CN103923931A - 一种鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶的基因、其干扰基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶(OfDHFR)的基因，其干扰基因及其应用。鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶(OfDHFR)的基因具有SEQ ID NO：1所示的序列特征。其干扰基因正义链具有SEQ ID NO：4所示的序列，反义链具有SEQ ID NO：5所示的序列。本发明还公开了二氢叶酸还原酶(OfDHFR)基因及其干扰RNA序列用于害虫防治的用途。

Description

一种鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶的基因、其干扰基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鳞翅目昆虫亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶(OfDHFR)的基因、其干扰基因及其应用。

背景技术

亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guenée)属于鳞翅目螟蛾科，以玉米、棉花、谷子、高粱等为食，每年造成玉米的减产量可达总产量的10％-30％，而且在我国分布区域跨度大，是我国重要的农业害虫。由于其钻蛀特性，防治困难，目前尚没有特效的化学农药。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物体内抑制特定基因表达的一种现象，小干扰RNA被认为是一种快捷、高效的调控体内基因表达的方法。以害虫关键生理功能基因为生物分子靶标，通过干扰其活性达到抑制生长发育和杀虫目的，具有显著的商业价值和应用前景。

二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR，EC1.5.1.3)是细胞内叶酸代谢的关键酶，它在辅酶NADPH的参与下，催化底物二氢叶酸还原为四氢叶酸(tetrahydrofolate，THF)。THF可以作为一碳单位的传递体。而一碳单位是生物体新陈代谢过程中含有一个碳原子的基团，例如甲基、羟甲基等，其主要生理功能是作为嘌呤和嘧啶的合成原料，是氨基酸和核苷酸联系的纽带。除此之外，THF还可参与到在胸苷酸合酶(TS)的催化下，脱氧尿苷一磷酸(dUMP)转变为脱氧胸苷一磷酸(dTMP)的生物合成中，这是dTMP从头生物合成的唯一路径，dTMP是DNA合成所必须的前体物质，而DNA的合成又与细胞复制密切相关。由于昆虫不能自身合成THF，必须要从外界获得叶酸再转化为DHF，进而由DHFR催化合成THF，所以DHFR对于昆虫生长发育起着极其重要的作用，通过对其功能的干扰和抑制可实现害虫防治的目标。

经对现有技术的文献检索发现，尚未有将DHFR基因及其干扰RNA用于害虫防治的应用或报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶(OfDHFR)的基因核苷酸序列，以及OfDHFR基因的干扰RNA分子在亚洲玉米螟防控中的用途。

本发明公开了一种亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶OfDHFR基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示。

本发明公开了一种亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶OfDHFR基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还公开了所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因干扰RNA序列的模板DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。根据亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶OfDHFR基因序列设计合成的dsRNA，其核苷酸序列包括正义链序列为SEQ ID NO：4，反义链为SEQ ID NO：5。可以特异性的沉默亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶的基因的mRNA的表达，有效控制玉米螟成虫产卵，减少幼虫数量，从而减轻下代玉米螟危害，有效控制虫害。

附图说明

图1：从亚洲玉米螟幼虫中提取的总RNA的凝胶电泳图

图2：PCR产物凝胶电泳图

图3:3’RACE的PCR产物凝胶电泳图

图4：5’RACE的PCR产物凝胶电泳图

图5：利用OfDHFR-F1/OFDHFR-R1和OfDHFR-F1/OFDHFR-R2引物扩增的PCR产物凝胶电泳图

图6：利用RNAi-DNA-F/RNAi-DNA-R引物扩增的PCR产物凝胶电泳图

图7：dsRNA的凝胶电泳图

图8：RNA干扰后雌虫OfDHFR的表达情况

图9：RNA干扰后雌虫的产卵情况

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)由中国科学院植物保护研究所赠与。

下述实施例中涉及到的使用试剂盒的实验操作，均按照试剂盒说明书进行操作。

实施例1

亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶(OfDHFR)基因的获得

一.亚洲玉米螟幼虫的总RNA提取

使用RNAiso plus(Code No.D9108A)对亚洲玉米螟(幼虫)进行总RNA提取，获得其总RNA。

取1ul上述亚洲玉米螟总RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1，RNA样品的结果清晰，符合质量要求适合进行下一步实验。

二.RT-PCR

以亚洲玉米螟总RNA为模板，进行反转录，合成cDNA。

1.引物设计和合成

设计并合成引物：

OfDHFR-1-F：GCNGCNGCNTGYGAYAAYATGGG      (SEQ ID NO:6)

OfDHFR-1-R：ATRTTNGGRAARAANGTRTCRCA      (SEQ ID NO:7)

OfDHFR-2-F：GTNATHATGGGNMGTCGNACNTGG     (SEQ ID NO:8)

OfDHFR-2-R：GANGAGCCNCCDATNACCCA         (SEQ ID NO:9)

2.反转录

使用TakaRa PrimeScript？RT-PCR Kit(Co de No.DR014A)进行反转录实验。

反应体系：

反应条件：65℃，5min，后立即冰上放置2分钟，然后加入下列组分

总体积          20ul

反应条件：30℃10min；42℃30min；95℃5min

3.一次PCR扩增

使用HS DNA聚合酶with GC Buffer(Code No.DR044A)，进行一次PCR扩增。

反应体系:

总体积          50ul

反应条件：

94℃3min，1个循环；98℃10sec，55℃15sec，72℃1min，30个循环；

72℃10min，1个循环。

4.二次PCR扩增

以上述一次PCR产物为模板，使用HS DNA聚合酶with GC Buffer(CodeNo.DR044A)，进行二次PCR扩增。

反应体系:

总体积          50ul

反应条件：

94℃，3min，1个循环；98℃，10sec；55℃，15sec，30个循环；72℃，30sec；72℃，10min，1个循环

取5ul进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2：

M:DL2,000DNA Marker；1:利用DHFR-2-F/DHFR-2-R引物扩增的PCR产物，其条带长度约为大约为200bp,与目标条带大小一致。

5.PCR产物纯化

使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.D823A)切胶回收PCR产物，命名为OfDHFR-1-PCR。

6.测序分析

分别使用DHFR-1-F2/R2对OfDHFR-1-PCR测序。测序结果表明，OfDHFR-1-PCR为目标序列，可进行后续基因调取。

二.3’RACE实验

使用3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(Takara,Code No.D314)试剂盒对OfDHFR基因进行3’RACE实验

(一)实验解说：

应用了套式PCR原理，使用上游外侧特异性引物OFDHFR-3-F1(SEQ ID NO：5)和3′-FullRACE Core Set Ver.2.0自带的3′RACE Outer引物进行1st PCR反应。1st PCR反应产物为模板，使用上游特异性引物OFDHFR-3-F2(SEQ ID NO：6)和3′-Full RACE Core Set Ver.2.0自带的3′RACE Inner引物进行2nd PCR反应，得到的序列命名为OfDHFR-1。

(二)3’RACE具体实验步骤

1.引物设计和合成

设计并合成引物：

OfDHFR-3-F1：GCATCCCCTTGAAGTATCGTCC      (SEQ ID NO:10)

OfDHFR-3-F2：AGGTTCCCGAAGGTGTAGTTGT      (SEQ ID NO:11)

2.3’RACE前处理及反转录

使用TaKaRa3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(Takara Code No.D314)合成cDNA。

反应体系：

反应条件：70℃2min后,立即冰上放置2min。

然后加入下列组分：

总体积10ul

反应条件：42℃60min后,70℃15min。

3.PCR扩增

第一步Outer PCR反应：使用TaKaRa LAwith GC Buffer(Takara CodeNo.DRR02AG)，以上步反转录得到的cDNA为模板，OfDHFR-3-F1为Outer引物进行1st PCR扩增。

反应体系：

总体积25ul

反应条件：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环。

第二步Inner PCR反应：以1st PCR产物为模板，OfDHFR-3-F2为Inner引物进行2nd PCR扩增。

反应体系:

总体积50ul

反应条件：94℃3min；94℃30sec；55℃30sec，30个循环；72℃2min。

取5ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3：

M：：DNA Marker DL2,000

1：OfDHFR3’RACE1st PCR产物

2：OfDHFR3’RACE1st PCR M-MLV(-)对照

3：OfDHFR3’RACE2nd PCR产物

4：OfDHFR3’RACE2nd PCR M-MLV(-)对照

PCR产物表现为一条清晰的带，其条带长度约为400bp。

4.PCR产物纯化

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Takara Code No.DV805A)切胶回收上述3′RACE2nd PCR产物(约400bp的条带)，命名为OfDHFR-3-F1F2。

5.测序分析

PCR产物直接测序：使用引物OfDHFR-3-F2对OfDHFR-3-F1F2测序。

三.5′RACE

使用5′-Full RACE Core Set Ver.2.0(Takara,Code No.D315)试剂盒对OfDHFR基因进行5′RACE实验.

(一)实验解说：

本实验应用“去帽法”原理，Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)可以去掉mRNA的5′帽子结构，使用T4RNA Ligase将5′RACE Adaptor连接到mRNA的5′端后，可以使用5′RACEAdaptor上的引物与已知序列部分的引物进行RT-PCR反应，高特异性地扩增cDNA5′末端的全长序列。

应用套式PCR原理，使用上游外侧特异性引物OFDHFR-5-R1和5′RACE Outer引物进行1st PCR反应。1st PCR反应产物为模板，使用上游特异性引物OFDHFR-5-R2和5′RACEInner引物进行2nd PCR反应，得到的序列命名为OFDHFR-2。

(二)5’RACE具体实验步骤

1.引物设计和合成

设计并合成引物

OFDHFR-5-R1：ATGACCCATGTCGATTCGATA      (SEQ ID NO:12)

OFDHFR-5-R2：GGCATCACAACTACACCTTCGG     (SEQ ID NO:13)

2.5’RACE前处理及反转录

使用TaKaRa5′-Full RACE Kit(Takara Code No.D315)对总RNA进行去磷酸化处理、“去帽子”反应，并与5′RACE Adaptor连接后，反转录合成cDNA，同时设立M-MLV(-)对照。

反应体系：

反应条件：70℃10min；冰上2min。然后加入下列组分：

反应体系：

总体积10ul

反应条件：42℃60min；70℃15min。

3.PCR扩增

第一步Outer PCR反应：使用TaKaRa LAwith GC Buffer(Takara Code No.DRR02AG)，以上述反转录得到的cDNA为模板，OfDHFR-5-R1为Outer PCR引物进行1st PCR扩增。

反应体系：

总体积25ul

反应条件：94℃3min；94℃30sec,55℃30sec,72℃2min，30个循环。

第二步Inner PCR反应：以上述1st PCR产物为模板，OfDHFR-5-R2为Inner PCR引物进行2nd PCR扩增。

反应体系:

总体积50ul

反应条件：94℃3min；94℃30sec,55℃30sec,72℃2min，30个循环。

取5ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4：

M：：DNA Marker DL2,000

1：OfDHFR5’RACE1st PCR产物

2：OfDHFR5’RACE1st PCR M-MLV(-)对照

3：OfDHFR5’RACE2nd PCR产物

4：OfDHFR5’RACE2nd PCR M-MLV(-)对照

PCR产物表现为一条清晰的带，其条带长度约为450bp。

4.PCR产物纯化

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Takara Code No.DV805A)切胶回收上述5′RACE2nd PCR产物(约450bp的条带)，命名为OFDHFR-2。

5.测序分析

PCR产物直接测序：使用引物OfDHFR-R2对OFDHFR-2测序。

四.3′RACE和5′RACE序列验证

1.引物设计和合成

根据上述获得的3′RACE和5′RACE结果，设计并合成引物：

OfDHFR-F1：CATGTCTATACCAACCAGTGTC     (SEQ ID NO:14)

OfDHFR-R1：TCATAACTTTTTGTACACCCTG     (SEQ ID NO:15)

OfDHFR-R2：GTTTTCTTTGTCTATGCTCGGG     (SEQ ID NO:16)

2.PCR扩增

使用TaKaRa LAwith GC Buffer(Takara Code No.DRR02AG)，以3′RACE反转录得到的cDNA为模板，OfDHFR-F1/OfDHFR-R1为引物进行1st PCR扩增。以1st PCR产物为模板，OfDHFR-F1/OFDHFR-R2为引物进行2nd PCR扩增。反应体系和条件都同3′RACE反应的体系与条件。应扩增得到约600bp的目的条带。取5ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5：

M：DNA Marker DL2,000

1：OfDHFR-F1/OfDHFR-R11st PCR产物

2：OfDHFR-F1/OfDHFR-R11st PCR M-MLV(-)对照

3：OfDHFR-F1/OfDHFR-R22nd PCR产物

4：OfDHFR-F1/OfDHFR-R22nd PCR M-MLV(-)对照

从电泳照片可以看出，扩增得到了约600bp的条带，与预计长度相同。

3.PCR产物纯化

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Takara Code No.DV805A)切胶回收上述验证2nd PCR产物(约600bp的条带)，命名为OfDHFR-A。

4.测序分析

PCR产物直接测序：使用引物OfDHFR-R2对OfDHFR-2测序，将序列测通。

5.验证结论

经PCR扩增和测序分析，可以确认得到的3′端和5′端未知序列与OfDHFR-1-PCR序列是连续存在的。OfDHFR基因的全长序列为683bp(SEQ ID NO：1),编码区558bp，编码185个氨基酸(SEQ ID NO:2)。

实施例2

根据亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶OfDHFR基因序列设计合成的dsRNA对雌性亚洲玉米螟产卵情况的影响

一.用于dsRNA合成的模板DNA的制备

1.引物的设计与合成

模板DNA选择基因的特异性区域,以避免生成的dsRNA非特异性干扰。同时,为了满足试剂盒的需要,在模板DNA两条链5'端引入T7启动子。根据要求设计的引物为：

RNAi-DNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGCTTGAAGTATCGTCCGTTGA

(SEQ ID NO:17)

RNAi-DNA-R：TAATACGACTCACTATAGGGTTGTCTATGCTCGGGAAG

(SEQ ID NO:18)

T7启动子：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQ ID NO:19)

2.PCR扩增

以玉米螟RNA反转录产生的cDNA为模板进行PCR扩增,获得合成dsRNA所需要的DNA模板命名为RNAi-DNA(SEQ ID NO：3)。

PCR反应体系为：

总体积         50ul

反应条件为:

94℃5min；94℃30sec,55℃30sec,72℃30sec，30个循环；72℃7min

取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图6：

M：DNA Marker DL2,000

1：利用RNAi-DNA-F/RNAi-DNA-R引物扩增的PCR产物凝胶电泳图

3.PCR产物纯化

合成的PCR产物，经TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒纯化

4.测序分析

使用Ligation Kit(TaKaRa,Code No.D6020A)试剂盒中的Solution I,将RNAi-DNA与pMD18-T载体连接后，转化至中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌落，提取质粒命名为RNAi-DNA-zl,在大连宝生物公司进行测序。测序结果为目标序列，可进行后续实验。

二.dsRNA的合成

dsRNA利用T7RiboMAX？Express RNAi System(promega)试剂盒体外转录合成。

1.dsRNA的合成

反应体系为(试剂盒提供)：

总体积         20.0μl

反应条件为：37℃2.5h；70℃10min；室温20min

加入2μl经200倍稀释的RNaseA Solution，2μl RQⅠRNase Free DNase；37℃30min。

2.dsRNA的纯化

将2μl3M的CH3COONa(pH为5.2)与20μl的异丙醇混合，冰浴1min后，于12000g4℃离心10min，弃上清后，加入500μl70％冷乙醇(以dH2O配制，Rnase Free)漂洗，弃上清后于室温下干燥15min后，加入20μl dH2O溶解沉淀，得dsRNA,取2μl dsRNA稀释后用Nanovue超微量分光光度计测得dsRNA的浓度为4ug/ul。命名为DHFR-dsRNA，其正义链具有SEQ ID NO：4所示的序列，反义链具有SEQ ID NO：5所示的序列，保存于-80℃。将纯化的dsRNA样品进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图7：

M：DNA Marker DL2,000

1：以RNAi-DNA为模板合成dsRNA的凝胶电泳图

三.dsRNA的注射

对新羽化的成虫进行雌雄分类，保证雌虫在注射前未进行交配。取当日羽化的雌虫进行注射,8ug/只。两天后，每组10只雌虫与10只雄虫进行交配，实验分四组，分别为：注射DHFR-dsRNA的雌虫与未经处理的雄虫交配、注射dH2O的雌虫与未经处理的雄虫交配和未经处理的的雌虫与未经处理的雄虫交配。每隔24小时统计产卵数，统计5天。

四.RNA干扰水平检测

为了说明注射dsRNA对于基因干扰的效果,实验采用Quantitative real-time PCR的方法对干扰后的OfDHFR基因表达水平进行检测。实验在注射雌虫两天后采集玉米螟样本,提取RNA,反转录为cDNA,分别检测基因的表达量。

1.采用TIANGEN公司的RNA prep pure Tissue Kit提取各组存活的玉米螟幼虫总RNA。

2.利用TaKaRa的RT reagent Kit将mRNA反转录成cDNA。

反转录反应体系为(试剂盒提供)：

反转录反应条件为：37℃15min；85℃5sec。

3.利用TaKaRa的Premix Ex TaqTM，和Real-Time PCR仪Rotor-Gene3000进行Quantitative real-time PCR，以分析各处理组二氢叶酸还原酶基因的表达水平。Quantitativereal-time PCR的引物为：

PCR上游引物：GCAGAGGTTCCCGAAGGTGTAG     (SEQ ID NO:20)

PCR下游引物：AAGGGTGGTCCATCGCAGC        (SEQ ID NO:21)

Quantitative real-time PCR反应体系为：

两步法

Quantitative real-time PCR反应条件为：

(1)95℃变性10s

(2)95℃解链5s,62℃退火并延伸20s,40个循环。

62℃进行荧光检测，DNA融解分析62～95℃,每步上升1度。

利用双标准曲线法对DHFR进行定量分析，采用管家基因RpS3作为内参用于消除实验过程中不同样品之间的误差。在同一批次的PCR反应过程中同时做标准曲线并检测未知样品以消除不同批次反应带来的误差。根据标准曲线分别读出DHFR和RpS3的相对表达量。DHFR的表达量按照如下公式计算:

4.各处理组OfDHFR基因的表达情况如图8:

ck：未经任何处理的雌虫体内DHFR mRNA的表达水平

H2O：注射H2O的雌虫体内DHFR mRNA的表达水平

dsRNA：注射DHFR-dsRNA的雌虫体内DHFR mRNA的表达水平

发现注射DHFR-dsRNA的雌性玉米螟OfDHFR基因的表达水平低于对照组，说明合成的DHFR-dsRNA可以特异性的沉默亚洲玉米螟二氢叶酸还原酶基因的的表达。

五.雌性玉米螟RNAi后的产卵情况

雌虫与雄虫交配后，每隔24小时统计产卵数，共统计5天。计算产卵数/只/天，如图9：

ck：未经任何处理的雌虫产卵数/只/天

H2O：注射H2O的雌虫产卵数/只/天

dsRNA：注射DHFR-dsRNA的雌虫产卵数/只/天

发现注射DHFR-dsRNA的雌性玉米螟产卵数/只/天低于对照组，说明注射DHFR-dsRNA可以显著抑制雌性玉米螟的产卵。

Claims (5)

1.一种鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

3.如权利要求1所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因的干扰RNA序列，其正义链具有SEQ ID NO：4所示的序列，反义链具有SEQ ID NO：5所示的序列。

4.如权利要求3所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因干扰RNA序列的模板DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.如权利要求1所述鳞翅目昆虫二氢叶酸还原酶基因及权利要求3所述的干扰RNA序列在绿色农药开发和害虫防治中的应用。