CN103735561A

CN103735561A - 内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法

Info

Publication number: CN103735561A
Application number: CN201410019071.6A
Authority: CN
Inventors: 刘浩; 储菲; 李晓明; 董清清; 蒋玉敏
Original assignee: BENGBU MEDICAL COLLEGE
Current assignee: BENGBU MEDICAL COLLEGE
Priority date: 2014-01-15
Filing date: 2014-01-15
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-01-15
Also published as: CN103735561B

Abstract

本发明给出了一种内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法，依次包括以下步骤：使用内质网应激诱导剂给小鼠灌胃，每只小鼠使用内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g，给药后8～48小时，完成小鼠急性肝损伤模型的建立；所述的内质网应激诱导剂采用以下方法配制：取（0.5～4）mg衣霉素溶于100μl二甲基亚砜配成储存液；取100μl储存液加19.9ml双蒸水至20ml，完成内质网应激诱导剂的配制。通过诱导内质网应激效应建立导致急性肝损伤的小鼠模型，对内质网应激作用机制的研究，既可以进一步了解细胞在应激状态下的自我调控能力，还可以进一步了解肝病的发生机制，从而对肝病采取一些新的干预、治疗措施，达到预防和治疗疾病的目的。

Description

内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法

技术领域

本发明涉及一种内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法。

背景技术

实验动物急性肝损伤模型是研究各种肝脏疾病的发病机制的与治疗药物筛选中必不可缺的一个工具。现已发现，许多肝脏疾病的发生发展均与内质网应激及其介导的细胞凋亡有关，包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、药物性肝病、急性肝衰竭、肝癌等。

制造实验性肝损伤动物模型的方法很多，虽然近年来国内外有关肝损伤模型的研究取得了显著进展，但由于肝脏功能复杂和肝损害因素的多样性，任何一种实验模型都不能全面、准确地反应特定肝损伤的本质。因此，肝损伤动物模型还需要进一步完善，肝损伤的机制复杂，尚待研究。

目前，用于急性肝损伤研究的动物模型主要有两种：化学性肝损伤模型和免疫性肝损伤模型。化学性肝损伤模型主要是由四氯化碳(CCl4)、D-半乳糖胺(D-Gal)、扑热息痛(APAP)、醋氨酚（AAP）、硫代乙酰胺(TAA)、磷、乙硫氨酸(DL-E)、氯化镉(CdCl2)、a-萘异硫酸酯(ANIT)、致黄素、乙醇等造模。免疫性肝损伤模型多采用刀豆蛋白A(ConA)、卡介苗+脂多糖(BCG+LPS)造模。

但上述肝损伤模型没有出现通过诱导内质网应激效应导致急性肝损伤的实验动物模型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种条件要求低，方法简便，造模周期短、建模成功率高的内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法，该方法通过诱导内质网应激效应建立导致急性肝损伤的小鼠模型。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法，依次包括以下步骤：

使用内质网应激诱导剂给小鼠灌胃，每只小鼠使用内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g，给药后8～48小时，完成小鼠急性肝损伤模型的建立；

所述的内质网应激诱导剂采用以下方法配制：

取0.5～4mg衣霉素溶于100μl二甲基亚砜配成储存液；取100μl储存液加19.9ml双蒸水至20ml，完成内质网应激诱导剂的配制。

采用这样的结构后，通过诱导内质网应激效应建立急性肝损伤的小鼠模型，对内质网应激作用机制的研究，既可以进一步了解细胞在应激状态下的自我调控能力，还可以进一步了解肝病的发生机制，从而对肝病采取一些新的干预、治疗措施，达到预防和治疗疾病的目的。

本发明中使用内质网应激诱导剂给小鼠灌胃，每只小鼠使用内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g，给药后24小时，完成小鼠急性肝损伤模型的建立；

并且内质网应激诱导剂采用2mg衣霉素溶于100μl二甲基亚砜配成储存液；取100μl储存液加19.9ml双蒸水至20ml；满足上述条件后实验效果最好。

附图说明

图1为实施例三中E3组的小鼠肝脏病理图。

图2为实施例中溶媒对照组的小鼠肝脏病理图。

图3为实施例中正常组的小鼠肝脏病理图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来介绍本发明的内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法。

首先选取相同遗传背景的普通级昆明种小鼠180只，随机分成6组，分别A组、B组、C组、D组、E组、F组，针对A组、B组两组，每组有小鼠10只；针对C组、D组、E组、F组四组，每组内有小鼠40只，常规条件下饲养，包括通风、洁净、恒温、自由进食、饮水，并保证正常繁殖。

依次按以下步骤建立双蒸水模型，简称正常组：

a）使用双蒸水（ddH₂O）给A组小鼠灌胃，双蒸水的用量为0.2ml/10g；

b）24小时后，将小鼠摘眼球取血，4℃离心10min(3000r/min)，分离取血清，测定血清中的AST，ALT(测定AST，ALT之前保证将所有小鼠统一禁食14～16小时，但不禁止饮水)；拉颈处死，取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，固定于10%甲醛，做病理备用，并制备10%肝匀浆液用于MDA，SOD的检测；

检测结果如下表：

检测A组10只小鼠肝脏无明显异常。

配制二甲基亚砜溶液，纯度大于99.8%的100μl二甲基亚砜(DMSO)加19.9ml双蒸水（ddH₂O）至20ml，完成二甲基亚砜溶液的配制。

依次按以下步骤建立二甲基亚砜溶液模型，简称溶媒对照组：

a）使用上述二甲基亚砜溶液给B组小鼠灌胃，二甲基亚砜溶液的用量为0.2ml/10g；

b）给药24小时后，将小鼠摘眼球取血，4℃离心10min(3000r/min)，分离取血清，测定血清中的AST，ALT(测定AST，ALT之前保证将所有小鼠统一禁食14～16小时，但不禁止饮水)；拉颈处死，取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，固定于10%甲醛，做病理备用，并制备10%肝匀浆液用于MDA，SOD的检测；

检测结果如下表：

检测B组10只小鼠肝脏无明显异常。

建立上述溶媒对照组模型和正常组模型作为参照，直观对比本发明各个实施例中的检测结果。

实施例一

配制内质网应激诱导剂，取纯度大于99%的0.5mg衣霉素(tunicamycin)粉末溶于纯度大于99.8%的100μl二甲基亚砜(DMSO)配成0.005mg/μl的储存液；取100μl储存液加19.9ml双蒸水（ddH₂O）至20ml，即将储存液稀释200倍后，完成内质网应激诱导剂的配制，并存放在-20℃环境避光保存备用。

依次按以下步骤建立小鼠急性肝损伤模型：

a）将C组小鼠随机分为四个比较组，每个比较组十只小鼠，并使用上述内质网应激诱导剂给C组小鼠灌胃，内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g；

b）按照不同的时间顺序依次将四个比较组中小鼠摘眼球取血，4℃离心10min(3000r/min)，分离取血清，测定血清中的AST，ALT(测定AST，ALT之前保证将所有小鼠统一禁食14～16小时，但不禁止饮水)；拉颈处死，取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，固定于10%甲醛，做病理备用；

检测结果如下表：

检测C组中40只小鼠肝脏病理结果显示均可见不同程度肝损伤改变。

实施例二

配制内质网应激诱导剂，取纯度大于99%的1mg衣霉素(tunicamycin)粉末溶于纯度大于99.8%的100μl二甲基亚砜(DMSO)配成0.01mg/μl的储存液；取100μl储存液加19.9ml双蒸水（ddH₂O）至20ml，即将储存液稀释200倍后，完成内质网应激诱导剂的配制，并存放在-20℃环境避光保存备用。

依次按以下步骤建立小鼠急性肝损伤模型：

a）将D组小鼠随机分为四个比较组，每个比较组十只小鼠，并使用上述内质网应激诱导剂给D组小鼠灌胃，内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g；

b）按照不同的时间顺序依次将四个比较组中小鼠摘眼球取血，4℃离心10min(3000r/min)，分离取血清，测定血清中的AST，ALT(测定AST，ALT之前保证将所有小鼠统一禁食14～16小时，但不禁止饮水)；拉颈处死，取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，固定于10%甲醛，做病理备用；检测结果如下表：

检测D组中40只小鼠肝脏病理结果显示均可见不同程度肝损伤改变。

实施例三

配制内质网应激诱导剂，取纯度大于99%的2mg衣霉素(tunicamycin)粉末溶于纯度大于99.8%的100μl二甲基亚砜(DMSO)配成0.02mg/μl的储存液；取100μl储存液加19.9ml双蒸水（ddH₂O）至20ml，即将储存液稀释200倍后，完成内质网应激诱导剂的配制，并存放在-20℃环境避光保存备用。

依次按以下步骤建立小鼠急性肝损伤模型：

a）将E组小鼠随机分为四个比较组，每个比较组十只小鼠，并使用上述内质网应激诱导剂给E组小鼠灌胃，内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g；

b）按照不同的时间顺序依次将四个比较组中小鼠摘眼球取血，4℃离心10min(3000r/min)，分离取血清，测定血清中的AST，ALT(测定AST，ALT之前保证将所有小鼠统一禁食14～16小时，但不禁止饮水)；拉颈处死，取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，固定于10%甲醛，做病理备用，并制备10%肝匀浆液用于MDA，SOD的检测；

检测结果如下表：

检测E组中40只小鼠肝脏病理结果显示均可见不同程度肝损伤改变。

实施例四

配制内质网应激诱导剂，取纯度大于99%的4mg衣霉素(tunicamycin)粉末溶于纯度大于99.8%的100μl二甲基亚砜(DMSO)配成0.04mg/μl的储存液；取100μl储存液加19.9ml双蒸水（ddH₂O）至20ml，即将储存液稀释200倍后，完成内质网应激诱导剂的配制，并存放在-20℃环境避光保存备用。

依次按以下步骤建立小鼠急性肝损伤模型：

a）将F组中小鼠随机分为四个比较组，每个比较组十只小鼠，并使用上述内质网应激诱导剂给F组小鼠灌胃，内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g；

b）按照不同的时间顺序依次将四个比较组中小鼠摘眼球取血，4℃离心10min(3000r/min)，分离取血清，测定血清中的AST，ALT(测定AST，ALT之前保证将所有小鼠统一禁食14～16小时，但不禁止饮水)；拉颈处死，取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，固定于10%甲醛，做病理备用（注：其中F1组有1只小鼠死亡，F2组有2只小鼠死亡，F3组有4只小鼠死亡，F4组有4只小鼠死亡。）；

检测结果如下表：

检测F组中小鼠肝脏病理结果显示均可见不同程度肝损伤改变，但是伴随着有实验小鼠的死亡。

如图1所示

比较上述实验数据，E3组中10只小鼠的肝脏不仅全部明显可见肝损伤改变，而且小鼠的存活率高，小鼠的肝细胞苏木精伊红染色法染色（400倍），肝细胞气球样变（图1箭头所示）明显和可见核碎裂和坏死，由此可见，E组选用2mg衣霉素配制的内质网应激诱导剂，配合小鼠给药后24小时，观察效果最好。

为了更好的说明本发明所达到效果，以下对比E3组的实验小鼠、溶媒对照组小鼠、正常组组小鼠，并用分光光度法测量肝匀浆中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的测试结果如下：

本模型能特异的通过诱导内质网应激效应导致急性肝损伤，为研究内质网应激与肝损伤的关系提供了靶向工具，可以进一步了解肝病的发生机制，为开发抗肝损伤药物提供新的作用靶点，为临床上肝脏疾病的防治提供新的思路和途径，同时也为抗肝损伤药物筛选提供了良好的工具，可用于药效观察。

由此可见，按照上述建立小鼠诱导内质网应激急性肝损伤模型的方法建模的成功率高，并且建模时间短，有明显肝损伤改变，足以供给肝脏实验的需求。

上述二甲基亚砜和衣霉素粉末都为市售产品。

以上所述的仅是本发明的四种实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明范围的前提下，还可以作出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法，依次包括以下步骤：

使用内质网应激诱导剂给小鼠灌胃，每只小鼠使用内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g，给药后8～48小时，完成小鼠急性肝损伤模型的建立。

2.根据权利要求1所述的内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法，其特征在于：所述的内质网应激诱导剂采用以下方法配制：

3.根据权利要求2所述的内质网应激诱导小鼠急性肝损伤模型的建立方法，其特征在于：使用内质网应激诱导剂给小鼠灌胃，每只小鼠使用内质网应激诱导剂的用量为0.2ml/10g，给药后24小时，完成小鼠急性肝损伤模型的建立；

所述的内质网应激诱导剂采用以下方法配制：取2mg衣霉素溶于100μl二甲基亚砜配成储存液；取100μl储存液加19.9ml双蒸水至20ml，完成内质网应激诱导剂的配制。