CN103743828A - 一种中药龙胆中苯甲酸酯类化合物的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种中药龙胆中抗老年痴呆有效成分苯甲酸酯类化合物的测定方法，属于化学分析领域。本方法特征在于：以龙胆为原料，经粉碎过筛，采用95%乙醇溶液超声萃取，过滤，从中提取苯甲酸酯类化合物，采用液相色谱-串联质谱联用仪实现龙胆中主要苯甲酸酯类化合物的测定。本发明中采用的LC-MS/MS法，灵敏度高，稳定性好，方便快速，适合复杂基质中超低含量目标物的批量分析。
Description
技术领域
本发明属于化学分析领域，具体涉及一种中药龙胆中抗老年痴呆有效成分苯甲酸酯类化合物的测定方法。
背景技术
中药龙胆（Gentianae Radix et Rhizoma）为龙胆科植物：条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag.，龙胆Gentiana scabra Bge.，三花龙胆Gentiana triflora Pall. 或滇龙胆Gentiana rigescens Franch. 的干燥根和根茎。滇龙胆，别名：滇龙胆草（滇南本草）、坚龙胆（中国高等植物图鉴）、苦草、青鱼胆、小秦艽（云南）、蓝花根、炮仗花，是《中国药典》收录的龙胆品种之一，也是云南著名道地药材，并收载于《滇南本草》。龙胆在《神农本草经》中作为上品收载，苦、寒；归肝、胆经；具有清热燥湿, 泻肝胆火的功效； 用于治疗湿热黄疸, 阴肿阴痒, 带下, 强中, 湿疹瘙痒, 目赤, 耳聋, 胁痛, 口苦，惊风抽搐等症。龙胆中主要成分为环烯醚萜苷类化合物, 以龙胆苦苷、獐牙菜苦苷等为代表。该类物质具有保肝、健胃、镇痛、抗病毒、促进细胞分裂、加快伤口愈合等多种功效。
从滇龙胆提取物中发现了十余种具有显著类似神经生长因子活性的2,3-二羟基苯甲酸酯类新化合物，命名为gentisides。具有显著的类似神经生长因子活性，神经营养作用和保护作用，是一种高效低毒的抗老年痴呆症中药活性组分。关于2,3-二羟基苯甲酸酯类化合物只有化学合成的脂肪链含碳数低于11或16个碳的文献报道；欧洲专利（EP 1 930 002 A1）描述了苯甲酸酯类化合物式在治疗和预防病毒感染方面的应用；中国专利（CN 1411339A）和美国专利所描述的苯甲酸类化合物主要用于抑菌，作为食品添加剂等。此外，龙胆具有来源广泛，取材便利等优点，容易获得大量的2,3-二羟基苯甲酸酯类化合物。对研发预防和治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的新药具有重要意义。
目前文献多集中在龙胆中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷等的高效液相色谱（HPLC）测定上，而对龙胆中的2,3-二羟基苯甲酸酯类活性成分未见报道。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）联用技术具有灵敏度高、专属性好、快速、高效的特点，已逐渐成为中药微量成分定量分析的有效手段。因此，本专利采用LC-MS/MS负离子多反应监测（MRM）扫描模式，同时测定滇龙胆中4种苯甲酸酯类化合物的含量，为其开发利用和质量控制提供必要的保证和依据。
发明内容
本发明的目的是针对目前仍未有检测中药龙胆中的主要抗老年痴呆的活性成分的方法，而提供一种液相色谱-串联质谱法检测龙胆中苯甲酸酯类化合物的方法。
本发明通过以下技术方案实现。
本发明的检测方法采用95%乙醇溶液超声萃取龙胆中的苯甲酸酯类化合物，并通过微孔滤膜过滤处理，采用液相色谱-串联质谱联用仪（LC-MS/MS）实现龙胆中主要苯甲酸酯类化合物的测定，具体步骤如下。
a、龙胆中主要苯甲酸酯类活性成分的提取：
将龙胆干燥样品粉碎过筛，置于锥形瓶中并加入95%乙醇溶液，经超声萃取、过滤后，滤液经0.22m微孔滤膜处理，制备样品溶液。
b、样品的分析：
取不同部位的龙胆样品，按步骤a所述的方法制备供试品溶液，采用LC-MS/MS测定，记录峰面积，分别计算样品中gentiside A， gentiside J， gentiside B，gentiside K的含量，结果见表1。
本发明中步骤a中所述的筛孔径为100目；步骤a中所述的龙胆样品为1.5g；步骤a中所述的95%乙醇溶液为10mL；步骤a中所述的超声萃取时间为40min；步骤a中所述的微孔滤膜孔径为0.22μm。
本发明中所用中药龙胆样品采集自云南，不同部位龙胆样品(根、茎、叶、种子)分别检测。
本发明的有益效果如下：
本发明中采用的LC-MS/MS法，灵敏度高，稳定性好，方便快速。因此本发明方法能有效提高分析效率，非常适合复杂基质中超低含量目标物的批量分析。
附图说明
图1 对照品gentiside A、gentiside J、gentiside B、gentiside K二级离子扫描质谱图。
图2 对照品和样品的总离子流色谱图。
具体实施方式
本发明将结合以下实施例作进一步说明。
实施例1：
取龙胆干燥样品（包括根、茎、叶、种子），粉碎后过100目筛；称取1.5g置于50mL具塞磨口锥形瓶中，加入10mL 95%乙醇，室温下超声萃取40min，过滤，滤液过0.22μm微孔滤膜，制备样品溶液。
实施例2：
将实施例1制备的样品采用液质联用方法测定苯甲酸酯类化合物的含量，具体如下。
仪器：
LC-MS/MS 8030 超高效液相三重四级杆串联质谱联用仪（日本岛津）。
液相色谱条件：
色谱柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ (75×2.0mm, 1.6μm)；流动相：甲醇-0.1%甲酸，等度洗脱（95%甲醇），平衡时间为6min；柱温：40℃；流速：0.45mL/min；进样量：20 μL。
质谱条件：
电喷雾电离源（ESI），负离子化模式；毛细管电压为4.5KV；干燥气体、雾化气体为氮气，流速分别为3.0 和15mL/min；碰撞气体（CID）氩气；DL管温度250℃，加热块温度300℃；产物离子扫描为m/z 135 ，碰撞电压35V；定量分析采用多反应监测（MRM）模式，离子优化结果见表2。
线性关系考察：
精密称定对照品gentiside A，gentiside J， gentiside B，gentiside K各2mg，配置成1mg/mL对照品储备液。精密量取不同体积的对照品溶液，配置成10个不同质量浓度的对照品溶液，分别为1000μg/mL、666.6 μg/mL、444.4μg/mL、296.3μg/mL、197.5μg/mL、131.7μg/mL、87.8μg/mL、59μg/mL、39μg/mL、26μg/mL的对照品储备液。按上述LC-MS/MS条件进样测定，记录色谱图。以对照品质量浓度（x）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性关系考察，结果见表3。结果表明，gentiside A，gentiside J， gentiside B，gentiside K在相应质量浓度范围内呈现良好的线性关系（r为0.9989~0.9996）。
精密度试验：
精密吸取同一对照品溶液适量，按上述LC-MS/MS条件连续进样5次，测定峰面积。结果：gentiside A， gentiside J， gentiside B，gentiside K的RSD分别为1.1％、1.2％、0.96％、1.8％，表明仪器精密度良好。
重复性试验：
取同一份龙胆根部样品1.5 g，共6份，分别实施例1方法制备供试品溶液，照上述LC-MS/MS条件进样测定。结果gentiside A， gentiside J， gentiside B，gentiside K的RSD分别为2.2％、3.0％、3.5％、2.5％，表明本方法重复性良好。
稳定性试验：
精密吸取同一供试品溶液适量，同一天内每隔4小时测定龙胆根样品（重复6次）；连续3天同一时间测定滇龙胆根样品（重复6次）。结果表明供试品溶液在室温放置3天以内gentiside A， gentiside B， gentiside J ，gentiside K基本稳定，结果见表4。
回收率试验：
精密称取同一滇龙胆根部样品适量，共6 份，分别精密加入一定量的混合对照品贮备液，按实施例1方法制备供试品溶液，测定4种化合物的峰面积，计算回收率，测定结果见表5。结果显示，这4种化合物的加样回收率为98.1% ~ 102.6％, RSD为0.68％~1.65％。
Claims (6)
1.一种中药龙胆中苯甲酸酯类化合物的测定方法，其特征是将中药龙胆样品干燥粉碎过筛，置于锥形瓶中并加入95%乙醇溶液，超声萃取，过滤得溶液后，滤液经0.22μm微孔滤膜处理，采用液相色谱-串联质谱联用仪（LC-MS/MS）测定龙胆中苯甲酸酯类化合物的种类和含量。
2.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱法检测中药龙胆中苯甲酸酯类化合物的方法，其特征在于：筛孔径为100目。
3.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱法检测中药龙胆中苯甲酸酯类化合物的方法，其特征在于：龙胆样品为1.5g。
4.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱法检测中药龙胆中苯甲酸酯类化合物的方法，其特征在于：95%乙醇溶液体积为10mL。
5.根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱法检测中药龙胆中苯甲酸酯类化合物的方法，其特征在于：超声萃取时间为40min。
6.根据权利要求1所述的中药龙胆中苯甲酸酯类化合物，其特征在于：中药龙胆中四种主要苯甲酸酯类化合物包括gentiside A，gentiside J，gentiside B和gentiside K。
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