CN103897691A - 细菌感染早期诊断的活体检测探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细菌感染早期诊断的活体检测探针的合成和应用领域，具体涉及可以特异性靶向到多种细菌的可示踪半乳糖化近红外荧光探针的合成和应用。本发明以D-氨基半乳糖盐酸盐，近红外荧光染料吲哚花菁绿为主要原料，采用共价连接法制备半乳糖化复合物，使其对细菌具有靶向诊断作用。经实验证明本发明所合成的探针安全有效，可快速到达活体的细菌感染部位，并可作为多种细菌感染的检测探针，有着很好的应用前景。若与抗生素药物相连，则可把药物靶向输送到细菌感染部位，直接杀死细菌，减少对正常组织和细胞的毒副作用。

Description

细菌感染早期诊断的活体检测探针

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及细菌感染的早期诊断的活体检测探针的合成和应用领域，涉及可以特异性靶向到多种细菌的可示踪半乳糖化近红外荧光探针的合成和应用。

背景技术

据世界卫生组织统计，世界上25%的死亡是由细菌感染性疾病引起的（Journal ofClinical Investigation,2003,111(9):1265-1273）。尽管抗生素治疗对杀伤病原菌有良好效果，但同时会使机体免疫力下降，诱发二重感染、毒副反应等（中国生化药物杂志,2012,33(3):326-328）。更严重的是，目前无论是否是细菌性炎症，都用抗生素，不仅耽误疾病的治疗，还诱导产生大量耐药细菌。到本世纪初全世界每年死于细菌感染的人数上升到2000万，大部分人死于耐药菌带来的用药困难。美国疾病预防控制中心（CDC）报道，美国超过一半抗生素处方药都是不必要的，而中国抗生素使用量是欧美的三四倍，50%中国人生病或与耐药细菌有关。世卫组织多次提醒中国，如再不遏制抗生素滥用，将不仅是中国的灾难，可能引发全人类的灾难。当人类面临传染病的时候，可能出现无药可用的危险状况（扬子晚报,A17,2013,9,20）。因此，鉴别细菌引起的感染是抑制抗生素滥用的最直接有效的方法。目前细菌感染的诊断仍处在晚期，只有当出现表征的时候才能确诊。诊断不及时导致治疗难上加难，抗菌治疗应根据病原体选择高针对性和敏感性的诊断和治疗方法，即靶向诊断和治疗。

FDG/PET法（The Journal of Nuclear Medicine.2001,42(9):1412-1417；Annals ofNuclear Medicine.1996,10(2):185-191）是早期诊断细菌感染性疾病的方法之一，但它最大的缺点是特异性差，无法靶向诊断。而In-WBC法标记白细胞(Bioorganic&MedicinalChemistry Letters.2012,22(8):2833-2836)，不足之处在于无法进行体内诊断，必须从体内提取白细胞。可见，传统诊断细菌感染的方法既不高效也不方便。针对这一大难题，各国科学家研发了各种细菌感染显像剂。

目前，细菌感染性疾病主要利用核医学及光学方法进行显像定位（同位素,2010,23(3):186-192；Current Pharmaceutical Design,2012(18):1098-1106）。如cFLFLFK-PEG-DOTA经⁶⁴Cu标记后结合特异性白细胞，通过PET成像可以准确检测出肺炎（Bioorganic&MedicinalChemistry Letters.2007,17(24):6876-6878）。但核医学显像制备过程复杂、耗时,还存在生物安全性问题。光学显像通过荧光染料标记靶向细菌的物质，构建光学探针。可在细菌感染部位高度聚集，通过检测荧光信号，确定细菌感染部位（药物生物技术,2006,13(4):306-309）。如使用近红外荧光基团Cy7标记cFLFLF，用于诊断耳炎（Bioorganic&MedicinalChemistry Letters.2010,20(12):3515-3517）。

目前虽然开发了众多的显像剂检测细菌,但无法检测到活体内少量的细菌，不能区分细菌感染和其他炎症，限制了其临床应用。

近红外成像方法（NIR optical imaging）使用650-900nm附近的近红外荧光，能进行深层组织成像且自发荧光背景较低，对癌症早期诊断表现出巨大潜力（Analytical Chemistry,2013,85(4):2529-2535.）。荧光探针与成像系统配合使用可获得肿瘤的大小及定位等信息，为癌症的诊断及治疗提供有效信息（东南大学学报,2011,30(2):380-383.）。总的来说，近红外成像有在体、无创、实时、无放射性、精细显像等优点。

目前国内外尚无利用半乳糖化近红外荧光探针与麦芽糖结合蛋白（Maltose-bindingproteins，MBPs）特异性结合应用于多种细菌感染的靶向诊断的报道。

发明内容

本发明公开了半乳糖化的有多种细菌靶向特性的可示踪近红外荧光探针。与其他荧光探针相比，本发明具有多细菌靶向性，可实现活体细菌感染成像，安全有效，作为一种新型靶向诊断细菌感染的荧光探针有很好的应用前景。本发明中的半乳糖化近红外荧光探针，其中半乳糖起靶向作用，使探针特异性进入细菌细胞内；近红外染料吲哚花菁绿起实时在位、精细显像的作用。

本发明的荧光探针，由近红外荧光染料和半乳糖通过共价键连接而成。其中近红外染料优选吲哚花菁绿。本发明荧光探针优选如下结构式：

本发明的荧光探针的制备方法，包括：近红外荧光染料溶于蒸馏水，搅拌溶解，加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，活化羧基；将D-氨基半乳糖盐酸盐溶于蒸馏水后滴加入活化液中，避光搅拌反应；反应液纯化，冷冻干燥，即得。简称Gal-MPA。

上述制备方法中，近红外荧光染料优选吲哚花菁绿（MPA）。

D-氨基半乳糖盐酸盐与近红外荧光染料的投料摩尔比优选1：1。

Gal-MPA溶于蒸馏水后进行紫外吸收和荧光发射光谱表征，显示其具有稳定的光学性质。紫外吸收光谱特征峰位是：782nm，见图1；荧光发射光谱特征峰位是：829nm，见图2。

细胞毒性实验表明，Gal-MPA的细胞毒性低，即使高浓度时仍对人体细胞没有明显毒性，是一种安全性高的近红外荧光探针，见图3。体内细菌靶向性的研究表明，Gal-MPA在给药4小时内在细菌感染小鼠显示快速和高亲和力的靶向性，在细菌感染部位停留时间长，见图4，表明它是一种很有前途的近红外荧光探针，具有快速的细菌靶向能力与细菌显像的能力。这样，半乳糖化的近红外荧光探针可用于细菌感染的早期诊断。且与抗生素药物相连后可将杀菌药物直接靶向到细菌内部，以减少药物对正常组织的毒副作用。

下面是部分本发明荧光探针的靶向性试验及结果：

细胞培养

将人类细胞系L02(正常的人肝细胞)于37℃、含5%的二氧化碳的培养箱孵育。培养于添加10%的FBS,100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素RPMI1640中。

细胞毒性

1）用L02细胞进行细胞增殖实验。细胞接种到96孔板(1×10⁴细胞/孔)，在培养条件下培养24小时。

2）细胞中添加溶于磷酸缓冲液PBS的Gal-MPA溶液，继续培养24小时，样品浓度范围为1.5625到100μg/mL。

3）每个孔中添加10μl噻唑蓝（MTT）溶液(5.0mg/mL)，再孵育4个小时。小心移除培养基中残留的MTT，将紫色结晶溶解于150μL二甲基亚砜（DMSO）。

4）震荡混匀十分钟后，所有测试样本用ELIASA检测，细胞活性用以下公式计算:细胞存活率=(样品组的平均吸光度-培养基孔的平均吸光度)/(溶剂组平均吸光度-培养基孔的平均吸光度)×100%。见图3，Gal-MPA对L02细胞没有毒性，即使在高浓度下3种细胞生存良好（n=6）。

细菌感染模型建立

ICR小鼠4到6周，在每只小鼠的腋窝肌肉注射100μl存于PBS的细菌悬浮液，约为5×10⁶个细菌。当细菌感染部位直径达到0.1cm时，可尾静脉注射样品，将细菌感染的小鼠固定，近红外荧光成像（n=6）。

本发明Gal-MPA对细菌感染小鼠的体内靶向能力

分别尾静脉注射给予细菌感染小鼠相同量的Gal-MPA。如图4所示，注射后0.5小时Gal-MPA的荧光信号分布在小鼠全身。4小时内可清楚地区分细菌感染部位，而周围的组织中荧光信号减弱。6小时后细菌感染部位荧光信号最强。且Gal-MPA可以在细菌感染部位内停留很长的时间。金黄色葡萄球菌感染部位的荧光信号持续到注射后96小时，大肠杆菌感染部位的荧光信号持续到注射后48小时。体内靶向性评价表明，Gal-MPA可迅速达到细菌感染部位且停留在细菌感染很长一段时间，且无论细菌感染是在早期或晚期进行检测，细菌感染部位的荧光信号都很明显。

附图说明

图1是本发明半乳糖化近红外荧光探针（Gal-MPA）的紫外吸收光谱

图2是本发明半乳糖化近红外荧光探针（Gal-MPA）的荧光发射光谱

图3是本发明半乳糖化近红外荧光探针（Gal-MPA）对人体正常细胞（L02）增殖的影响

图4是本发明半乳糖化近红外荧光探针（Gal-MPA）对多种细菌的体内靶向性（A.正常小鼠,B.金黄色葡萄球菌感染小鼠,C.大肠杆菌感染小鼠）

具体实施方式

实施例1

Gal-MPA的合成

MPA活化：MPA5.0mg溶于2.0mL二甲基甲酰胺（DMF）,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）4.8mg和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)0.6mg，室温避光搅拌过夜。

Gal-MPA的合成：氨基半乳糖1.1mg溶于2.0mL吡啶，滴加入上述MPA活化液，室温避光搅拌过夜。冷冻旋转蒸发除吡啶。薄层层析初步鉴定反应产物。反应产物经透析，葡聚糖凝胶G10纯化，冷冻干燥后得Gal-MPA。一定量的Gal-MPA溶于蒸馏水后进行紫外吸收和荧光发射光谱表征，显示其具有稳定的光学性质。紫外吸收光谱见图1，荧光发射光谱见图2。

实施例2

细胞培养

将人类细胞系L02(正常的人肝细胞)于37℃、含5%的二氧化碳的培养箱孵育。培养于添加10%的FBS,100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素RPMI1640中。

实施例3

细胞毒性

5）用L02细胞进行细胞增殖实验。细胞接种到96孔板(1×10⁴细胞/孔)，在培养条件下培养24小时。

6）细胞中添加溶于磷酸缓冲液PBS的Gal-MPA溶液，继续培养24小时，样品浓度范围为1.5625到100μg/mL。

7）每个孔中添加10μl噻唑蓝（MTT）溶液(5.0mg/mL)，再孵育4个小时。小心移除培养基中残留的MTT，将紫色结晶溶解于150μL二甲基亚砜（DMSO）。

8）震荡混匀十分钟后，所有测试样本用ELIASA检测，细胞活性用以下公式计算:细胞存活率=(样品组的平均吸光度-培养基孔的平均吸光度)/(溶剂组平均吸光度-培养基孔的平均吸光度)×100%。见图3，Gal-MPA对L02细胞没有毒性，即使在高浓度下3种细胞生存良好（n=6）。

实施例4

细菌感染模型建立

ICR小鼠4到6周，在每只小鼠的腋窝肌肉注射100μl存于PBS的细菌悬浮液，约为5×10⁶个细菌。当细菌感染部位直径达到0.1cm时，可尾静脉注射样品，将细菌感染的小鼠固定，近红外荧光成像（n=6）。

实施例5

Gal-MPA对细菌感染小鼠的体内靶向能力

分别尾静脉注射给予细菌感染小鼠相同量的Gal-MPA。如图4所示，注射后0.5小时Gal-MPA的荧光信号分布在小鼠全身。4小时内可清楚地区分细菌感染部位，而周围的组织中荧光信号减弱。6小时后细菌感染部位荧光信号最强。且Gal-MPA可以在细菌感染部位内停留很长的时间。金黄色葡萄球菌感染部位的荧光信号持续到注射后96小时，大肠杆菌感染部位的荧光信号持续到注射后48小时。体内靶向性评价表明，Gal-MPA可迅速达到细菌感染部位且停留在细菌感染很长一段时间，且无论细菌感染是在早期或晚期进行检测，细菌感染部位的荧光信号都很明显。

Claims (6)

1.一种荧光探针，由近红外荧光染料和半乳糖通过共价键连接而成。

2.权利要求1的荧光探针，其中近红外染料是吲哚花菁绿。

3.权利要求2的荧光探针，其结构式为：

4.权利要求1的荧光探针的制备方法，包括：近红外荧光染料溶于蒸馏水，搅拌溶解，加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，活化羧基；将D-氨基半乳糖盐酸盐溶于蒸馏水后滴加入活化液中，避光搅拌反应；反应液纯化，冷冻干燥，即得。

5.权利要求4的制备方法，其中D-氨基半乳糖盐酸盐与近红外荧光染料的投料摩尔比为1：1。

6.权利要求1、2或3的荧光探针用于制备诊断细菌感染的试剂盒的用途。

Images