CN103768561A - 止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞el4细胞增殖药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用及止眩安神片的制备方法。本发明的止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得淫羊藿苷含量有很大提高。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用及止眩安神片的制备方法。
背景技术
止眩安神颗粒标准号WS-11411（ZD-1411）-2002，记载于国家中成药标准汇编内科脾胃分册。由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，具有补肝肾，益气血，安心神的功效。用于肝肾不足，气血亏损所致的眩晕，耳鸣，失眠，心悸。
现有技术中，尚未有止眩安神颗粒在在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用的报道，也未见有止眩安神颗粒提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而挥发油提取，水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种止眩安神片的制备方法。
本发明的目的是通过如下的方案实现的：
止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，所述止眩安神片的制备方法由下列步骤组成：取干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量l-3ml/g生药·min，萃取时间300-340min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔 吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
优选的，上述的止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，所述止眩安神片的制备方法由下列步骤组成：取干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量l-3ml/g生药·min，萃取时间320min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
现有技术中，止眩安神颗粒每次1袋，每袋重5g（无糖型）或10g（有糖型），一日3次。止眩安神颗粒服药量大，且颗粒剂制备需要加大量的糖，糖尿病患者不适宜，不加糖的话味道不佳，患者不容易服下，依从性差。采用本发明方法制备成的止眩安神片每片重0.5g，每次仅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。且制备成片剂，患者随水吞下即可，服药量小且无苦味，患者易于接受。
试验一、不同方法制备的止眩安神片中淫羊藿苷含量的比较
l、仪器及试药本发明止眩安神片：按实施例1方法制备，使用2160g原料药，经提取制成200片，每片重0.5g。原止眩安神颗粒，按照WS-11411（ZD-1411）-2002标准方法制备。Agilent1200高效液相色谱仪；METTLER AE240电子分析天平；淫羊藿苷对照品（中国药品生物制品检定所）。
2、方法
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ D）测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水（26∶74）为流动相；检测波长为270nm。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于8000。
对照品溶液的制备 精密称取在105℃干燥至恒重的淫羊藿苷对照品适量，加70%乙醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本发明的止眩安神片，研细，取0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，称定重量，密塞，放置过夜，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
对照产品供试品溶液的制备 取本对照的止眩安神颗粒，研细，取4g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，称定重量，密塞，放置过夜，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3、结果
结果表明，本发明止眩安神片中淫羊藿苷的含量为3.5-6g/片；而原止眩安神颗粒中淫羊藿苷的含量为1.2mg/袋，每次服用量2片的淫羊藿苷含量为原颗粒剂含量的6-10倍，在服用量减少的情况下，淫羊藿苷含量有很大提高。
上述研究表明，采用本发明制备方法制备的止眩安神片，有效成分含量远远高于WS-11411（ZD-1411）-2002标准记载的方法制备的止眩安神颗粒。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
取鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g，将干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间320min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到 Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
经检测，成品中淫羊藿苷的含量为5.9mg/片。
实施例2
取鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g，将干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力30MPa，温度50℃，CO2流量3ml/g生药·min，萃取时间300min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
经检测，成品中淫羊藿苷的含量为3.6mg/片。
实施例3
取鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g，将干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO2流量1ml/g生药·min，萃取时间340min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
经检测，成品中淫羊藿苷的含量为4.5mg/片。
实施例4：止眩安神片抑制小鼠淋巴瘤细胞EL4细胞增殖的实验研究资料
1．实验材料
1.1 实验用细胞株
小鼠淋巴瘤细胞EL4细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
1.2 实验药物
研究药物：本发明止眩安神片：按实施例1方法制备。
药液储液：称取100mg止眩安神片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
1.3 实验试剂
DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061 Lot.No.758137)；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419）；NaHCO3(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033 Lot.No.1088387)；Trypsin（AMRESCO公司）；EDTA（AMRESCO公司）；Penicillin G Sodium Salt（AMRESCO公司1）；Streptomycin Sulfate(AMRESCO)；无水乙醇（淄博亚杜兰经贸有限公司）；MTT(Biosharp批号：0793)：PBS（实验室自配）；
1.4 实验器材
莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMIL）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190）；CO2培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Sprlng公司型号：S/N020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号：DHG9123A)；冰箱(西门子公司型号：KG18V21TI)；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
2．实验方法
1)EL4细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%CO2进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。
2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5%CO2)常规培养。
3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入止眩安神片溶液，继续培养24h。
4)24h后加入20μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
6)同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。
7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率(%)=（对照孔OD值-给药孔OD值）、对照孔OD值×100%。实验重复3次。
3．统计处理
采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±SD表示。
4．实验结果
MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对EL4细胞增殖抑制有差异(P<0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。
表1止眩安神片对EL4细胞增殖抑制影响研究(X±SD)
| 组别 | 药物浓度（mg/ml） | 抑制率（%） |
| 对照组 | 0 | 0 |
| 1 | 5 | 9.48±8.65 |
| 2 | 10 | 17.69±10.42* |
| 3 | 15 | 28.56±12.17** |
| 4 | 20 | 39.62±16.89** |
注：与对照组比较，*P<O.01；**P<0.001。
5．实验结论
本发明的止眩安神片可以抑制EL4细胞增殖，减少EL4细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。
Claims (2)
1.止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，其特征在于，所述止眩安神片的制备方法由下列步骤组成：取干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量l-3ml/g生药·min，萃取时间300-340min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
2.根据权利要求l所述的止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，其特征在于，所述止眩安神片的制备方法由下列步骤组成：取干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量l-3ml/g生药·min，萃取时间320min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
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