CN103760371A - 一种原奶细菌快速检测方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种原奶细菌快速检测方法及装置，其方法包括以下步骤：步骤一、将待测牛奶放入装有沉淀剂的离心管中，振荡离心管3~8秒；步骤二、将离心管放入离心机内作离心处理；步骤三、用注射器吸取离心管内液体中间层的清晰溶液，注入检测装置的样品池；步骤四、启动高速通道泵，使样品池中的样品液进入高速通道；步骤五、停止高速通道泵，启动采样泵，样品液进入样品流动槽；步骤六、显微摄像机对样品液进行图像采集，然后传送采集到的图像至加速器；步骤七、加速器对图像进行识别，计算样品液中的细菌含量。通过本方案可以实现对原奶细菌的快速准确检测，检测精度高。本方案适用于牛奶生产加工企业及检测部门。

Description

一种原奶细菌快速检测方法及装置

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，尤其是涉及一种低成本的原奶细菌快速检测方法及装置。

背景技术

对于人体有害的微生物常被称为细菌。细菌存在于世界上的任何角落。细菌主要是以气体、液体和固体三种物理形式与人类的接触。本发明可以用于这三种物理形式的细菌检测。但真正的检测过程是针对液体的。

对于固体物质来说，可以通过先将固体粉碎，然后溶解在液体里，再对液体做检测。

对于气体物质来说，通过洗气装置可以将空气中的物质融入液体中，然后再对液体做检测。

而在液体中，与人类关系最大的就是食用饮料。而在饮料中牛奶的检测是最复杂的。本发明以牛奶这种比较复杂的饮品检测流程为代表做发明细节的描述，同时牛奶也是重要人们的重要饮品。

食品质量是关乎千家万户的大事。牛奶质量是人们比较关注的食品安全问题。在牛奶质量问题中原料奶微生物超标是最常见的问题。这一现象与下列因素有关：

1、供应原料奶的奶场地点分散，奶场主性质多样，管理困难；

2、送奶路程遥远，监控困难；

3、收奶站检测手段落后，时间滞后，无法及时发现问题奶；

4、原奶收集过程中的设备管理困难，容易出现污染。

由于原奶质量无保障，造成奶制品质量下降。这是我国奶制品质量水平偏低的主要原因。解决这一问题的技术手段是配备快速检测设备。但是目前是做不到的，主要原因如下：

1、传统检测设备对微生物的检测时间需要24小时，而在这一天时间里原料牛奶早已运进工厂生产了；

2、新出现的快速检测设备虽然还做不到真正的快速检测，但就是这样其价格也十分昂贵；

3、现在所有检测设备都只是检测大肠杆菌这种代表菌，不能同时检测其它细菌。

在这样的情况下，全世界都在努力研究微生物快速检测技术，因为检测时间能提前一小时所带来的好处都是不可估量的。

牛奶为液体，由蛋白质、脂肪、乳糖和其他少量可溶的维生素及矿物质等物质组成，各种成分的物理性质各不相同。正是由于牛奶这种复杂的结构使得对其做微生物含量的精确快速检测十分困难。

中华人民共和国国家知识产权局于2007年10月10日公开了公开号为CN101050416A的专利文献，名称是直接镜检法牛奶体细胞/细菌自动计数仪，它包括采样涂片装置、染色装置、清洗吹干装置、显微镜检测装置；它还包括将奶样和载玻片送至采样涂片工作位及送出采样涂片工作位的传送装置，以及将涂片后的载玻片依次送至染色区、清洗吹干区、待检区的传送装置；所述将涂片后的载玻片依次送至染色区、清洗吹干区、待检区的传送装置依次包括若干级载玻片传送机构及载玻片转运机构；所述自动分析仪设有涂片装置、染色装置、清洗吹干装置、显微镜检测装置和传送装置的控制装置。此方案将奶样涂到涂片上然后进行检测，仍然存在操作繁琐、速度慢、效率低的问题。

发明内容

本发明主要是解决现有技术所存在的操作繁琐、速度慢、效率低等的技术问题，提供一种操作简便、检测速度快、可检测细菌种类多的原奶细菌快速检测方法及装置。

本发明针对上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：一种原奶细菌快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一、将待测牛奶放入装有沉淀剂的离心管中，振荡离心管3~8秒；

步骤二、将离心管放入离心机内作离心处理；

步骤三、用注射器吸取离心管内液体中间层的清晰溶液，注入检测装置的样品池；

步骤四、启动高速通道泵，使样品池中的样品液进入高速通道；

步骤五、停止高速通道泵，启动采样泵，样品液进入样品流动槽；

步骤六、显微摄像机对样品液进行图像采集，然后传送采集到的图像至加速器；

步骤七、加速器对图像进行识别，计算样品液中的细菌含量。

检测结束以后，向样品池中注入清洗液，对样品液流经的通道进行清洗，为后一次的清洗作准备。

作为优选，所述离心处理为，使离心管以400~600rpm旋转2~4分钟。

作为优选，所述沉淀试剂为醋酸溶液，牛奶与沉淀剂混合以后的液体pH值为4.8。

作为优选，步骤七中，图像识别包括以下过程：

a、获取样品画面；

b、去除背景干扰；

c、颗粒形状分割；

d、检测颗粒特征；

e、将检测到的颗粒特征与典型细菌特征，判断是否相符，对符合典型细菌特征的颗粒进行计数；

f、将细菌总数除以样品液体积，得出原奶细菌含量。

牛奶中每种成分对细菌的检测都有很大干扰，以蛋白质的干扰最大。牛奶中的蛋白物质大致可以分为乳清蛋白质，免疫球蛋白和酪蛋白和少量的酶类。其中4种酪蛋白的含量约占总蛋白的百分之八十以上。他们在牛奶中以胶体颗粒的形式存在，分子量在显微镜下可以呈大颗粒状，尺寸在微米级，与细菌相当，从而造成视觉上的混淆。对视觉检测有影响的还有脂肪，它会附着在管壁上。

检测时首先对牛奶进行预处理，使牛奶中的微生物与蛋白质、脂肪分离。分离方法的原理分析如下：

1、蛋白质

蛋白中酪蛋白的等电点pI是4.8，当溶液中pH值也为4.8时，在充分振荡后，占原奶中蛋白质很大比例的酪蛋白会发生沉淀。当pH值改变时，这些沉淀又会溶解，沉淀这一过程是可逆的。酪蛋白沉淀后的体积比任意细菌都大得多，而且，这些沉淀结构相对松散不会将细菌包裹在其中。酪蛋白所产生的沉淀对细菌影响较小。

2、电特性

微生物还有一个重要的特点，就是细菌带负电荷。在溶液的pH值为4.8，酪蛋白沉淀时，虽然对细菌有影响，但这种影响是非常有限的，短时间内只会抑制其生长，不至于将其致死。

3、脂肪

牛奶中的乳脂肪尽管其含量不多，只有1%左右，但它们是典型的油脂，不溶于水。牛奶中油脂的密度在0.8g/ml左右，比水轻。牛奶中的脂肪，尤其是未经过均质处理的脂肪，是以微球的形式存在于牛奶中，在微观下对显微观测的影响是非常大的。脂肪微球的密度较小，在牛奶中的平均密度1.02g/ml，它们有上浮的趋势。在低速离心情况下这种趋势明显增强，使它们浮到液体表面，数量大时会聚集在一起形成一层膜。

4、离心处理

通过低速离心技术可将原奶中的沉淀物集中在离心管的底部，油脂漂浮在表面。在实现蛋白质分离的同时也实现了牛奶中脂肪的分离，从而达到将牛奶分解为沉淀物、透明液体、油脂三部分，细菌留在透明液体中。离心处理后取出中间的透明液体即为待测样品液。

5、浓缩

如果需要进一步浓缩，可以采用过滤纸滤出微生物，然后再将过滤纸融入纯水中，实现浓缩样品液的目的。

一种原奶细菌快速检测装置，包括控制板、样品池、高速通道、高速通道泵、采样通道、样品流动槽、光源、显微摄像机和采样泵；控制板包括用于图像处理的加速器；所述高速通道的一端连接样品池，另一端连接高速通道泵；采样通道的一端连接高速通道形成T型结构，另一端连接样品流动槽的入口，样品流动槽的出口通过管道连接采样泵；所述光源、样品流动槽和显微摄像机依次设置一条直线上；显微摄像机与加速器电连接；采样泵和高速通道泵的控制端都与控制板电连接。

控制板控制高速通道泵和采样泵的启动及停止。样品流动槽由高透光率的材料（玻璃等）制成，内部的液体流通通道的厚度为20微米，宽度为200微米，样品流动槽的正面厚度为20微米。

高速通道与采样通道的连接点为采样点，将高速通道泵设置在采样点的下游，实现负压进样，这样一是不会因为高速通道泵内部的硅胶管道增加从进样点到采样点之间的管道的距离；二是高速通道泵对主路上产生的压力不会传递到采样通道上，大大增加了采样通道的使用寿命。

作为优选，原奶细菌快速检测装置还包括LED灯和光电二极管，所述LED灯和光电二极管都与控制板电连接，所述LED灯与光电二极管在高速通道的两侧相对设置，高速通道为透明管道，LED灯发出的光线通过高速通道以后被光电二极管接收；高速通道和采样通道的连接点为采样点，光电二极管的检测点位于采样点的上游。

在正常情况下，高速通路上是有液体的，检测时为样品液，检测完成以后为清洗液。但在缺少清洗液时高速通路上就没有液体了，此时高速通道泵继续工作，会造成管道内的压力持续下降；另外在加样品时也可能会造成这样的情况。在进样点前增加这样一个由LED灯和光电二极管组成的检测点，可以利用LED灯发出的光经过高速通道的硅胶管，再用光电二极管作为接收器。管道内有液体时候光散射和没有液体时候光电二极管上收到的光强度是不同的。这样就可以准确及时地反馈这个信号控制泵的开启和关闭，避免了主管道内压力的过大变化。

作为优选，高速通道还通过气体支路连接电控阀门，气体支路和高速通道的连接点位于高速通道的入口和光电二极管的检测点之间，电控阀门的入口连接空气，电控阀门的控制端与控制板电连接。

检测时，不能让2种液体混在一起时（比如清洗液和样品），需要将它们隔开，就是在管道中加一段空气进去作为隔离。如果没有缓冲气路的存在，当主路上液体没有时，高速通道泵和采样泵还在持续工作，这样管内的压强降低。当加入样品时，样品会快速地被吸入，可能会与前面的液体混合，造成样品浓度降低。同时这种情况也会出现在清洗液样品最后部分，使清洗液中混入样品液，造成清洗上的困难。为避免这种情况出现，加入气体支路和电控阀门，关闭清洗液阀门的同时（或者之后）打开气体支路上阀门进入空气，这样平衡主路管道的液体压强。当这部分液体被吸取完，检测点检测不到液体就可以停止主路上的高速通道泵，再加入样品，这样在主管道内就保留了一段空气柱。这部分气柱起到隔离作用。另外这段气柱到达采样点时，也被采样。对采样管也是一种隔离和清洗作用。这种清洗对于留滞在管道内壁的细菌作用明显要比液柱的作用要强。

对于一般的液体食品，可以用同样的处理方式进行处理，区别在于所使用的沉淀剂、离心时间的不同。离心过程对于清晰度较高的液体来说也不是必需的，能够满足观测要求就可以。对于固体食品，可以通过碾磨以后溶解到水中，然后进行沉淀、离心的操作，必要是还需要进行过滤。

本发明带来的实质性效果是，实现成本低、检测速度快、检测范围广、操作方便，可以快速获得检测结果，自动化程度高，检测结果准确。

附图说明

图1是本发明的一种原奶细菌快速检测方法流程图；

图2是本发明的一种原奶细菌快速检测装置结构示意图；

图中：1、样品池，2、高速通道，3、高速通道泵，4、采样通道，5、显微摄像机，6、样品流动槽，7、光源，8、采样泵，9、光电二极管，10、LED灯，11、气体支路，12、电控阀门。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例：本实施例的一种原奶细菌快速检测装置，如图2所示，包括控制板、样品池1、高速通道2、高速通道泵3、采样通道4、样品流动槽6、光源7、显微摄像机5、采样泵8、LED灯10、光电二极管9、气体支路11和电控阀门12；高速通道2的一端连接样品池1，另一端连接高速通道泵3；采样通道4的一端连接高速通道形成T型结构，另一端连接样品流动槽6的入口，样品流动槽6的出口通过管道连接采样泵8；光源7、样品流动槽6和显微摄像机5依次设置一条直线上；显微摄像机5与加速器电连接；采样泵3和高速通道泵8的控制端都与控制板电连接。

LED灯10和光电二极管9都与控制板电连接， LED灯10与光电二极管9在高速通道2的两侧相对设置，高速通道2为透明硅胶管道，LED灯10发出的光线通过高速通道2以后被光电二极管9接收；高速通道2和采样通道4的连接点为采样点，光电二极管9的检测点位于采样点的上游。

高速通道2还通过气体支路11连接电控阀门12，气体支路11和高速通道2的连接点位于高速通道2的入口和光电二极管9的检测点之间，电控阀门12的入口连接空气，电控阀门12的控制端与控制板电连接。

控制板由处理器、加速器和工作存储器组成，还包括启动、停止、参数设置等控制按键。由处理器处理外界按键信息和送给高速通道泵和采样泵控制信号，加速器用于处理视频信号，处理结果输送到计算机或者进行存储。根据需要也可以直接将采集到的视频图像传输给计算机，由计算机完成分析计数的过程。

“T” 型管道有2条液体输出通路，一条为高速通道至废液池，另外一条是采样通道至样品流动槽。样品液流入T型管是靠负压分别从高速通道和采样通道吸取。负压由两个蠕动泵产生。蠕动泵是由控制板控制的。高速通道的任务有两个：一是在样品刚开始注入样品池时，管道中主要是气体。要高速地将它们抽空，使样品液快速地进入到样品流动槽，以节省检测时间；二是在刷洗过程中能够快速抽空管道中的样品液，快速注入清洗池，快速进入到刷洗阶段，以便于能尽快做下一次检测，所以称其为高速通道。检测过的液体和高速通道上流出的液体都进入废液池。

一种原奶细菌快速检测方法，如图1所示，包括以下步骤：

步骤一、将待测牛奶放入装有沉淀剂的离心管中，振荡离心管5秒；振荡采用振荡机完成；

步骤二、将离心管放入离心机内，以500rpm转速，做3分钟离心处理，；

步骤三、用注射器吸取离心管内液体中间层的清晰溶液，注入检测装置的样品池；

步骤四、启动高速通道泵，使样品池中的样品液进入高速通道；

步骤五、停止高速通道泵，启动采样泵，样品液进入样品流动槽；

步骤六、显微摄像机对样品液进行图像采集，然后传送采集到的图像至加速器；

步骤七、加速器对图像进行识别，计算样品液中的细菌含量。

沉淀剂的制备过程为：取0.1ml白醋原液，添加0.9ml无菌水，稀释为10倍稀释液。检测时取0.8ml沉淀试剂于容积为1.5ml的离心管内，每支离心管内注入的原奶为0.2ml

检测量达到要求时，终止检测，高速通道快速抽空样品液，之后检测通道也抽空。之后，注入清洗液，高速通道和检测通道都全力流动清洗液。清洗时间达到设计指标时再终止清洗液注入，并抽空所有管道。一个检测过程完成。

步骤七中，图像识别包括以下过程：

a、获取样品画面；

b、去除背景干扰；

c、颗粒形状分割；

d、检测颗粒特征；

e、将检测到的颗粒特征与典型细菌特征，判断是否相符，对符合典型细菌特征的颗粒进行计数；

f、将细菌总数除以样品液体积，得出原奶细菌含量。

加速器与计算机连接，检测结果直接输送到计算机进行显示和存储，当显微检测量达到要求时，可以停止检测检测，如果继续检测则计算机会不停地精细化检测结果。

细菌主要分为三种形态，杆菌、球菌和螺旋菌，这就将繁杂的细菌简化为三种形状的菌。显微视频进入加速器或计算机后，加速器或计算机开始分析，在分析之前要先对视频图像做预处理。所谓预处理就是将视频里面复杂的贴在管壁上的细胞作为背景，不参加计数。对于背景的处理就是将视频图像减去背景图像，得到流动的细菌图。

显微摄像机为在高速摄像机的镜头上叠加显微镜头，采用40-100倍的物镜，1000万像素，物镜与样品流动槽之间在必要时可以加松柏油，形成油镜。显微摄像机获取连续的图像，每幅图像之间有10%的重叠区，以避免漏测微生物。

文中所描述的检测过程虽然是针对牛奶的，但是对于其它类型的液体可以增加或简化一些处理步骤，基本思路是一样的。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管本文较多地使用了高速通道、样品流动槽、显微摄像机等术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims (7)

1.一种原奶细菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将待测牛奶放入装有沉淀剂的离心管中，振荡离心管3~8秒；

步骤二、将离心管放入离心机内作离心处理；

步骤三、用注射器吸取离心管内液体中间层的清晰溶液，注入检测装置的样品池；

步骤四、启动高速通道泵，使样品池中的样品液进入高速通道；

步骤五、停止高速通道泵，启动采样泵，样品液进入样品流动槽；

步骤六、显微摄像机对样品液进行图像采集，然后传送采集到的图像至加速器；

步骤七、加速器对图像进行识别，计算样品液中的细菌含量。

2.根据权利要求1所述的一种原奶细菌快速检测方法，其特征在于，所述离心处理为，使离心管以400~600rpm旋转2~4分钟。

3.根据权利要求1或2所述的一种原奶细菌快速检测方法，其特征在于，所述沉淀试剂为醋酸溶液，牛奶与沉淀剂混合以后的液体pH值为4.8。

4.根据权利要求1所述的一种原奶细菌快速检测方法，其特征在于，步骤七中，图像识别包括以下过程：

a、获取样品画面；

b、去除背景干扰；

c、颗粒形状分割；

d、检测颗粒特征；

e、将检测到的颗粒特征与典型细菌特征，判断是否相符，对符合典型细菌特征的颗粒进行计数；

f、将细菌总数除以样品液体积，得出原奶细菌含量。

5.一种用于权利要求1所述的原奶细菌快速检测方法的原奶细菌快速检测装置，其特征在于，包括控制板、样品池、高速通道、高速通道泵、采样通道、样品流动槽、光源、显微摄像机和采样泵；控制板包括用于图像处理的加速器；所述高速通道的一端连接样品池，另一端连接高速通道泵；采样通道的一端连接高速通道形成T型结构，另一端连接样品流动槽的入口，样品流动槽的出口通过管道连接采样泵；所述光源、样品流动槽和显微摄像机依次设置一条直线上；显微摄像机与加速器电连接；采样泵和高速通道泵的控制端都与控制板电连接。

6.根据权利要求5所述的一种原奶细菌快速检测装置，其特征在于，还包括LED灯和光电二极管，所述LED灯和光电二极管都与控制板电连接，所述LED灯与光电二极管在高速通道的两侧相对设置，高速通道为透明管道，LED灯发出的光线通过高速通道以后被光电二极管接收；高速通道和采样通道的连接点为采样点，光电二极管的检测点位于采样点的上游。

7.根据权利要求6所述的一种原奶细菌快速检测装置，其特征在于，高速通道还通过气体支路连接电控阀门，气体支路和高速通道的连接点位于高速通道的入口和光电二极管的检测点之间，电控阀门的入口连接空气，电控阀门的控制端与控制板电连接。

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