CN103808781B - 一种在电极表面固定电化学发光体的方法 - Google Patents

一种在电极表面固定电化学发光体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在电极表面固定电化学发光体的方法，特点是具体步骤如下：将电化学发光体溶液和氨基酸溶液加入到缓冲溶液中混匀得到混合液，通氮除氧5～8min；将电极置于混合液中，然后在电极上施加+1.8～+2.2V电位持续10～240s，即完成在电极表面稳定固定电化学发光体，所述的电化学发光体的结构式为MP3X2，其中M为Ru，P为配体，3个配体中至少有一个为含氨基的衍生物，X为一价阴离子，优点是电化学发光性能良好、稳定性优异、操作简单、时间短、所需设备简单并且成本低，易于后续开发。

Description

一种在电极表面固定电化学发光体的方法
技术领域
本发明涉及电化学发光检测领域，尤其是涉及一种在电极表面固定电化学发光体的方法。
背景技术
电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL），是指采用电极对含有电化学发光体的体系施加一定的电压或电流，使电化学发光体通过参与电化学反应获得能量后跃迁到激发态、再返回到基态时产生的发光现象。作为一种将电化学与化学发光相结合的分析技术，电化学发光不仅具有化学发光分析法的灵敏度高、线性范围宽、观察方便、仪器简单等优点，而且具有电化学分析法的电位可控性强、选择性高、试剂稳定、重现性好等优点，已受到科研工作者的极大关注，并逐渐发展成为分析检测领域的重要分支。
按照电化学发光体的结构，电化学发光体系可以分为酰肼、吖啶、多环芳香烃、过氧化草酸酯和金属配合物五类，其中以钌为中心体的金属配合物的电化学发光应用最为广泛。自1972年Bard等报道了三联吡啶钌的电化学发光以来，以钌为中心体的金属配合物的电化学发光受到极大的关注。除发光效率高、检测灵敏度高、线性范围宽、稳定性好、无背景等优点外，以钌为中心体的金属配合物还有一个重要的特点，就是其电化学和电化学发光的可逆性。也就是说，此类电化学发光体经过了一个电化学和电化学发光过程之后，又可以回到其初始的状态。这就意味着，如果把此类电化学发光体固定在电极表面，至少可以有如下几个显著的优点：一、无需不断地将电化学发光体从溶液输送到电极表面以维持电化学发光，可减少昂贵试剂的消耗；二、减少了溶液体系的影响，可以提高检测的灵敏度、稳定性；三、可以用于方便地设计便宜、高效、可再生的电化学发光传感器，简化实验装置。因此，自1990年代以来，人们一直在尝试采用不同材料和方法将此类电化学发光体直接固定到电极表面。
目前在电极表面直接固定电化学发光体采用的方法有：Langmuir-Blodgett膜法、分子自组装膜法、Nafion膜法、溶胶-凝胶法、电极表面巯基功能化结合电化学发光体-Au纳米粒子聚集体法、聚合物/碳纳米管复合物膜法、石墨烯吸附法等，但这些方法普遍操作繁琐，且各有明显不足之处：Langmuir-Blodgett膜法为物理吸附，易脱附，稳定性差，所用设备昂贵；分子自组装膜法、电极表面巯基功能化结合电化学发光体-Au纳米粒子聚集体法使用具有一定还原性的巯基，电化学响应不可逆、不稳定，在较正电位时易脱附；Nafion膜法、聚合物/碳纳米管复合物膜法的膜较为致密，导电性差，电子传递困难，即使加入碳纳米管也改善有限，稳定性也不好；溶胶-凝胶法将电化学发光体固定在凝胶膜内，但凝胶孔穴的孔径通常大于小体积的电化学发光体，因此泄漏现象难免；石墨烯吸附法采用石墨烯通过π—π作用吸附电化学发光体，作用力弱，难以获得稳定的结果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种电化学发光性能良好、稳定性优异、操作简单、时间短、所需设备简单并且成本低的在电极表面固定电化学发光体的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种在电极表面固定电化学发光体的方法，具体步骤如下：将电化学发光体溶液和氨基酸溶液加入到缓冲溶液中混匀得到混合液，通氮除氧5～8min；将电极置于混合液中，然后在电极上施加+1.8～+2.2V电位持续10～240s，即完成在电极表面稳定固定电化学发光体，所述的电化学发光体的结构式为MP3X2，其中M为Ru；P为配体，3个配体中至少有一个为含氨基的衍生物；X为一价阴离子。
所述的混合液中电化学发光体的浓度为10-6～10-4M，所述的混合液中氨基酸的浓度为10-3～10-2M。
所述的含氨基的衍生物为联吡啶的含氨基的衍生物或/和邻菲啰啉的含氨基的衍生物。
所述的配体还包括联吡啶或/和邻菲啰啉。
所述的一价阴离子为六氟磷酸根离子或者氯离子。
所述的缓冲溶液为0.05～0.5M的pH3～5的邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液，0.05～0.5M的pH5～6的乙酸-乙酸铵缓冲溶液，0.05～0.5M的pH6～8的磷酸盐缓冲溶液，0.05～0.5M的pH7～9的Tris缓冲溶液或者0.05～0.5M的pH9～11的碳酸盐缓冲溶液。
所述的氨基酸为赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天冬氨酸中的至少一种。
所述的电极为玻碳电极、石墨电极、ITO电极和贵金属电极中的任一种。
发明原理：氨基酸中有氨基和羧基，电化学发光体中有氨基，电极插入氨基酸和电化学发光体的混合溶液中，给电极施加+1.8～+2.2V的电位，在该电位下，氨基酸和电化学发光体中的氨基同时发生氧化，进而均与羧基发生反应形成酰胺键，大量的氨基酸首尾相连形成氨基酸聚合物膜于电极表面，电化学发光体也通过上述的酰胺键共聚于该聚合物膜中，得以稳定固定于电极表面。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)电化学发光性能良好。氨基酸聚合物膜导电性良好，故不存在电子传递困难问题。
(2)稳定性优异。电化学发光体通过化学键共聚于氨基酸聚合物膜，稳定结合到电极表面，电化学、电化学发光的反应可逆性良好，也不存在脱附、泄漏现象。
(3)操作简单。一步即可完成。
(4)时间短。最多几分钟即可完成。
(5)所需设备简单。一台恒电位仪即可。
(6)成本低。除电化学发光体外，仅需价格低廉的氨基酸等试剂。
(7)易于后续开发。氨基酸聚合物膜表面富含氨基、羧基，易于作为基底连接蛋白质、核酸、多肽、纳米颗粒等，开发出新型电化学发光传感器。
附图说明
图1为实施例1的表面固定电化学发光体电极的电化学发光图；
图2为实施例2的表面固定电化学发光体电极的电化学发光图；
图3为实施例3的表面固定电化学发光体电极的电化学发光图；
图4为实施例4的表面固定电化学发光体电极的电化学发光图；
图5为实施例5的表面固定电化学发光体电极的电化学发光图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例1
取0.0001M的双(2,2’-联吡啶)-(5-(2-氨基乙基)邻菲啰啉)双(六氟磷酸)钌溶液100μL、0.1M赖氨酸溶液100μL，加入9.8mL0.05MpH=9.0的Tris缓冲溶液混匀，通氮除氧5min。将玻碳电极放入该混合溶液，施加恒电位+1.8V于玻碳电极240s，取出玻碳电极，用水淋洗，即完成在电极表面固定电化学发光体双(2,2’-联吡啶)-(5-(2-氨基乙基)邻菲啰啉)双(六氟磷酸)钌。
采用表面固定电化学发光体的玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统，插入含0.1MK2S2O8的0.1MKCl溶液中，测定电化学发光，结果如图1所示，电化学发光强度高、稳定性好。
具体实施例2
取0.001M双(2,2’-联吡啶)-(4,4’-二(2-氨基乙基)联吡啶)双(六氟磷酸)钌溶液1mL、0.1M谷氨酸溶液1mL，加入8mL0.3MpH=4.0的邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液，混匀，通氮除氧8min。将铂盘电极放入该混合溶液，施加恒电位+2.2V于铂盘电极10s，取出铂盘电极，用水淋洗，即完成在电极表面固定电化学发光体双(2,2’-联吡啶)-(4,4’-二(2-氨基乙基)联吡啶)双(六氟磷酸)钌。
采用表面固定电化学发光体的铂盘电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统，插入含0.1MK2S2O8的0.1MKCl溶液中，测定电化学发光，结果如下图2所示，电化学发光强度高、稳定性好。
具体实施例3
取0.0001M的(2,2’-联吡啶)-(4,4’-二(3-氨基丙基)联吡啶)-邻菲啰啉二氯化钌溶液300μL、0.1M丝氨酸溶液300μL，加入9.4mL0.5MpH=9的碳酸盐缓冲溶液，混匀，通氮除氧6.5min。将石墨电极放入该混合溶液，施加恒电位+2.0V于石墨电极24s，取出石墨电极，用水淋洗，即完成在电极表面固定电化学发光体(2,2’-联吡啶)-(4,4’-二(3-氨基丙基)联吡啶)-邻菲啰啉二氯化钌。
采用表面固定电化学发光体的石墨电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统，插入含0.1MK2S2O8的0.1MKCl溶液中，测定电化学发光，结果如图3所示，电化学发光强度高、稳定性好。
具体实施例4
取0.001M双邻菲啰啉-(5-(2-氨基乙基)邻菲啰啉)二氯化钌溶液0.5mL、0.1M苏氨酸溶液0.5mL，加入9mL0.1MpH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，混匀，通氮除氧7min。将ITO电极放入该混合溶液，在电极上施加+1.8～+2.2V电位区间以10mV/s扫速循环伏安扫描240s，取出ITO电极，用水淋洗，即完成在电极表面固定电化学发光体双邻菲啰啉-(5-(2-氨基乙基)邻菲啰啉)二氯化钌。
采用表面固定电化学发光体的ITO电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统，插入含0.1MK2S2O8的0.1MKCl溶液中，测定电化学发光，结果如图4所示，电化学发光强度高、稳定性好。
具体实施例5
取0.0001M的(2,2’-联吡啶)-(4,4’-二(3-氨基丙基)联吡啶)-(5-(2-氨基乙基)邻菲啰啉)双(六氟磷酸)钌溶液500μL、0.1M天冬氨酸溶液500μL，加入9.0mL0.2MpH=5的乙酸-乙酸铵缓冲溶液，混匀，通氮除氧8min。将玻碳电极放入该混合溶液，在电极上施加+1.8～+2.2V电位区间以50mV/s扫速循环伏安扫描120s，取出玻碳电极，用水淋洗，即完成在电极表面固定电化学发光体(2,2’-联吡啶)-(4,4’-二(3-氨基丙基)联吡啶)-(5-(2-氨基乙基)邻菲啰啉)双(六氟磷酸)钌。
采用表面固定电化学发光体的玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统，插入含0.1MK2S2O8的0.1MKCl溶液中，测定电化学发光，结果如图5所示，电化学发光强度高、稳定性好。
除上述实施例外，缓冲溶液还包括0.05～0.5M的pH3～5的邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液中0.05～0.5M内的其它任一浓度和pH3～5内的其它任一pH值，
或者0.05～0.5M的pH5～6的乙酸-乙酸铵缓冲溶液中0.05～0.5M内的其它任一浓度和pH5～6内的其它任一pH值，
或者0.05～0.5M的pH6～8的磷酸盐缓冲溶液中0.05～0.5M内的其它任一浓度和pH6～8内的其它任一pH值，
或者0.05～0.5M的pH7～9的Tris缓冲溶液中0.05～0.5M内的其它任一浓度和pH7～9内的其它任一pH值，
或者0.05～0.5M的pH9～11的碳酸盐缓冲溶液中0.05～0.5M内的其它任一浓度和pH9～11内的其它任一pH值。
除上述实施例外，氨基酸还包括赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天冬氨酸中的至少一种以上组合。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (7)

1.一种在电极表面固定电化学发光体的方法，其特征在于具体步骤如下：将电化学发光体溶液和氨基酸溶液加入到缓冲溶液中混匀得到混合液，通氮除氧5～8min；将电极置于混合液中，然后在电极上施加+1.8～+2.2V电位持续10～240s，即完成在电极表面稳定固定电化学发光体，所述的电化学发光体的结构式为MP3X2，其中M为Ru；P为配体，3个配体中至少有一个为含氨基的衍生物；X为一价阴离子，所述的氨基酸为赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天冬氨酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的一种在电极表面固定电化学发光体的方法，其特征在于：所述的混合液中电化学发光体的浓度为10-6～10-4M，所述的混合液中氨基酸的浓度为10-3～10-2M。
3.根据权利要求2所述的一种在电极表面固定电化学发光体的方法，其特征在于：
所述的含氨基的衍生物为联吡啶的含氨基的衍生物或/和邻菲啰啉的含氨基的衍生物。
4.根据权利要求3所述的一种在电极表面固定电化学发光体的方法，其特征在于：所述的配体还包括联吡啶或/和邻菲啰啉。
5.根据权利要求2所述的一种在电极表面固定电化学发光体的方法，其特征在于：所述的一价阴离子为六氟磷酸根离子或者氯离子。
6.根据权利要求2所述的一种在电极表面固定电化学发光体的方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为0.05～0.5M的pH3～5的邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液，0.05～0.5M的pH5～6的乙酸-乙酸铵缓冲溶液，0.05～0.5M的pH6～8的磷酸盐缓冲溶液，0.05～0.5M的pH7～9的Tris缓冲溶液或者0.05～0.5M的pH9～11的碳酸盐缓冲溶液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的一种在电极表面固定电化学发光体的方法，其特征在于：所述的电极为玻碳电极、石墨电极、ITO电极和贵金属电极中的任一种。
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