CN103667327B - 一种用于检测环境污染物的转基因斑马鱼的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测环境污染物的转基因斑马鱼的制备方法，包括：(1)从斑马鱼基因组中克隆Mdr1蛋白的启动子调控序列；(2)将克隆的DNA片段融合于GFP编码序列的上游构建表达载体；(3)将该表达载体进行斑马鱼胚胎显微注射；(4)将注射后的胚胎培养至性成熟，并与野生型斑马鱼交配产卵；(5)荧光显微镜下筛选阳性的F1代，继续自交传至F2代，得到稳定遗传的转基因品系。由于荧光蛋白的表达水平可受到重金属及多环芳烃等多种环境污染物浓度依赖性的诱导，因而本案所制备的转基因斑马鱼可用于探测环境中的上述化学污染物的存在及浓度，且具有经济、快速、方便、准确的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种环境污染物生物探测器的生产方法，具体涉及一种灵敏监测环境污染物浓度的转基因斑马鱼的构建方法。
背景技术
随着社会的发展，人类生产和利用的合成化学物质越来越多，这些物质通过各种途径进入环境中，不仅会引起水生生物死亡和水生态系统破坏，还会直接或间接威胁到人类健康。据世界卫生组织估计，重金属、多环芳烃及多氯联苯等化学污染物导致世界每年大约数百万人死亡，更是60～90％癌症的诱因。仅在中国，每年因工业污染物引发的新增癌症患者数量就高达94.5万。然而，当今社会已无法离开化学工业及其产品，为此，通过加强对环境中污染物水平的检测，进而限制工厂污染物排放就变得更为紧迫。
作为一种来自印度的热带淡水鱼，斑马鱼最初被用于发育生物学与遗传学的研究。由于其具有自身的独特优势，如：体型小、体外受精、卵生且产卵量大、胚胎透明且发育速度快，此外其培养液中可直接加入化学污染物，进而检测污染物毒性。因此，斑马鱼也逐渐被应用于环境毒理学研究中，而欧盟、美国及日本各国更是将斑马鱼列入环境保护标准测试生物中。
与此同时，根据污染物作用于斑马鱼后的生物学指标变化，结合绿色荧光蛋白(GFP)及红色荧光蛋白等转基因技术，研究者还构建了各种转基因斑马鱼模型使其可用于定量反映环境污染物浓度。如根据多环芳烃对于细胞色素酶(CYP)1A1的诱导作用，Hung等人构建了表达绿色荧光蛋白(CYP-GFP)的转基因斑马鱼，可在0.04μg/L多氯化三联苯的诱导下表达绿色荧光，提示环境中多环芳烃的含量超标(Hung K.W.，Suen M.F.，Chen Y.F.，Cai H.B.，MoZ.X.，Yung K.K.；Detection of water toxicity using cytochrome P450transgenic zebrafish as live biosensor：for polychlorinated biphenylstoxicity；Biosens Bioelectron，2012，31(1)，548-553)。复旦大学宋后燕、钟涛领衔的课题组则筛选出对雌激素类物质敏感的斑马鱼vtg基因启动子，据此构建了随vtg表达绿色荧光蛋白进而可直观监测环境中雌激素含量的转基因斑马鱼，响应浓度可达到μg/L级(Chen H.，Hu J.，Yang J.，WangY.，Xu H.，Jiang Q.，Gong Y.，Gu Y.，Song H.，Generation of a fluorescenttransgenic zebrafish for detection of environmental estrogens.AquatToxicol，2010，96(1)，53-61)。与传统环境检测方法相比，转基因斑马鱼模型具有快捷方便且经济有效等优势，但目前已有的监测模型往往仅能针对特定化学污染物进行反应，缺乏广谱性。
作为机体抵御外源物摄入的主要工具之一，Mdr1等ABC转运蛋白被发现高表达于受精24h后的斑马鱼中，可显著降低重金属毒素、多环芳烃和多氯联苯等多种毒素的积累及其毒性(Faria M.，Navarro A.，Luckenbach T.，Pina B.，Barata C.，Characterization of the multixenobiotic resistance(MXR)mechanism in embryos and larvae of the zebra mussel(Dfeissenapolymorpha)and studies on its role in tolerance to single and mixturecombinations of toxicants.AquatToxicol，2011，101(1)，78-87)。此外，我们的实验结果及文献(He Q.，Liu K.，Wang S.，Hou H.，Yuan Y.，WangX.，Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos.Drug Chem Toxicol，2012，35(2)，149-154)均表明，Mdr1可在毒素存在的情况下被诱导表达，从而提示可针对性地开发新的环境监测型斑马鱼。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测环境污染物的转基因斑马鱼的制备方法，该转基因斑马鱼可方便快捷地对多种化学污染物浓度进行监测，为水环境保护工作提供新的工具。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种用于检测环境污染物的转基因斑马鱼的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)，从斑马鱼基因组中克隆Mdr1蛋白的启动子调控序列；
步骤(2)，将步骤(1)中克隆的DNA片段融合于GFP编码序列的上游，构建成表达载体Mdr1promoter-GFP；
步骤(3)，将所述表达载体Mdr1promoter-GFP进行斑马鱼胚胎显微注射；
步骤(4)，将注射后的胚胎培养至性成熟，并与野生型斑马鱼交配产卵；
步骤(5)，荧光显微镜下筛选阳性的F1代，继续自交传至F2代，得到稳定遗传的转基因品系。
优选地，所述的用于检测环境污染物的转基因斑马鱼的制备方法，步骤(1)中克隆的DNA片段来源于Mdr1蛋白编码基因的ATG起始密码子5’端上游的280bp序列。
优选地，所述的用于检测环境污染物的转基因斑马鱼的制备方法，在步骤(3)中，所述表达载体Mdr1promoter-GFP注入的时间点为斑马鱼受精卵单细胞时期。
本发明的有益效果是：通过本案的制备方法生产出的转基因斑马鱼可稳定表达绿色荧光蛋白，且蛋白表达水平受外源性化学污染物浓度依赖性的诱导，因而该转基因斑马鱼可用于探测环境中的重金属及多环芳烃等化学污染物的存在及浓度，且其具有经济、快速、方便、准确等优点。
附图说明
图1为转基因斑马鱼胚胎培养至24hpf时，氯化镉处5h后，GFP基因表达被氯化镉浓度依赖性的诱导的PCR结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1-转基因斑马鱼的制备方法
(1)从斑马鱼基因组中克隆Mdr1蛋白的启动子调控序列，即Mdr1蛋白编码基因的ATG起始密码子的5’端上游280bp的一段DNA序列；
通过mRNA序列与斑马鱼基因组序列的BLASTIN程序比对分析，在GENEBANK上找到斑马鱼Mdr1基因的启动子序列，设计对应的正反向引物，两端分别接入XhoI和BamHI的酶切稳点，高保真PCR的方法扩增到片段，此片段进一步连接到pGME-T载体中，经过测序后确认此克隆为目标片段。
(2)构建表达载体mdr1promoter-GFP
用XhoI和BamHI将斑马鱼Mdr1启动子280bp从载体上切下，装入pEGFP载体中，所得到的重组表达载体mdr1promoter-GFP，包含斑马鱼Mdr1基因的调控序列和GFP编码序列。
(3)显微注射
收集单细胞时期的斑马鱼受精卵，将约2μl的载体溶液装入微电极中，显微注射到细胞浆中，每个胚胎约2nl，胚胎培养到性成熟。
(4)转基因斑马鱼的获得
将转基因斑马鱼与野生型杂交，通过重金属镉处理和荧光筛选，获得具有稳定绿色荧光表达的转基因斑马鱼。之后提取胚胎的基因组DNA，用GFP的特异性引物来扩增出对应大小的片段进行测序确认。
实施例2一转基因斑马鱼环境监测效果验证
(1)配制含一系列浓度氯化镉(Cd)的斑马鱼培养液
分别配制含10ug/L、100ug/L、1000ug/L Cd的斑马鱼培养液以及不含Cd的空白斑马鱼培养液。
(2)重金属Cd诱导斑马鱼荧光蛋白的表达
24hpf预培养后，斑马鱼胚胎置于含系列浓度Cd的培养液中，5hpf后，荧光显微镜下镜检，可验证胚胎随Cd浓度的升高，表达出更强的绿色荧光。其他重金属亦可诱导斑马鱼荧光蛋白的表达。
(3)PCR验证
提取经Cd预处理后的胚胎DNA，PCR检测其中GFP的表达情况，请参见图1，可知，随Cd浓度的提高，GFP表达量逐渐升高。即该转基因斑马鱼可良好地检测水环境中镉离子的存在。在本实施例中只列举了Cd的数据，该转基因斑马鱼同样可检测水环境中其他重金属离子及多环芳烃的存在。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (1)
1.一种用于检测环境污染物的转基因斑马鱼的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，从斑马鱼基因组中克隆Mdr1蛋白的启动子调控序列；
步骤(2)，将步骤(1)中克隆的DNA片段融合于GFP编码序列的上游，构建成表达载体Mdr1promoter-GFP；
步骤(3)，将所述表达载体Mdr1promoter-GFP进行斑马鱼胚胎显微注射；
步骤(4)，将注射后的胚胎培养至性成熟，并与野生型斑马鱼交配产卵；
步骤(5)，荧光显微镜下筛选阳性的F1代，继续自交传至F2代，得到稳定遗传的转基因品系；
步骤(1)中克隆的DNA片段来源于Mdr1蛋白编码基因的ATG起始密码子5’端上游的280bp序列；
在步骤(3)中，所述表达载体Mdr1promoter-GFP注入的时间点为斑马鱼受精卵单细胞时期。
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