CN103739707A - 抗禽流感h5n1血凝素抗原的人源化抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗禽流感H5N1病毒血凝素（Hemagglutinin，HA）抗原的人源化抗体，所述人源化抗体的重链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述人源化抗体的轻链可变区具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。此外，本发明还公开了该人源化抗体的制备方法和用途。该人源化抗体具有广泛普遍的对禽流感H5N1病毒的血凝抑制活性，且对禽流感H5N1的HA抗原多种亚型具有高亲和力和中和活性，同时能识别一个H5HA独有的保守区域。该人源化抗体既具有高中和活性，又能降低免疫源性，识别的表位在H5型流感病毒中具有高度保守性，在今后禽流感H5N1预防、治疗和疫苗设计中有广泛的应用前景。

Description

抗禽流感H5N1血凝素抗原的人源化抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗禽流感H5N1的血凝素（Hemagglutinin，HA）抗原的人源化抗体。此外，本发明还涉及该抗体的制备方法以及用途。

背景技术

禽流感是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征。甲型流感病毒根据其表面蛋白质的不同被分为H1到H16等16种亚型。世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7两种亚型引起，而人对其中的H1和H3亚型易感。高致病性禽流感H5N1病毒在亚洲造成成千上万的禽类死亡，并且疫情已经波及到中东地区、欧洲和非洲50多个国家。原本禽流感是只在禽类动物之间传播，但是随着进化，某些动物流感病毒株发生了变异，获得对人的致病性以及在人群中传播的能力，成为人类流感病毒。据世界卫生组织统计，自2003年起截止至2013年4月全球15个地区共确诊628名病例，374人死亡，病死率高达60%。

为了防止H5N1的流行传播，一些防止措施被广泛使用，比如疫苗，抗病毒药物及免疫治疗。目前有19种H5N1疫苗可以使用（http://www.who.int/influenza/resources/documents/characteristics_virus_vaccines/en/index.html），但是疫苗只能在预防阶段起作用。抗病毒性药物是个有效的途径，但是可供选择的种类比较局限。而基于抗体的被动免疫疗法在预防和治疗上都取得了很大的突破，成功应用于诸如甲肝病毒、乙肝病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒感染等。除此之外，1918年西班牙流感在全球爆发时，恢复病人的血清成功的降低了50%的治病率，而在中国用血清治疗H5N1感染也取得了成功。一些研究小组也成功制备了抗H5N1HA的单克隆抗体，并在小鼠模型中表现了预防和保护的功能（Sun,L.et al.PloS one,2009,4:e5476;Simmons,C.P.et al.PLoS medicine2007,4:e178;Prabhu,N.et al.Journal of virology,2009,83:2553-2562;Fleury,D.et al.Proteins,2000,40:572-578;Throsby,M.et al.PloS one,2008,3:e3942）。因此制备中和抗体是治疗和预防H5N1感染的重要途径。但是，由于目前杂交瘤技术制备的单克隆抗体都是鼠源抗体。随着使用单抗进行治疗病例数的增加，鼠单抗的弊端逐渐显露，主要是鼠源性抗体能引起人较为严重的免疫原性问题，产生人抗鼠抗体反应（Humananti-mouse antibody response，HAMA），HAMA可影响单抗的治疗效果，甚至可诱发过敏反应；其次，鼠单抗通常不能有效激活人体的生物效应功能，如补体依赖的细胞毒及抗体依赖的细胞毒作用；此外，鼠单抗在人体内半衰期也很短。为解决这些问题，诞生了多种抗体人源化改造技术，使抗体的免疫原性得到不同程度的降低，包括人鼠嵌合抗体（Chimericantibody）和人源化抗体（Humanized antibody）。但不可否认抗体人源化改造费时、费力，改造后往往存在亲和活性降低、特异性下降等情况，而且或多或少存在免疫原性问题，因此人源性抗体也逐渐快速增长起来。

人鼠嵌合抗体即将鼠抗的可变区与人球蛋白的稳定区相连接，即抗体的Fab或F(ab/2)来源于鼠类，而Fc段来源于人类，既保留了抗体对抗原的特异亲和力，也可以部分降低HAMA反应。

人源化抗体是通过同源模建进行表面氨基酸残基人源化而制备得到。CDR-grafting是主要的人源化手段，将人抗体可变区中互补决定族（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列，使抗体既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲合力。由于这种CDR-grafted抗体只含有很少一部分鼠源蛋白成分（只有CDR来自小鼠），过敏反应大大降低并且对靶抗原又有较高的特异性和亲合力，在人体内的免疫原性被极大地降低，因此这种抗体的产生和发展，具有广泛的临床应用潜能。

综上所述，将禽流感H5N1单克隆鼠源抗体经过嵌合及人源化改造，使其既具有高中和活性，又能降低免疫源性，在今后禽流感H5N1预防和治疗中有广泛的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种抗禽流感H5N1血凝素抗原的人源化抗体。

本发明要解决的技术问题之二是提供该抗禽流感H5N1血凝素抗原的人源化抗体的制备方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供该抗禽流感H5N1血凝素抗原的人源化抗体的用途。

本发明第一方面提供了一种抗禽流感H5N1病毒血凝素抗原的人源化抗体，该抗体特异性结合禽流感H5N1抗原。将抗禽流感H5N1病毒血凝素鼠源性单克隆抗体H5M9的重链可变区和轻链可变区基因进行人源化改造，包括框架区和抗原结合区域/互补决定区的氨基酸置换。

该抗禽流感H5N1病毒血凝素抗原的人源化抗体包括：

1）具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；

2）具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区；

3）与人抗体重链恒定区相一致的重链恒定区；

4）与人抗体轻链恒定区相一致的轻链恒定区。

本发明第二方面提供了一种抗禽流感H5N1病毒血凝素抗原的人源化抗体的改造方法。

步骤1，基于目标抗体的可变区序列和结构信息的人源抗体模板的选择。将需人源化的鼠源目标抗体mH5M9轻、重链可变区的序列分别通过在BLASTP-search against thenon-redundant protein database中进行序列相似性搜索，选择与轻、重链相似性最高的人源抗体作为候选的人源化模板。

步骤2，抗原结合区的移植。将鼠源目标抗体mH5M9的互补决定区（CDR）（抗体的CDR序列可以通过综合Kabat等人和Chothia等人的序列定义加以鉴定）移植到人源化模板抗体相应位置上，得到最初人源抗体A1。

步骤3，框架区残基回复突变位点的选择。基于模拟的mH5M9结构,采用计算生物学方法，对一些重要的框架区残基进行突变方向的筛选。具体到本例中，最初人源抗体A1的重链可变区VH的第37、66、71和109位残基，被选择需突变为目标抗体上的相应残基，即第37位残基缬氨酸被甲硫氨酸代替，第66位残基赖氨酸被精氨酸代替，第71位丝氨酸被缬氨酸代替；第109位残基亮氨酸被缬氨酸代替，最终得到人源化抗体hH5M9。

本发明第三个方面提供了一种编码上述人源化抗体的DNA分子或基因，其重链可变区具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

本发明第四个方面提供了一种表达载体，含有上述抗体或抗体片段的编码基因，将上述抗体或抗体片段的编码基因在哺乳动物细胞内翻译表达为蛋白质或多肽。

本发明第五个方面提供了一种宿主细胞，由上述表达载体转化而成，能够表达上述抗体或抗体片段。

本发明第六个方面提供了一种上述抗体的制备方法，包括：

步骤1，提供一种表达载体，该表达载体含有上述抗体的基因序列；

步骤2，用步骤1所述的表达载体转化宿主细胞；

步骤3，在适合所述抗体表达的条件下培养步骤2所得的宿主细胞；

步骤4，分离纯化获得所述的抗体。

本发明第七方面提供该人源性抗体的用途，即在制备血凝抑制禽流感H5N1病毒的药物中的应用，以及在制备对禽流感H5N1的HA抗原多种亚型具有高亲和力和中和活性的试剂中的应用，以及在鉴定识别HA抗原表位中的应用。

本发明第八方面提供一种在H5型流感病毒中具有高度保守性的HA抗原表位肽序列，该HA抗原表位肽序列为如下氨基酸序列：KPNDAINF，如SEQ ID NO：11所示。

本文所采用的术语“人源化抗体”系将鼠源性单克隆抗体的氨基酸序列除保留互补决定区（CDR）外，其它所有序列（包括可变区中的框架区序列）全部替换成人免疫球蛋白的氨基酸序列，以达到通过基因工程手段最大限度地降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性。

本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链（L）和两个相同的重链（H）组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区（VH）。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区（VL），另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中成为互补决定区（CDR）或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区（FR）。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位（参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷1，647-669页（1991））。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

本文所用的术语“血凝素”表示禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介导流感病毒针对宿主细胞的吸附和进入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16个血清学亚型，HA1-HA16，分别对应于16个病毒亚型，即H1-H16。

本文所用的术语“载体”表示可将编码某蛋白的多聚核昔酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。

本文所用的术语“宿主细胞”表示导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞的动物细胞。宿主细胞可以是离体的或者在体的,可以是培养的细胞或者细胞系。

本文所用的术语“特异性结合”表示两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中，一个某抗原特异性抗体是指以亲和力（KD）≦10^-5M（如10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M等）结合该抗原，其中KD指解离率与结合率的比值（Kd/Ka），其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。

经实验验证，本发明抗禽流感H5N1血凝素抗原的人源化抗体具有广泛普遍的对禽流感H5N1病毒的血凝抑制活性，且对禽流感H5N1的HA抗原多种亚型具有高亲和力和中和活性，同时能够识别一个H5HA独有的保守区域。该人源化抗体既具有高中和活性，又能降低免疫源性，在今后禽流感H5N1预防、治疗和疫苗设计中有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中鼠源抗体mH5M9轻链和重链的可变区氨基酸序列示意图，序列编号依照Kabat规则排序。图1中，下划线部分为根据Kabat的序列定义划分出的互补决定区（CDR）。

图2是本发明实施例1中鼠源抗体mH5M9、人源化抗体模板FabOX108及人源化抗体最初版本A1和最终版本hH5M9氨基酸序列的比较示意图。

图3是本发明实施例2中人源化抗体表达载体的质粒图谱。其中，A为重链真核表达载体IFH；B为轻链真核表达载体IFL。

图4是本发明实施例4中人源化hH5M9抗体纯化后经SDS-PAGE鉴定结果示意图。以鼠源抗体mH5M9为阳性参照。

图5是本发明实施例7中SPR方法测定hH5M9和mH5M9在不同浓度下的结合与解离曲线示意图。

图6是本发明实施例8中Western Blotting方法鉴定hH5M9识别HA1的示意图。以兔多抗抗A/Anhui/1/05为阳性参照。

图7是本发明实施例8中人源化hH5M9抗体识别H5HA表位的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.鼠源抗体mH5M9的人源化改造

鼠源抗体mH5M9的可变区序列发布在NCBI数据库中（重链GenBank No.AGX28126.1，轻链GenBank No.AGX28125.1），见图1。采用Kabat方法，找出其中的CDR序列，见图1下划线部分。通过CDR移植的方法对鼠源抗体mH5M9进行人源化。通过BLASTP-searchagainst the non-redundant protein database中搜索最适合的模板，结果显示人抗FabOX108的重轻链（PDB No.3DGG_B和No.3DGG_A）同源性最高，达到73%和75%。再将鼠源抗体mH5M9的重链和轻链CDR区分别移植到人源模板VH和VL的FR框架上，得到最初人源化抗体A1，序列比较结果见图2。

基于最初版本人源化抗体mH5M9的模拟的空间结构，对一些重要的FR区残基进行突变方向的筛选。首先考虑的一类残基是可能影响互补决定区构象或结构的残基，或是可能直接影响抗原结合的残基，同时人模板的FR区与鼠抗体的FR区中的不同氨基酸，列出此类残基的清单（见表1）。通常需要将这些残基全部突变为原始抗体mH5M9的相应位点的残基，通过筛选，保留不影响抗体亲和力的残基，最终得到人源化抗体hH5M9，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

表1氨基酸残基突变选择

氨基酸	人源模板FabOX108	鼠源mH5M9	人源化抗体hH5M9
				H24	Ala	Thr	Ala
H37	Val	Met	Met
				H66	Lys	Arg	Arg
H71	Ser	Val	Val
				H93	Ala	Val	Ala
H109	Leu	Val	Val
				L58	Val	Ile	Val
L87	Trp	Phe	Trp

实施例2.人源化抗体表达载体的构建

将人源化抗体hH5M9重、轻链可变区基因（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4），分别插入真核表达载体的相应位点中，得到的阳性重组质粒IFH-VH和IFL-VL，表达载体由本实验室保存。表达载体质粒图谱如图3所示，其中，A为重链真核表达载体IFH；B为轻链真核表达载体IFL。

实施例3.人源化抗体的表达

将上述实施例2构建好的人源化抗体表达载体IFH-VH和IFH-VL转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用MACHEREY-NAGEL公司的质粒抽提试剂盒

Xtra Mid），按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的FreeStyle^TMMAX Reagent转染将上述质粒DNA共同转染入293F细胞（宿主细胞293F细胞，购自Invitrogen公司），操作方法按照生产商说明书进行。转染后6-7天收集培养上清。

实施例4.人源化抗体的纯化和鉴定

将实施例3获得的细胞培养上清，上样到GE healthcare公司的HiTrap MabSelect SuRe柱，操作方法按照生产商说明书进行，得到人源化抗体hH5M9。用SDS-PAGE分析纯化的人源化抗体，观察到大小约50kDa和约29kDa的带，分别被鉴定为人源化抗体重链和轻链（见图4）。

实施例5.人源化抗体的血凝抑制活性测定

检测血凝抗原滴度：25μl抗原于孔1中，添加75μl的PBS混匀得1/4稀释度，取50μl添加到含有50μl PBS的孔2中混匀得1/8；取50μl添加到含有50μl PBS的孔3中混匀得1/16，依次类推，直至孔12的1/8192；50μl0.75-1%红细胞于12个孔中，轻轻抖混匀，1h左右，约在1/512处得到++++（完全血凝）或++（部分血凝）结果，该处定为1个血凝单位；阴性对照为未添加抗原的50μl PBS。

血凝抑制试验操作：1-12孔，孔1空置，其余添加25μl PBS；50μl纯化的人源化抗体hH5M9（1mg/ml）于孔1，取25μl于孔2混匀，依次倍比稀释至孔12；加入25μl4个血凝单位抗原，轻轻抖混匀室温或者37℃放置15min；加入0.75-1%红细胞50μl，轻轻抖混匀，静置1h左右。以鼠源抗体mH5M9（1mg/ml）为阳性对照。人源化抗体hH5M9与8株H5、H1、H7和H9病毒的代表株的血凝抑制活性结果如表2所示（数字表示稀释倍数），hH5M9和mH5M9能够结合所有的5株H5N1HA，但不能与H1、H7和H9反应，说明hH5M9保留了mH5M9的广谱HI活性，但他们对其中的一些代表株病毒的血凝活性比mH5M9低，说明人源化的改造对抗体的活性会有一定影响。

表2人源化抗体的广谱血凝抑制活性测定

病毒株	亚型	hH5M9	mH5M9
				A/goose/Guangdong/1/96	H5N1	64	128
A/Vietnam/1194/04	H5N1	64	128
				A/duck/Anhui/1/06	H5N1	64	128
A/Anhui/1/05	H5N1	64	128
				A/chicken/Shanxi/2/06	H5N1	64	128
A/New Caledonia/20/1999	H1N1	<4	<4
				A/duck/Guangdong/1/1996	H7N3	<4	<4
A/chicken/Shandong/6/96	H9N2	<4	<4

实施例6.人源化抗体的中和能力测定

将H5N1HA抗原用包被液（pH9.6CBS）稀释到一定浓度（10μg/ml）后包被于96孔板上，100μl/孔，于2～8℃放置过夜。弃去孔中液体，用PBST洗3次，甩干后加入200μl/孔的封闭液（2%BSA PBST），室温1hr，再用PBST洗3次，甩干。用封闭液从1μg/ml开始稀释人源化抗体hH5M9，以100μl/孔复孔加样至96孔板中，37℃孵育1hr，弃液，洗板3次，甩干。用封闭液稀释酶联抗体（HRP-抗人IgGκ链特异性抗体）至一定浓度（1：5000），以100μl/孔加至96孔板中，37℃下反应1hr，弃液，洗板3-6次，甩干。配制底物混合液，以100μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育10min。加入终止液50μl/孔，终止反应。在490nm处读取吸收值OD，计算人源化抗体hH5M9的中和能力，结果见表3。结果显示hH5M9能够广谱高效中和不同亚型H5N1病毒株的能力。

表3人源化抗体的中和活性鉴定

实施例7.人源化抗体的亲和力参数测定

采用表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR）对抗原-抗体的相互作用作分析。仪器采用ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统。GLC传感器活化后，通过10mM冰醋酸pH6.0稀释H5N1HA（A/Vietnam/1194/04），30μl/min60s，使抗原达到946感应单位（RU）；将抗体稀释若干梯度，同时通过GLC，25℃100μl/min120s，PBS做空白对照，C225（EGFR抗体）做阴性对照；PBS清洗后，用解离溶液作用，25℃100μl/min15min。ProteOn Manager^TMsoftware分析数据，抗体在不同浓度下的结合与解离曲线见图5，通过计算得到hH5M9和mH5M9的平衡解离常数KD，分别是3.84×10^-10M和3.05×10^-11M。hH5M9的稍小于mH5M9，说明改变可变区的氨基酸会影响抗体的亲和力，可能是由于氨基酸残基的改变使抗体的结构发生变化，进而影响抗原抗体之间的识别。

实施例8.人源化抗体的表位识别测定

通过Western Blotting大致确定表位在HA的HA1片段上还是HA2片段上，结果见图6。H5HA（A/Anhui/1/05）可以分成HA1和HA2两部分。hH5M9和阳性对照mH5M9均识别HA1片段而非HA2，并且是一个线性而非构象的表位。实施例6的中和结果显示hH5M9和mH5M9能广泛结合H5N1病毒株，但是不能与A/Egypt/N05056/09结合，因此比较该病毒株与其余病毒株的氨基酸差异，见表4。通过氨基酸序列比对，A/Egypt/N05056/09的HA1有7个位点不同于其他8株HA1，分别是第22、120、151、152、154、210和235位的氨基酸，这几个位置的氨基酸可能是抗体识别HA的候选氨基酸残基。

表4不同H5N1病毒HA1氨基酸比较

为了进一步确定哪个氨基酸是表位所在，构建了7个突变HA1表达质粒，分别是HA^K22G、HA^S120G、HA^I151G、HA^K152G、HA^N154G、HA^V210G和HA^P235G，转染入293T细胞，用免疫荧光（IFA）检测抗原-抗体之间反应，结果见表5。仅HA^P235G失去了与hH5M9抗体的结合能力，而与阳性对照依旧能结合，因此Pro²³⁵是表位所在。因此在Pro235附近选取12个氨基酸，分别是231到243（除去235）位置，构建突变HA1表达质粒，转染入293T细胞，用IFA检测抗原-抗体之间反应，结果见表5。HA^N236G、HA^D237G、HA^I239G和HA^N240G几乎失去了与hH5M9的全部结合能力HA^K234G和HA^A238G则失去部分结合能力。由此，可以得到hH5M9识别HA的表位在第234到241的氨基酸，如SEQ ID NO：11所示。同时合成表位肽段，以此为抗原做ELISA，结果显示该肽段能够与抗体hH5M9结合，因此“KPNDAINF”确实为抗体识别表位，在HA上的位置如图7所示。

表5IFA鉴定hH5M9识别A/Anhui/1/05HA表位

^a兔多抗抗A/Anhui/1/05作为阳性对照

^b突变HA质粒转染293T细胞后通过免疫荧光实验鉴定荧光强度，用（+）——（+++）表示。

将该表位在禽流感数据库（Influenza Research Database，http://www.fludb.org/brc/home.do?decorator=influenza）中进行比对，截止2012年9月，包括2376条H5N1病毒株，其中含有243条人源病毒株，基本上包含了H5N1主要流行株。发现2376条中1593条病毒株含有该表位，覆盖率达67.0%，而243条人源中179条病毒株含有该表位，覆盖率达73.7%。该表位在clades1–9是一个高度保守的区域，这与实施例8的中和实验的结论一致。对表位的每一个氨基酸残基也进行比对，发现所有8个氨基酸残基也都比较保守，Lys²³⁴、Pro²³⁵、Asn²³⁶、Asp²³⁷、Ala²³⁸、Ile²³⁹、Asn²⁴⁰和Phe²⁴¹的保守率分别为98.2%、80.1%、98.6%、99.7%、94.7%、99.6%、90.7%和100.0%。而在其他HA类型，如H1，H3，H7和H9中都未发现该表位，因此表位“KPNDAINF”是H5所独有的。综上，人源化改造抗体hH5M9能够识别一个高度保守的H5N1病毒所独有的一个区域，这也使H5M9抗体有更广泛的应用价值，而KPNDAINF多肽有望成为产生有效抗H5型流感病毒的疫苗候选表位肽。

Claims (11)

1.一种抗禽流感H5N1病毒血凝素抗原的人源化抗体，该抗体特异性结合禽流感H5N1抗原，其特征在于，所述人源化抗体的重链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述人源化抗体的轻链可变区具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的重链抗原互补决定区具有SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7的氨基酸序列；所述人源化抗体的轻链抗原互补决定区具有SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述的人源化抗体的改造方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，基于目标抗体的可变区序列和结构信息的人源抗体模板的选择：将需人源化的鼠源目标抗体mH5M9轻、重链可变区的序列通过序列相似性搜索，选择与轻、重链相似性最高的人源抗体作为候选的人源化模板；

步骤2，抗原结合区的移植：将鼠源目标抗体mH5M9的互补决定区CDR移植到人源化模板抗体相应位置上，得到最初人源抗体A1；

步骤3，框架区残基回复突变位点的选择：基于模拟的mH5M9结构，采用计算生物学方法，对一些重要的框架区残基进行突变方向的筛选，最初人源抗体A1的重链可变区VH的第37、66、71和109位残基，被选择需突变为目标抗体上的相应残基，即第37位残基缬氨酸被甲硫氨酸代替，第66位残基赖氨酸被精氨酸代替，第71位丝氨酸被缬氨酸代替；第109位残基亮氨酸被缬氨酸代替，最终得到人源化抗体hH5M9。

4.一种编码权利要求1所述人源化抗体的DNA分子或基因，其特征在于，其重链可变区具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求4所述的基因序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它由权利要求5所述的表达载体转化而成。

7.一种如权利要求1所述的人源化抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，提供一种表达载体，该表达载体含有权利要求4所述的基因序列；

步骤2，用步骤1所述的表达载体转化宿主细胞；

步骤3，在适合所述抗体表达的条件下培养步骤2所得的宿主细胞；

步骤4，分离纯化获得所述的抗体。

8.如权利要求1所述的人源性抗体在制备血凝抑制禽流感H5N1病毒的药物中的应用。

9.如权利要求1所述的人源性抗体在制备对禽流感H5N1的HA抗原多种亚型具有高亲和力和中和活性的试剂中的应用。

10.如权利要求1所述的人源性抗体在鉴定识别HA抗原表位中的应用。

11.一种在H5型流感病毒中具有高度保守性的HA抗原表位肽序列，其特征在于，该HA抗原表位肽序列为如下氨基酸序列：KPNDAINF，如SEQ ID NO：11所示。

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