CN103860538B - 靶向人La蛋白的先导化合物及其在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属制药领域，涉及靶向人La蛋白的先导化合物及其在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的用途。本发明通过对靶标La蛋白增加HBV？RNA稳定性的研究，筛选得到式（Ⅰ）的靶向人La蛋白的先导化合物，经试验显示，所述的先导化合物具有较强的抗病毒活性，和具有靶向La蛋白的作用。本发明的先导化合物可进行进一步的结构优化，具有较好的应用前景；所述的先导化合物及其衍生物可用于制备抗乙型肝炎病毒的药物，也可用于制备以La蛋白为靶标的药物。
Description
本申请为发明名称：靶向人La蛋白的先导化合物及其在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的用途，申请号：2011100712125，申请日：2011年3月23日的分案。
技术领域
本发明属制药领域，涉及靶向人La蛋白的先导化合物的新的药用用途，具体涉及靶向人La蛋白的先导化合物在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的用途。
背景技术
已知乙型肝炎是严重威胁人类健康的传染病之一。据美国Hollinger统计报告，乙肝病毒呈全球性分布，目前世界上约有3.5亿HBV慢性携带者，每年约有100万人死于HBV引起的疾病。我国属于HBV感染的高流行区域。2007年《中国卫生统计年鉴》显示，我国病毒性肝炎的发病率已由2000年的64.91/10万人上升至2006年的102.09/10万人，慢性乙肝患者达2000多万人，约占人口总数的1.6%左右；其中，乙肝病毒表面抗原携带率高达9.8%，总人数高达1亿多人。《中国慢性乙型肝炎防治指南》中将阿德福韦酯、恩替卡韦和拉米夫定推荐为全国抗乙肝病毒的一线用药，这些核苷与核苷酸类似物通过抑制HBVDNA的复制，达到缓解或治疗乙肝的作用。
随着药物应用面的拓宽和用药人群的增加，国内外相继报道拉米夫定等核苷类药物长期用药后，存在着病人顺应性问题和诸多不良反应，其耐药率已达到69%；由于所述药物敏感性的下降，在少数免疫功能缺陷病人中出现了HBVDNA聚合酶基因发生突变的病毒株，导致了体内病毒变异和病情恶化现象，从而限制其长期应用。
在开发新药中常用到虚拟筛选（virtualscreening）的方法，该方法通过计算法筛选出可能有治疗效用的化学分子。目前应用较为广泛的是对药物的标靶（target）利用X-ray绕射或核磁共振（NMR）的实验，或运用生物信息结构预测的方法，得到标靶的三维高分辨率结构后，再进行虚拟筛选。药物虚拟筛选成功的必要条件有三个：(1)足够大的化学空间（chemicalspace），(2)准确的评分函数（scoringfunction），(3)高效率的搜寻演算法（searchingalgorithm）；所述的化学空间，即所用的化学数据库；广义来讲，化学空间则包括配体（ligand）和受体较可能存在的构形（conformation）；所述的评分函数，其设计主要是从蛋白质结构数据库（ProteinDatabank，http://www.pdb.org）中寻找分辨率较好的配体与受体的结合体（complex），运用一些能量的计算，加上诸如多变量线性回归（multivariatelinearregression）的统计方法，建立一个准确的数学函数，并可快速有效地推测未知的配体对一给定的受体是否可稳定地结合，甚至预测结合强度（bindingaffinity）或结合的自由能（bindingfreeenergy）。上述评分函数是根据配体分子相对于受体做平移（translation）、旋转（rotation）、或者是构形变化（conformationalchanges）时十分复杂的能量变化情形，寻找具有最佳评分值的结合模式。
有研究指出，磷酸化是La蛋白的活性形式，La蛋白有助于增加HBVRNA的稳定性。迄今为止，尚未见有关针对La蛋白结合机制设计的生物学或化学治疗药物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供靶向人La蛋白的先导化合物的新的药用用途，具体涉及靶向人La蛋白的先导化合物在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的用途。
本发明在对靶标La蛋白增加HBVRNA稳定性的研究基础上，筛选得到具有新结构实体的靶向人La蛋白的先导化合物，所述的靶向人La蛋白的先导化合物为针对La与RNA结合位点的小分子结构的化合物。
本发明中，所述的先导化合物是HBSC11或15或34，具有式（Ⅰ）的化学结构:
本发明中，La蛋白（基因编号NM003142，查询来源于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_003142）与HBVDNA复制密切相关，实验证实La蛋白部分位点的突变或基因沉默，对La蛋白与HBVRNA的结合产生重大影响，使HBV更容易降解。
本发明依据人肝脏病理组织免疫组化筛选结果，即乙肝组织中磷酸化La高表达，正常肝组织中磷酸化La低表达的结果，采用计算机虚拟筛选，通过基于La蛋白结构（http://www.pdb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2VOD）的药物分子设计和虚拟筛选的方法，经Glide5.5分子对接软件进行虚拟筛选，通过多因素评分，筛选出26个先导化合物具有与人La潜在结合力的先导化合物，再进行打分函数评分、柔性分析、结构式的未来改造可能性、对HBVDNA、HBeAg、HBsAg的抑制率、及与La蛋白的结合能力综合分析，获得具有药理活性的先导化合物HBSC11、15、34。
本发明中，所述的先导化合物HBSC11、15、34的可通过下述合成路径制得：（1）HBSC11（化学名称：吡唑[1,5-a]并吡啶-2-甲酸甲酯，methylpyrazolo[1,5-a]pyridine-2-carboxylate）：
（2）HBSC15（化学名称：1-环丙基-1氢咪唑并[4,5-c]吡啶-2酮，1-cyclopropyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2(3H)-one）：
（3）HBSC34（化学名称：(S)-2-苄氧羰基-2-环戊烷氨-1-丁酸-2-(1-甲氧基(甲基))酰胺，(S)-benzylcyclopentyl(1-(methoxy(methyl)amino)-1-oxobutan-2-yl)carbamate）：
本发明的先导化合物HBSC11、15、34经实验证实，在体外有较显著的抗乙肝病毒活性，尤其是吡啶并吡唑类先导化合物HBSC11，对人HepG2.2.15细胞株表达的HBVDNA和HBeAg有较强抑制作用；westernblotting实验结果显示，化合物HBSC-11能抑制La蛋白表达，结果表明，本发明的先导化合物HBSC11、15、34尤其是先导化合物HBSC11（吡啶并吡唑类化合物）可进一步的结构优化，制备抗乙肝病毒活性的制剂或药物。
本发明的靶向人La蛋白的先导化合物的优点有：
1，具有较强的抗病毒活性和靶向La蛋白的作用；
2，所述的先导化合物及其衍生物可用于制备抗乙肝病毒活性或治疗乙型肝炎的制剂或药物；
3，以及用于制备以La蛋白为靶标的药物。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的靶向人La蛋白的先导化合物进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1显示了本发明虚拟筛选得出的26个先导化合物对HepG2.2.15细胞中HBVDNA的抑制作用，其中，HBSC-4、11、13、14、15、16、17、19、21、22、25、34的十二个化合物病毒抑制效果较好。
图2显示了本发明虚拟筛选得出的26个先导化合物对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制作用，其中，HBSC-1、5、11、15、27、34的六个化合物对HBeAg抑制效果较好。
图3显示了本发明虚拟筛选得出的26个候选化合物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的影响，其中，HBSC-1、4、11、13、15、19、20、22、25、26、28、31、34的十三个化合物对HBeAg抑制效果较好。
图4显示了本发明所述的先导化合物对HepG2.2.15细胞中La蛋白的抑制作用，其中，HBSC11明显下调细胞内La蛋白表达量。
图5是本发明的先导化合物的化学结构式，其中，碳原子为浅灰色，氢原子为白色，氧原子为灰色，氮原子为深色，化合物显示为棍棒形式。
图6显示了La蛋白结合位点包含Gln20,Tyr23,Arg57,Leu124,Asn139和Ile140，其中，HBSC11的两个氢原子与Asn139和Ile140的主链结合,HBSC15的两个氢原子与Gln20和Arg57侧链的氮原子结合，HBSC34的一个氢原子与Arg57侧链的一个氮原子结合。
具体实施方式
实施例1
1、筛选流程
（1）蛋白准备
根据La蛋白和RNA复合物晶体结构（PDB编号2VOD，从蛋白数据库ProteinDataBank下载获得），使用Pymol软件删除晶体结构中的水分子。删除其中一个单体以及与其结合的RNA，保留另一个单体及其结合的RNA，并且只留下了RNA结合口袋最深处的一个尿嘧啶核苷酸（U），删除其它的核苷酸。然后应用Maestrov7.5软件（Schrodinger,Inc.）中的“蛋白准备”模块来完成一系列的蛋白准备工作，包括加氢、修补缺失的残基以及结构最小化（minimizingthestructure）等。最后选取留下的尿嘧啶核苷酸作为“参考配体”（referenceligand），利用Maestrov7.5软件中的“receptorgridgeneration”程序生成对接口袋文件，晶格（grid）大小为15
（2）配体准备
从SPECS化学数据库（网址：http://www.specs.net/）中下载得到大约280000个化合物的三维结构，将大约5000个in-house化合物和SPECS化学数据库整合到一起，最后利用Maestrov7.5软件中的“配体准备”模块得到优化后的大约330000个化合物结构。（3）分子对接
利用Maestrov7.5软件的Glide模块进行分子对接。首先选用SP（Standard-Precision）精度，用优化后的330000个化合物结构去对接定义好对接口袋的La蛋白，根据GlideSP的打分机制，得到打分前10000的化合物。然后再选用XP（Extra-Precision）精度来对接这10000个化合物，得到约9900个化合物。之后，将SP和XP得到的化合物进行聚类，通过肉眼挑选（visualinspection）了26个化合物用于下一步活性测试，其中10个是从SPECS公司购买得到，另16个化合物来自于我们的in-house化合物库。最后得到3个有活性的化合物，其中HBSC-11活性最好。
2.虚拟筛选的26个先导化合物对HBVDNA复制的影响
将26个先导化合物以50μM浓度干预HepG2.2.15细胞24h，采用荧光定量PCR法检测细胞上清液中HBVDNA水平。
如图1所示，虚拟筛选得出的26个先导化合物对HepG2.2.15细胞中HBVDNA的抑制作用，其中，HBSC-4、11、13、14、15、16、17、19、21、22、25、34的十二个化合物病毒抑制效果较好，与空白对照组相比有显著性差异。
3.虚拟筛选的26个先导化合物对HBeAg表达的影响
将26个先导化合物以50μM浓度干预HepG2.2.15细胞24h，采用电化学发光技术检测细胞上清液中HBeAg水平。
如图2所示，虚拟筛选得出的26个先导化合物对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制作用，其中，HBSC-1、5、11、15、27、34的六个化合物对HBeAg抑制效果较好，与空白对照组相比有显著性差异。
4.虚拟筛选的26个先导化合物对HBsAg表达的影响
如图3所示，虚拟筛选得出的26个候选化合物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的影响，其中，HBSC-1、4、11、13、15、19、20、22、25、26、28、31、34的十三个化合物对HBeAg抑制效果较好，与空白对照组相比有显著性差异。
5.生物活性验证的3个先导化合物对人La蛋白表达的影响
将3个先导化合物以50μM浓度干预HepG2.2.15细胞24h，提取核蛋白，采用免疫印记技术检测细胞核中La蛋白表达量。
如图4所示，综合上述实验的结果表明，所述的3个化合物对HepG2.2.15细胞中La蛋白的抑制作用，其中，HBSC11明显下调细胞内La蛋白表达量，与空白对照组相比有显著性差异。
6.应用Glide5.5分子对接软件进行评分
表1
结果表明，DockingScore越小，先导化合物和La蛋白结合能力越强。
结果证实，本发明的先导化合物HBSC11、15、34在体外有较显著的抗乙肝活性，尤其是吡啶并吡唑类先导化合物HBSC11，对人HepG2.2.15细胞株表达的HBVDNA和HBeAg有较强抑制作用，在westernblotting实验中，HBSC-11能抑制La蛋白表达，结合化合物分子结构式与La结合情况的评分与结构分析，表明本发明的先导化合物可进行进一步的结构优化；所述的先导化合物及其衍生物可用于制备抗乙型肝炎的药物，也可用于制备以La蛋白为靶标的药物。
实施例2
本发明的先导化合物HBSC11、15、34的合成路径
（1）HBSC11的化学名称为吡唑[1,5-a]并吡啶-2-甲酸甲酯，其合成路径为：
（2）HBSC15的化学名称为1-环丙基-1氢咪唑并[4,5-c]吡啶-2酮，其合成路径为：
（3）HBSC34的化学名称为(S)-2-苄氧羰基-2-环戊烷氨-1-丁酸-2-(1-甲氧基(甲基))酰胺，其合成路径为：
Claims (4)
1.式(Ⅰ)结构的靶向人La蛋白的先导化合物HBSC34在制备抗乙肝病毒药物中的用途，
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的先导化合物HBSC34为针对La蛋白与RNA结合位点的小分子结构的化合物。
3.权利要求1中的式(Ⅰ)结构的靶向人La蛋白的先导化合物HBSC34在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途。
4.权利要求1中的靶向人La蛋白的先导化合物HBSC34的制备方法，其特征在于，通过下述合成路径制得：
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