦醇、0.0055U/mL以上的LiP酶，再向反应体系中投加0.01-0.1mM的H₂O₂启动反应；(3)反应器保持振荡或搅拌状态。本方法将分离纯化后的过氧化物酶制剂，投加到含有PPCP类污染物的废水中，实现高效去除PPCPs污染物。

Description

一种木质素过氧化物酶制剂去除药物及个人护理品类污染物的方法

技术领域

本发明属于污染物生物处理技术领域，更具体地说，涉及一种木质素过氧化物酶制剂高效去除水中药物及个人护理品类污染物的方法。

背景技术

药物及个人护理品(pharmaceuticalsandpersonalcareproducts,PPCPs)是一大类化合物的总称，代表性药物如抗生素、解热镇痛消炎药、避孕药、降压药、镇定剂等，以及日常护理用品如个人皮肤护理及化妆用品、芳香剂、防腐剂、洗涤剂、遮光剂、发型定型剂、牙齿护理用品等。PPCPs作为人们日常生活用品被大量使用和排放，这些化合物通过直接或间接排放、生活污水排放、污泥回用及垃圾填埋和畜禽及水产养殖等方式进入环境。1999年Daughton和Term在美国环保局(EPA)的支持下，综述了PPCPs的环境污染与生态风险问题，从此这一大类化学品引起人们极大地关注，随后EPA也正式将该类化学品定义为PPCPs，并为此开设了官方网站专栏(http://www.epa.gov/ppcp)。目前PPCPs的环境污染和生态效应已经成为国际上研究的热点问题。在环境污染研究方面，Vieno等(2007)报道了芬兰12座污水处理厂包括β-阻滞剂在内的8种PPCPs的进水浓度范围为100～755ng/L，而出水浓度为24～755ng/L；Hebeer，Lindstrom，Daughton和Jones等人系统地报道了美国、日本、德国、瑞典、西班牙和意大利污水处理厂进出水中的抗生素(四环素、金霉素磺胺类)、解热止痛消炎药(布洛芬、对乙酰氨基酚萘普生)、雌激素(雌二醇、炔雌醇、雌激素酮)等药品的浓度，其浓度范围为几个ng～μg/L浓度水平(Hebeeretal.,2002；Lindstrometal.,2002；Seinoetal,2004；Daughtonetal.,2004；Kangetal.,2005)。随着这类化合物的大量生产和使用，部分PPCPs已导致了严重的生态环境毒性，例如，近年来人们不断地在污水处理厂排放口附近水域发现鱼类等水生生物异常生长发育的现象(Gimenoetal.,1997；Desbrowetal.,1998；Krameretal.,1998)，经证实这是由于水体环境中残留的雌激素等PPCPs造成的。Cleuvers等人研究证实双氯芬酸、布洛芬和萘普生对藻类Desmodesmussubspicatus具有潜在的毒性危害；Gagne等人基于鱼体的肝脏实验研究表明PPCPs类药品对水生动物的代谢、内分泌系统均产生了干扰效应(GagneF,BlaiseC,FournierM,etal.,2006)。另外，PPCPs作为亲脂性化合物，广泛在水生生物脂肪组织内蓄积、并且可能随着食物链放大进而影响人类生活健康。在PPCPs的污染治理方面，传统的污水处理工艺显示对镇痛药总去除率为60％左右，对磺胺甲噁唑为60％，对雌二醇为65％，芳香剂的总去除率为70％～90％(MartaCarballaetal.,2004)，并且Jones等人根据模型和污泥计算，认为大多数PPCPs不大可能在传统的污水处理厂中被有效去除，所以很可能随污水排放进入环境(Kangetal.,2005)。而目前研究的较为广泛的是臭氧氧化工艺及臭氧氧化与其它工艺的组合工艺，在去除PPCPs化合物方面效果可观，但是其与传统污染相比，对设备要求较高，运营成本昂贵，使得这一技术很难普及。随着人们对生活质量的追求不断提高，PPCPs的产量和使用量不断增加，导致PPCPs的实际环境污染形势极其严峻，这就促使人们寻求一种高效、成本低廉、可操作性强的污染物处理方法。

近年来酶催化处理污水中的有机污染物得到了越来越多的关注，酶催化的优点在于酶具有较好的选择性和处理的高效性，对低浓度废水能取得良好的处理效果，酶催化不会受对活的有机体有毒的污染物的抑制，而且其浓度适应范围宽、处理时间短。过氧化物酶是许多微生物和植物都能分泌的一类氧化还原酶，其在过氧化氢存在条件下能够催化氧化一系列环境污染物：如白腐真菌属分泌的木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)，能够催化氧化木质素、多环芳烃、多氯联苯和芳香染料等氧化还原电位很高的化合物；而其中以木质素过氧化物酶催化特性最为明显，它能够将苯酚、苯胺类化合物催化聚合，使其形成容易去除的大分子聚合体。该聚合作用既能够处理目标底物还能将废水中其他污染物通过包合、吸附等过程去除，这对于处理含多种污染物的废水具有重要的意义(M.Hamid,etal.,2009)。

目前国内外关于LiP去除水中药物的报道虽然还不多，但一些研究也表明LiP能够不同程度地催化去除水中的消炎镇痛药和抗生素等药物。MarcoUrrea等人利用四种广泛分布的白腐菌(Trametesversicolor,Irpexlacteus,Ganodermalucidum,Phanerochaetechrysosporium)对三种药物布洛芬、降固醇酸、立痛定进行降解研究发现，布洛芬可以被四种白腐菌完全降解，并检测到两种羟基化的降解产物，这两种降解产物都可以被继续降解；而降固醇酸和立痛定可以被Trametesversicolor降解，降解率分别为91％和58％(ErnestMarco-Urrea,MiriamPérez-Trujillo,TeresaVicent,etal.,2009)。Wen等人利用从黄胞原毛平革菌提取的粗LiP对抗生素(四环素、土霉素)进行降解研究发现，粗LiP对四环素、土霉素均有较强的降解能力，降解率可达95％，此外其降解能力随着藜芦醇(VA)和过氧化氢(H₂O₂)浓度的增大而增强，其中VA是P.chrysosporium在分泌LiP的同时又分泌的一种化合物，该化合物不仅是LiP的天然底物，还能够保护LiP，避免其失活，进而增强LiP对一些底物(如木质素、芳香族化合物等)的催化反应性能(Choinowskietal.,1999)；而H₂O₂作为过氧化物酶催化氧化一系列底物的前提，它是酶催化体系中必须要有的氧化剂，适量的H₂O₂能保证LiP最大的反催化活性，但是过量的H₂O₂则可能导致LiP失活(Valderrama,B.,M.Ayala,etal.,2002)。

上述研究还主要是基于传统的真菌降解方法，即将降解真菌接种到含有污染物的培养基上对污染物进行降解去除，此类方法从一定程度上达到了降解去除污染物的目的，但是真菌降解去除污染物的周期较长，且真菌生长过程中需要诸多的营养盐，所以此类方法在传统的污水处理中难以实现，还不能作为污水中PPCP类污染物降解去除的有效方法。

真菌降解PPCP类污染物应用于实际污水处理与LiP纯酶制剂相比对反应条件要求较为苛刻，因此采用提取的LiP纯酶来降解PPCPs污染物废水，可以解决真菌降解PPCPs实际污水所存在的问题。目前关于LiP酶降解PPCPs方面的研究并不多，清华大学贾燕南等人利用木质素过氧化物酶降解四环素，当四环素的浓度为50mg/L，木质素过氧化物酶添加的浓度为40U/L时，反应5min，即可降解95％的四环素(《环境科学学报》，第28卷第1期，《木质素降解酶对四环素的降解可行性》)。但是目前城市污水中PPCPs的浓度都很低，该文献研究高浓度的PPCPs污水的降解并没有实际的应用价值。

发明内容

1.要解决的技术问题

针对现有技术中存在的真菌法降解PPCPs反应条件苛刻、LiP酶法降解含PPCPs实际污水在操作程序以及优化反应条件方面缺乏相应数据、降解低浓度PPCPs所存在的问题，本发明提供了一种木质素过氧化物酶制剂去除药物及个人护理品类污染物的方法。该方法直接使用一种经过分离纯化后的过氧化物酶制剂，将其投加到含有PPCP类污染物的废水中，通过优化反应条件和参数，建立酶制剂高效去除活性药物污染物的方法。

2.技术方案

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种木质素过氧化物酶制剂去除药物及个人护理品类污染物的方法，其步骤如下，

(1)采集污水样进行pH值的测定，向污水中添加磷酸-柠檬酸盐缓冲液(CPBS)调节并维持水样pH为3-5.5，使用高效液相色谱分析污水中PPCPs的含量，并通过向水样中添加PPCPs，使目标污水中污染物的浓度为0.01mM；

(2)通过控温装置调节反应体系温度至25-40℃，依次向反应器中投加0.5-1.5mM的藜芦醇、0.0055U/mL以上的LiP酶，最后向反应体系中投加0.01-0.1mM的H₂O₂以启动反应；

(3)反应器保持振荡或搅拌状态，以充分去除污染物。

优选地，所述的PPCPs为乙酰氨基酚(ATP)、双酚A(BPA)、雌酮(E1)和四环素(TC)中的一种或几种。

优选地，所述的步骤(3)中，反应器保持振荡或搅拌状态90min以上。

优选地，在所述的步骤(2)中，当藜芦醇的浓度为1.0mM，LiP酶的活性为0.0065U/mL、H₂O₂的浓度为0.01mM时，且所述的步骤(3)中，反应器保持振荡或搅拌状态90min以上，LiP酶即可对PPCPs实现99％的降解率。

优选地，所述的LiP酶为经过分离纯化后的过氧化物酶制剂。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的优点在于：

(1)方法直接使用一种经过分离纯化后的过氧化物酶制剂，将其投加到含有PPCP类污染物的废水中，通过优化反应条件和参数，建立酶制剂高效去除活性药物污染物的方法，该方法对低浓度PPCPs类污染物的处理显著效果：采用纯木质素过氧化物酶制剂，通过简单的优化废水反应条件参数，实现快速、高效降解去除低浓度PPCPs类污染物的目的；

(2)本发明能高效的降解PPCP类污染物，当选取的4种PPCPs代表物浓度为0.01mM，藜芦醇的浓度为1.0mM，LiP酶的活性为0.0065U/mL、H₂O₂的浓度为0.01mM时，在该最优反应条件下反应90min即可达到99％的降解率，降解后残余的PPCP类污染物低至微克升级别；

(3)本发明采用的是生物酶催化工艺，具有效率高，方便、无污染等突出特点。

附图说明

图1为不同pH对LiP降解4种PPCPs污染物的影响；

图2为不同H₂O₂浓度对LiP降解4种PPCPs污染物的影响；

图3为不同VA浓度对LiP降解4种PPCPs污染物的影响；

图4为不同LiP活性LiP降解4种PPCPs污染物的影响；

图5为污水中添加藜芦醇(VA)前后，LiP催化去除4种PPCPs污染物的反应效果。

图1至图5标注名称：

―●―ATP：对乙酰氨基酚；

―▲―BPA：双酚A；

―■―E1：雌素酮；

―◆―TC：四环素；

――LiP相对活性。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例，对本发明的技术方案做进一步介绍。

本发明的木质素过氧化物酶制剂去除药物及个人护理品类污染物的方法，其步骤为：

(1)反应体系及操作程序：本发明所使用的酶催化剂为木质素过氧化物酶(LiP)，该酶是经过分离纯化的冻干粉酶制剂，选用的代表性PPCPs污染物分别是：对乙酰氨基酚(ATP)、双酚A(BPA)、雌酮(E1)和四环素(TC)。初始实验以250mL锥形瓶为模拟反应器，反应体积为100mL，反应器内4种PPCPs污染物初始浓度为0.01mM，反应体系以磷酸-柠檬酸盐缓冲液(CPBS)来维持反应pH值，反应装置置于常温下(25℃)。

待上述条件准备就绪，即开始LiP降解反应：依次向反应器定量投加藜芦醇(VA)，LiP酶制剂(单位U/mL)，最后向反应容器中投加过氧化氢(H₂O₂)来启动反应，反应过程中溶液保持振荡或搅拌，LiP降解去除污染物的效果通过高效液相/气相色谱仪(HPLC/GC)定量、定性分析污染物的残留量和反应过程中的中间产物。

(2)反应条件及参数：1)pH值，模拟反应用磷酸-柠檬酸盐缓冲液调节反应体系pH；2)过氧化氢(H₂O₂)的浓度，保证最大的酶催化效率而不致酶失活；3)藜芦醇(VA)的最佳浓度优化；4)添加LiP的活性：以藜芦醇法(VA)测定(Tienetal.1988)，最终以1min内氧化生成1μmol藜芦醛为一个酶活性单位(U)；5)LiP催化体系的温度。各参数优化结果如附图1至图5所示。

实施例1

表1为本实施例所采集实际污水的水质参数。反应体系中选取的四种PPCPs代表污染物浓度均为0.01mM，投加的LiP活性为0.0065U/mL，H₂O₂浓度为0.01mM，VA浓度为1.0mM，用磷酸-柠檬酸盐缓冲液调节反应体系的pH分别至3.0、3.7、4.6、5.0、5.3、6.2、7.0，并且控制温度在25℃，在恒温振荡培养箱中以150rpm的转速下反应90min后检测污染物的残留量。得到的结果如图1所示：反应在pH为3～5.5之间都有较高的降解率，其中在pH为4.6时对4种PPCPs的降解效率最大为99％(降解率>96％)。

表1过滤后的污水处理厂出水的性质参数

化合物	污水中含量
		TOC	10.82±3.28(mg/L)
pH	7.38
		金属	浓度(mg/L)
Al	0.007
		Ba	0.021
Ca	35.1
		Co	<0.002
Cr	<0.002
		Cu	<0.002
Fe	0.009
		K	8.4
Li	0.003
		Mg	6.31
Mn	0.066
		Na	26.5
Ni	0.004
		P	1.27

Pb	<0.05
		Si	4.44
Sr	0.16
		Ti	<0.002
V	0.004
		Zn	0.002

实施例2

反应体系中选取的四种PPCPs代表污染物浓度均为0.01mM，反应体系投加的LiP活性为0.0065U/mL，用磷酸-柠檬酸盐缓冲液调节反应体系的pH＝4.6，藜芦醇(VA)浓度为1.0mM，分别投加不同量的过氧化氢，以调节反应体系的过氧化氢浓度分别为0.005mM、0.01mM、0.02mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM，并且控制温度在25℃，在恒温振荡培养箱中以150rpm的转速下反应90min后检测污染物的残留量。得到的结果如图2所示：H₂O₂的浓度为0.01mM时，LiP对4种污染催化降解率均大于90％，若H₂O₂浓度增加10倍(0.10mM)，则明显对降低了对污染的去除率(小于83％，高于80％)。

实施例3

反应体系中选取的四种PPCPs代表污染物浓度均为0.01mM，反应体系投加的的LiP活性为0.0065U/mL，用磷酸-柠檬酸盐缓冲液调节反应体系的pH＝4.6，H₂O₂的浓度为0.01mM，分别向污水中投加不同量的藜芦醇，以调节反应体系的VA浓度分别为0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM，并且控制温度在25℃，在恒温振荡培养箱中以150rpm的转速下反应90min后检测污染物的残留量。考察不同VA浓度结果如图3所示：1mM左右的VA浓度即能保持较高的酶活性和稳定性，此时LiP酶对4种PPCPs的降解率均达到达到90％，若继续提高VA的浓度，则由于VA和污染物竞争酶结合位点，而导致降解率下降。

实施例4

反应体系中选取的四种PPCPs代表污染物浓度均为0.1mM，用柠檬酸缓冲液调节反应体系的pH＝4.6，VA浓度为1.0mM，H₂O₂的浓度为0.01mM时，分别添加不同量的LiP至浓度为0.001U/ml、0.002U/ml、0.003U/ml、0.004U/ml、0.0055U/ml、0.01U/ml，并且控制温度在25℃，在恒温振荡培养箱中以150rpm的转速下反应90min后检测污染物的残留量。考察不同酶活性对4种污染物的降解，结果如图4所示：0.0050U/mL的LiP酶活性对ATP和TC降解去除率均大于90％，若酶活性提高到0.0055U/mL，则对4种污染物的降解率大于99％(HPLC/GC定量)。

实施例5

在本实施例中，分别采用加入和不加入藜芦醇两种方案进行实施，以不加入藜芦醇的实施方式作为对比例，以说明废水中PPCPs的去除效果。

(1)采集某污水处理厂实际污水作为测试水样,使用pH计对目标污水样进行pH值的测定，通过加酸或加碱调至水样pH为4.6左右，分析预测污水中PPCPs的含量，向该水样中分别添加上述四种污染物，使水样中污染物浓度皆为0.01mM；

(2)恒温培养箱中控制反应体系温度为25℃，依次向反应器中投加1mM的VA、0.02U/mlLiP酶，最后向反应体系中投加0.01mM的H₂O₂以启动反应，此外对比考察了不添加藜芦醇对反应的影响；

(3)反应器保持振荡或搅拌状态90min以上，以充分去除污染物，反应结束后，高效液相色谱分析反应后污水中4种污染物的浓度，并计算降解率。

数据结果显示：在实际污水体系中，若不添加VA，反应20min污染物的降解去除率为60％左右，继续反应90min后，对污染物降解去除率均无显著提高(小于5％)；而添加1mMVA的反应体系中，实际污水体系反应20min后，污染物的平均降解去除率大于80％，并且在90min内的降解去除率达99％以上。此结果表明，在优化的参数条件下，LiP能够将实际污水中的上述四种污染物彻底去除，结果如附图5所示。

Claims (3)

1.一种木质素过氧化物酶制剂去除药物及个人护理品类污染物的方法，其步骤如下，

(1)采集污水样进行pH值的测定，向污水中添加磷酸-柠檬酸盐缓冲液调节并维持水样pH为3-5.5，使用高效液相色谱分析污水中PPCPs的含量，并通过向水样中添加PPCPs，使目标污水中污染物的浓度为0.01mM；

(2)通过控温装置调节反应体系温度至25℃，依次向反应器中投加0.5-1.5mM的藜芦醇、0.0055U/mL以上的LiP酶，最后向反应体系中投加0.01-0.1mM的H₂O₂以启动反应；

(3)反应器保持振荡或搅拌状态，以充分去除污染物；

其中：所述的PPCPs为乙酰氨基酚、双酚A、雌酮和四环素中的一种或几种；

其中：所述的步骤(3)中，反应器保持振荡或搅拌状态90min以上。

2.根据权利要求1所述的木质素过氧化物酶制剂去除药物及个人护理品类污染物的方法，其特征在于：在所述的步骤(2)中，当藜芦醇的浓度为1.0mM，LiP酶的活性为0.0065U/mL、H₂O₂的浓度为0.01mM时，且所述的步骤(3)中，反应器保持振荡或搅拌状态90min以上，LiP酶即可对PPCPs实现99％的降解率。

3.根据权利要求2所述的木质素过氧化物酶制剂去除药物及个人护理品类污染物的方法，其特征在于：所述的LiP酶为经过分离纯化后的过氧化物酶制剂。