CN103923175B - 一种用于检测作用于Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的荧光底物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测作用于Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的荧光底物及其应用。该荧光底物组成为：荧光淬灭基团-Gly-GLy-Glu-Arg-Ile-Glu-Thr-Gly-Glu-荧光基团。本发明所述的荧光多肽底物R28在检测直接作用于活化苏云菌芽孢杆菌Cry1A类原毒素的昆虫中肠胰蛋白酶活力中的应用。与传统的蛋白酶检测方法相比，本发明荧光底物用于检测直接作用于活化苏云菌芽孢杆菌Cry1A类原毒素的昆虫中肠胰蛋白酶活力具有明确的特异性和针对性，检测只作用于相应荧光底物R28的胰蛋白酶活力，酶解反应中产生的强烈的荧光信号，大大提高了检测的灵敏度。

Description

一种用于检测作用于Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的荧光底物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术，涉及一种用于检测作用于Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的荧光底物及其应用，具体涉及一种用于检测作用于苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的荧光底物及其应用。

技术背景

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）是一种革兰氏阳性、杆状、可形成芽孢的土壤细菌。在其生长过程中伴随着芽孢的形成，细胞能合成蛋白晶体，由于这些晶体蛋白对昆虫具有毒杀作用，因而又被称为杀虫晶体蛋白（insecticidalcrystalproteins,ICPs），其中δ-内毒素是最重要的一类杀虫蛋白。δ-内毒素按照结构特点及作用机制的不同又分为Cry毒素和Cyt毒素。和Whiteley在1989年主要根据杀虫谱的不同，将Cry毒素分为CryI、CryII、CryIII、CryIV和CryV-IX几大类，这些不同类型毒素除了杀虫谱不同外，在氨基酸的同源性、分子量大小等方面也有差异。随着Bt新基因不断发现，许多新基因序列同源但杀虫谱不同，或杀虫谱相同但序列不同源，采用原有的命名系统容易出现混乱。因此，Crickmore等修订了编码Bt毒素的Cry基因命名和分类系统，统一以氨基酸序列一致性和进化关系为基础，进行4级命名。Cry1表示1家族（氨基酸一致性超过45%），Cry1A表示1A亚家族（氨基酸一致性超过78%），Cry1Aa表示1Aa基因（氨基酸一致性超过95%），Cry1Aa1表示1Aa基因的第1个等位基因（Crickmoreetal.RevisionofthenomenclaturefortheBacillusthuringiensispesticidalcrystalproteins.MocrobiologyandMolecularBiologyReviews,1998,62(3):807-813）。

Cry毒素蛋白对昆虫的毒杀作用大致有以下四个步骤：（1）在昆虫中肠的碱性环境下，晶体蛋白被溶解，释放原毒素；（2）中肠蛋白酶对原毒素进行加工形成活化毒素；（3）活化毒素与中肠细胞的刷状缘膜囊泡（brushbordermembranevesicles，BBMV）上的受体结合；（4）在中肠细胞膜上形成孔洞，使细胞裂解，渗透压失衡，导致昆虫死亡。Cry1A类原毒素是一类分子量在130-140KD的伴胞晶体蛋白，由三个结构域组成。结构域Ⅰ由N端的疏水α-螺旋组成，位于中间的一个疏水的α-螺旋被其他6个两亲α-螺旋环绕，孔洞形成与该结构域相关；结构域Ⅱ由β折叠组成，三个平行的β折叠形成不对称的β棱柱，其中的一个β折叠反向包裹结构域Ⅰ，毒素与受体结合及抗虫特异性和该结构域相关；结构域Ⅲ由位于C端的两个反向平行的β折叠组成，高度可变的结构域Ⅲ与昆虫中肠上的受体结合、杀虫特异性及结构稳定相关。但这种结构的原素素必须经过昆虫中肠蛋白酶消化为65kDa左右比较稳定的活性多肽后才发挥后续的毒杀作用，活化过程包括几乎整个C端的剪切和在N端25-30个氨基酸被切除，Cry1Ac原毒素的消化已证实发生在N端28位精氨酸处，现有研究表明胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶主要参与了这个过程（Johnstonetal.ResistancetoBacillusthuringiensisbytheIndianmealmoth,Plodiainterpunctella:comparisonofmidgutproteinasesfromsusceptibleandresistantlarvae.JournalofInvertebratePathology,1990,55(2):235-244）。

因此，昆虫中肠蛋白酶酶解活化是一个毒素发挥毒杀作用和害虫对毒素产生抗性的关键步骤，如果其发生变化会导致对原毒素的活化能力降低和对毒素降解作用增强。Oppert等（1997）研究了以BteHD-198筛选的抗性印度谷螟中肠蛋白酶活性后发现，抗性的产生是由于其活性降低而对原毒素的活化作用下降，进一步研究表明在抗性品系中缺失了一种重要的中肠蛋白酶。Forcada等（1996）在抗性烟芽夜蛾CP73-3上也发现由于中肠蛋白酶对Cry1Ab原毒素活化作用的下降及对Cry1Ab降解作用的上升。在抗性小菜蛾和欧洲玉米螟中，蛋白酶活化作用降低也是一个重要的抗性机理。

传统的研究中肠蛋白酶活力的方法一般是利用模式底物来进行检测，如偶氮酪蛋白（azocasein）用于检测总蛋白酶活性，N-苯甲酰-D,L-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐（N-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide,BApNA）用于检测胰蛋白酶的活性，N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基丙氨酸-对硝基苯胺（N-succinyl-alanine-alanine-proline-phenylalanine-p-nitroanilide，SAAPFpNA）用于检测胰凝乳蛋白酶的活性。蛋白酶是昆虫肠道中重要的酶类，用于消化食物及降解摄入体内的有毒物质。不同种类的昆虫由于寄主种类和食性的差异，蛋白酶的组成也不同，不同蛋白酶降解的底物类型和能力都有差异。在传统测定方法中，得到的信息是关于蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶对模式底物的酶解能力，不具有针对性，不能直接阐明中肠蛋白酶对Bt毒素的作用。而且蛋白酶活力测定中针对上述三个模式底物采用的均是颜色反应，灵敏度也比较低。

Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac是Cry1A类毒素中对鳞翅目昆虫具有明显杀虫活性的蛋白，也是Bt制剂中几种最重要的活性成份，其基因是当前在棉花、玉米和水稻中主要转入的外源杀虫蛋白基因，因此研究Cry1A类毒素蛋白的毒杀作用过程和害虫对这类蛋白的抗性机理，对今后对其它具有杀虫活性的Bt基因的有效利用具有很好的示范效应。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于检测作用于Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的荧光底物。

本发明的另一目的是提供该底物的应用。

本发明的又一目的是提供一种检测作用于Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于检测昆虫中肠胰蛋白酶活力的荧光多肽底物R28，组成为：荧光淬灭基团-Gly-GLy-Glu-Arg-Ile-Glu-Thr-Gly-Glu-荧光基团。

其中，所述的荧光淬灭基团优选Dabcyl和所述的荧光基团优选Edans。

本发明所述的荧光多肽底物R28在检测直接作用于活化苏云菌芽孢杆菌Cry1A类原毒素的昆虫中肠胰蛋白酶活力中的应用。

其中，所述的昆虫可来自单个种群或来自于不同种群。

本发明根据Cry1A类原毒素N端的氨基酸序列，针对Cry1A类毒素被中肠胰蛋白酶活化位点在N端28位精氨酸（见附图1），设计了一条荧光多肽底物R28，建立了昆虫中肠胰蛋白酶对这个荧光底物的检测方法，用于研究昆虫中肠中直接作用于Cry1A类原毒素的胰蛋白酶的活力。在短片段多肽Gly-GLy-Glu-Arg-Ile-Glu-Thr-Gly-Glu的3’端和5’两端，分别加上荧光淬灭基团Dabcyl和荧光基团Edans，得到荧光多肽底物R28:Dabcyl-GGERIETGE-Edans,在胰蛋白酶的作用下，短片段多肽在Arg-Ile(即R-I)处的肽键被切断，荧光基团被释放，Edans发出的荧光信号被荧光酶标仪检测到，胰蛋白酶的活力越强，降解的荧光底物越多，得到的荧光信号越强。本方法通过荧光多肽底物的有效运用，提高了检测方法的灵敏性，而且由于底物根据昆虫中肠胰蛋白酶作用于Cry1A类毒素的氨基酸位点处的序列设计，使得检测结果具有明确的针对性，即检测到的是直接作用于这类毒素蛋白的胰蛋白酶的活力，排除了其它蛋白酶的干扰。

一种检测作用于活化苏云菌芽孢杆菌Cry1A类原毒素的昆虫中肠胰蛋白酶活力的方法，包括以下步骤：

1）提取鳞翅目昆虫幼虫中肠的酶液或中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡（BBMV，BrushBorderMembraneVesicles）；

2）利用胰蛋白酶标准品建立本发明所述的荧光多肽底物R28酶解转化的标准曲线，明确1微摩尔荧光底物转化所对应的荧光值RFU的变化；

3）测定昆虫中肠酶液或BBMV对本发明所述的荧光多肽底物R28的酶解活力，计算出中肠酶液中能直接作用于荧光多肽底物R28的胰蛋白酶的活力，从而明确中肠酶液对毒素的酶解能力。

其中，所述的昆虫可来自单个种群或来自于不同种群。

有益效果

本发明根据Cry1A类原毒素的N端氨基酸序列，针对Cry1A类毒素被中肠胰蛋白酶活化位点即N端28位精氨酸，设计了一条荧光多肽底物R28，建立了昆虫中肠胰蛋白酶对此荧光底物的检测方法。与传统的蛋白酶检测方法相比，它具有明确的特异性和针对性，检测只作用于相应荧光底物R28的胰蛋白酶活力，酶解反应中产生的强烈的荧光信号，大大提高了检测的灵敏度。

Cry1A类毒素的作用靶标是鳞翅目昆虫，其中的Cry1Ac、Cry1Ab等毒素对害虫的毒力较高，是Bt制剂的主要毒素成分，也是转基因抗虫植物如棉花、玉米和水稻中主要转入的外源基因。通过本发明建立的针对Cry1A类毒素中肠胰蛋白酶活化位点的胰蛋白酶荧光底物R28及利用该底物检测中肠胰蛋白酶对Cry1A类毒素的酶解能力，可以用于研究毒素对害虫的杀虫机理和害虫对毒素的抗性机理，具有较大的实用价值。

附图说明

图1Cry1A原毒素的N端氨基酸序列图，及本发明中的胰蛋白酶酶解的位点。

图2荧光底物酶解转化的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1

第一步：提取鳞翅目昆虫幼虫中肠的酶液。

以鳞翅目昆虫棉铃虫为例，取棉铃虫第2天的5龄幼虫，置于冰上30分钟后，以手术刀切除头部和尾部，以镊子夹取中肠（含内含物），每3-5头试虫中肠合并作为一个样，加入1ml预冷的0.15M氯化钠溶液，冰浴匀浆，然后将匀浆液转入离心管离心15分钟（12,000g，4℃），取上清液作为酶源，-20℃贮存备用。

第二步：提取鳞翅目昆虫幼虫中肠的BBMV。

以鳞翅目昆虫棉铃虫为例，取棉铃虫第2天的5龄幼虫，置于冰上30分钟后，将虫体的头部和尾部去除，将身体沿背中线解开，以镊子夹取中肠，同时去除内含物，在预冷的0.15M氯化钠中清洗，每10只中肠加入3ml匀浆缓冲液（300mM甘露醇，5mMEGTA及17mMTrisPH7.5；用前加入PMSF少许），冰浴匀浆30秒；加入等体积的24mMMgCl2（约3.5ml）后混匀，冰浴30分钟后离心10分钟（2500g，4℃），将上清液转入新的高速离心管中，30，000g离心30分钟；弃上清后倒置离心管10分钟待液体流尽后，将沉淀重悬于800μl的HEPES缓冲液（10mM，HEPES；130mM，KCl；10％甘油；PH7.4）后于‐80℃贮存。

第三步：利用胰蛋白酶标准品(trypsin，sigma-aldrich公司)建立荧光底物转化的标准曲线。

(1)将1mg的荧光底物R28（Dabcyl-Gly-GLy-Glu-Arg-Ile-Glu-Thr-Gly-Glu-Edans，委托上海强耀生物科技有限公司生产）溶解于690μlDMSO中，得到1mM的荧光底物溶液，室温避光保存。

(2)将从sigma-aldrich公司购得的胰蛋白酶标准品(trypsin)溶于pH10.0的0.1M甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，配制成0.25毫克每毫升的溶液。将1mM的底物溶液用DMSO稀释成一系列的浓度：0.05mM、0.25mM、0.0125mM和0.0625mM。整个酶解反应体系如下，取96孔荧光酶标反应板在其中加入200μl甘氨酸－氢氧化钠缓冲液和5μl荧光底物溶液，最后加入10μl胰蛋白酶标准品溶液，将酶标反应板放入荧光酶标仪中，设定温度为30℃，反应时间为100分钟，使胰蛋白酶标准品能将不同浓度的荧光底物充分转化。采用终点法进行检测，荧光酶标仪事先设定好激发波长λex=336nm，发射波长λem=490nm，开始读数前先在酶标仪内对酶标反应板振荡1分钟。

(3)以荧光底物的微摩尔数作为横座标，胰蛋白酶标准品对荧光底物R28完全酶解时荧光值为纵座标，建立荧光底物酶解转化的标准曲线（见附图2）。根据不同浓度底物反应完全后对应的荧光值（RFU）建立标准曲线，得到转化1微摩尔荧光底物对应的Rfu值，用于计算实际酶解反应中的酶活力，根据附图2得到的结果为转化荧光底物2.7×10^-5微摩尔会产生荧光值为1RFU。

第四步：测定昆虫中肠酶液或BBMV对荧光底物的酶解活力，计算出中肠酶液或BBMV中能直接作用于荧光底物R28的胰蛋白酶的活力。

(1)将第一步中提取得到的昆虫中肠酶液或BBMV与荧光底物反应，整个酶解反应体系如下：取96孔荧光酶标反应板在其中加入200μl甘氨酸－氢氧化钠缓冲液和5μl荧光底物溶液，最后加入10μl中肠酶液或BBMV溶液，将酶标反应板放入荧光酶标仪中，采用动力学法进行检测。荧光酶标仪事先设定好激发波长λex=336nm，发射波长λem=490nm，反应温度30℃，读数时间15分钟，开始读数前先在酶标仪内对酶标反应板振荡1分钟。反应后得到酶促反应曲线的斜率，以mRfu/min作为单位。采用标准的考马斯亮蓝染色法标定出参与反应的中肠酶液或BBMV的蛋白浓度。

(2)根据酶活力国际单位的相关规定:在特定条件下（本发明中设定为30℃），1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量，称为一个国际单位(IU,又称U)。本发明中将1分钟内转化1微摩尔荧光底物R28定义为1个酶活力单位。

将(1)中得到的中肠酶液对荧光底物的酶解活力，代入第三步获得的荧光值RFU与荧光底物R28摩尔数的变化关系，得出中肠酶液或BBMV中中能直接作用于荧光底物的胰蛋白酶的活力，从而明确中肠酶液或BBMV对苏云菌芽孢杆菌Cry1A类原毒素的酶解能力，并进行不同种群的比较。

如棉铃虫的SCD品系和AY2品系，分别提取其中肠的酶液和BBMV，检测其对荧光底物R28的酶解能力，通过此反应得到的酶解活力结果如表1，从表中可以得出AY2品系中肠酶液对荧光底物的酶解活力是SCD品系的1.4倍，而BBMV的酶解活力AY2品系只有SCD品系的0.3，从而表明两个品系对Cry1A类原毒素的酶解能力的差异。

表1不同品系酶源对荧光底物酶解能力的差异

Claims (6)

1.一种用于检测昆虫中肠胰蛋白酶活力的荧光多肽底物R28，其特征在于组成为：荧光淬灭基团-Gly-GLy-Glu-Arg-Ile-Glu-Thr-Gly-Glu-荧光基团。

2.根据权利要求1所述的荧光多肽底物R28，其特征在于所述的荧光淬灭基团为Dabcyl和所述的荧光基团为Edans。

3.权利要求1所述的荧光多肽底物R28在检测直接作用于活化苏云菌芽孢杆菌Cry1A类原毒素的昆虫中肠胰蛋白酶活力中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的昆虫来自于不同种群。

5.一种检测昆虫中肠酶液对苏云菌芽孢杆菌Cry1A类原毒素酶解能力的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）提取鳞翅目昆虫幼虫中肠的酶液或刷状缘膜囊泡；

2）利用胰蛋白酶标准品建立其对权利要求1所述的荧光多肽底物R28酶解反应的标准曲线；

3）测定昆虫中肠酶液对荧光底物的酶解活力，对照标准曲线，计算出中肠酶液中能直接作用于荧光底物R28的胰蛋白酶的浓度，从而明确中肠酶液对所述苏云菌芽孢杆菌Cry1A类原毒素的酶解能力。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的鳞翅目昆虫来自不同种群。