CN103623465A - 一种可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架及制备方法，通过将组织工程骨材料浸润在双磷酸盐溶液中，使双磷酸盐复合在组织工程骨材料上。本发明制备的组织工程骨支架适用于负重区骨缺损修复,能够更好的维持植入骨力学性能稳定，能够抑制宿主对植入骨材料的吸收降解作用，能够更长久的给予力学支撑；并且能够局部缓慢释放出双磷酸盐，局部抑制破骨细胞导致的骨吸收作用和促进成骨细胞的骨生成作用，能够局部调节成破骨活性，促进植入骨材料与宿主骨的整合，有利于骨修复的爬行替代过程，对骨修复具有巨大的优势。

Description

一种可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架及制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及双磷酸盐复合的组织工程骨支架及制备方法。

背景技术

由于某种因素如外伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等而使骨丧失了一些骨质，形成较大的间隙，称为骨缺损。骨缺损在临床上比较常见，其治疗特别是大段骨缺损的治疗是一个非常棘手的问题。

目前临床工作中，骨缺损的治疗方法有自体骨移植、异体或异种骨移植、人工合成骨替代品填充等，这些方法各有优缺点。对于非负重区骨缺损可以采用多种骨材料的填充，为填充式修复。但是对于负重区的骨缺损，由于存在应力分布，往往会导致填充的骨材料降解吸收，失去有效的力学支撑，所以对于负重区的骨缺损修复而言，提供有效的力学支撑的同时并能阻止宿主对植入物的吸收是修复的关键。自体骨移植被认为是骨缺损修复的金标准，这是因为自体骨具有卓越的成骨活性，能够有效的和植入骨周围组织有效整合；然而患者却需要承受自体骨取骨的手术打击，并且自体骨的可供骨量也十分有限，往往不能满足缺损修复的需求，并且供骨区的术后疼痛、感染、缺损畸形等并发症也会给患者带来额外的痛苦和损伤。

组织工程的出现为骨缺损修复提供了新的治疗思路。组织工程是将种子细胞接种于各种支架材料上，细胞外基质的分泌和材料的吸收协调进行，最终形成由细胞和细胞外基质组成的与材料形状相同的新生组织，达到结构与功能的良好修复。目前骨组织工程的基础研究和临床应用进展迅速，有望解决传统骨缺损治疗方法中存在的问题，因此具有广阔的发展前景和临床应用价值。

生物材料作为细胞载体，为细胞生长提供三维空间结构，理想的支架材料应满足下列条件：良好的生物相容性、细胞亲和性和骨传导性；降解速率和新生骨生成速率相匹配；具有类似无机骨的三维立体多孔结构，孔隙率大小利于细胞點附增殖和血管长入；良好的生物力学性能，利于塑形，价格低廉利于临床推广等。

目前骨组织工程中应用的材料有钙磷陶瓷、可降解有机高分子和生物衍生材料等。前两者生物相容性存在一定问题，降解产生的物质易于产生炎症和组织反应；后者生物相容性相对较好，且有一定的骨诱导能力，但力学性能相对较差，不适合用于承重骨缺损的修复。

异体或者异种骨组织经过清洗脱脂、深低温冷冻去除抗原等程序可以制成冻干骨材料。冻干骨在临床上被广泛应用于骨缺损的充填修复，关节和脊柱的融合以及骨矫形重建手术等。在冻干骨材料的临床应用中，人们发现异体骨组织经过清洗脱脂、冷冻干燥以及辐照灭菌的加工程序后，虽然可以降低其免疫原性，但是其天然活性成份也有所丢失或者部分丢失，成骨活性下降，由此导致与宿主骨整合效果不足，骨缺损愈合时间延长，出现植入骨组织被吸收，成骨活性下降，植入骨组织力学性能降低，畸形愈合或者骨不连等。如何避免植入后植入骨组织力学性能的减低，尽快实现宿主骨与植入骨的有效整合是目前临床应用需要解决的问题。

自从1969年Fleisch报道了双磷酸盐类化合物可作用于羟基磷灰石结晶的过程，在体内、体外均具有抑制骨吸收作用以来，至今人类已合成出双磷酸盐类化合物约300多个，是国际上药物研究的热点之一，是近30年来发展起来的抗代谢性骨病的一类新药。双磷酸盐是人工合成的一类焦磷酸类似物，有两个突出的结构特点，其一：以P-C-P基团取代焦磷酸盐结构中的P-0-P基团，使得双磷酸盐不但能够紧密地吸附在羟磷灰石的表面，又避免了像焦磷酸盐那样在体内被骨的焦磷酸酶所降解，能在体内保持一定的稳定性；其二：P-C-P基团C键的两个侧链R1和R2的分子结构。通常R1侧链为羟基以保证双磷酸盐同骨矿物的最大亲和性，若R1改为氯或氢原子，则与骨矿物结合力明显减弱，如为烷羟基，则几乎没有亲和力。R2侧链的结构则对双磷酸盐的抗骨吸收性质起着决定性的作用。对其结构改变的探索过程恰恰演绎了双磷酸盐的发展史。

第一代双磷酸Etidronate为羟基，当发展到第二代Pamidronate，含氮双磷酸盐出现，其抗骨吸收能力是不含氮的100倍以上。将含氮基团甲基化或引入含氮杂环，它们的抗骨吸收能力还将进一步提高，如第三代双磷酸盐阿仑膦酸钠是在Pamidronate的胺烷基上增加了一个亚甲基，其抗骨吸收强度即增加10倍。Ibandronate，Risedronate和Zoledronate含有第二位或第三位的氨基，是目前最强的双磷酸盐。双磷酸盐进入体内后，凭借对骨矿的高度亲和性，很快结合在骨表面。破骨细胞以胞饮的方式摄入双磷酸盐，引起破骨细胞的形态结构发生改变，导致破骨细胞功能丧失，诱导破骨细胞的凋亡，缩短破骨细胞寿命，减少破骨细胞数量从而达到削弱破骨细胞骨吸收作用。并且有研究发现一定浓度的双磷酸盐可以增强BMP-2基因的表达，促进成骨细胞增殖，减少骨细胞凋亡，促进骨组织生成。

国外的一些实验研究将同种异体骨组织打压或置入一个Chamber中，并采用双磷酸盐对其中的同种异体骨组织进行浸润处理后，将Chamer植入大鼠胫骨内，观察到双磷酸盐能够有效抑制宿主对植入同种异体骨组织的吸收，较好的保留了异体骨的骨量和力学性质（OlaBelfrage,Gunnar Flivik,Martin Sundberg,Uldis Kesteris,and Magnus

Local treatment ofcancellous bone grafts with BMP-7and zoledronate increases both the bone formation rate andbone density A bone chamber study in rats.Acta Orthopaedica2011;82(2):228–233）。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架，该组织工程骨支架适用于负重区骨缺损修复。

本发明的又一目的在于提供上述组织工程骨支架的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架，是通过将组织工程骨材料浸润在双磷酸盐溶液中，使双磷酸盐复合在组织工程骨材料上形成的。

进一步地，所述组织工程骨支架为同种异体皮质骨松质骨或异种皮质骨、松质骨的冻干骨。

进一步地，所述双磷酸盐，包括：依替膦酸钠（Etidronate）、氯屈膦酸钠（Clodronate）、帕米膦酸二钠（Pamidronate）、阿伦膦酸钠（Alendrinate）、伊班膦酸钠（Ibandronate）和唑来膦酸（Zoledronate）。

进一步地，所述双磷酸盐溶液的浓度限定在10^-4M至10^-7M之间。

上述组织工程骨材料的制备方法，包括以下步骤：

1)去除骨材料的脂肪组织；

2)将骨材料置于-80℃冰箱冻存90天以上，去除组织抗原性；

3)将骨材料浸润在双磷酸盐溶液中；

4)将复合双磷酸盐的组织工程骨材料彻底清洗，去除游离双磷酸盐溶液。

进一步地，步骤1）中，新鲜骨材料要经过以下处理：去除骨膜及周围软组织，灭菌蒸馏水喷枪高压冲洗，尽量去除血液成分及脂肪组织。

进一步地，步骤1）中，采用超临界二氧化碳处理技术去除骨材料的脂肪组织，二氧化碳的临界温度在25℃至35℃之间，临界压力在65atm至75atm之间。

进一步地，通过超临界二氧化碳处理技术处理骨材料前，将骨组织切割为：松质骨颗粒大小为：1mm³至9cm³之间；松质骨柱大小为：长度0.3cm-10cm，直径0.3cm-5cm；皮质骨柱大小：长度1cm-30cm，直径0.5cm-5cm。

进一步地，步骤3）中，所述骨材料和双磷酸盐溶液质量体积比在1：1至1：100之间，浸润时间1秒至48小时之间，浸润溶液温度控制在4-65℃之间。

进一步地，上述制备方法，还包括：将步骤4）得到的复合双磷酸盐的组织工程骨材料置于冷冻干燥机中冻干36小时至72小时。

进一步地，所述冻干机井内温度在-50℃至-60℃之间，工作压强在1×10^-3mmHg至1×10^-5mmHg之间。

进一步地，上述制备方法，还包括：复合双磷酸盐的组织工程骨支架冻干结束后，立即用双层血浆袋封装。

进一步地，上述制备方法，还包括：将封装好的复合双磷酸盐的组织工程骨支架用Gamma射线辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，辐照时间5-10小时。

本发明的可调节局部成破骨活性的组织工程骨支架与普通冻干骨相比具有以下优势：

1)可调节局部成破骨活性的组织工程骨支架，适用于负重区骨缺损修复，能够更好的维持植入骨力学性能稳定，能够抑制宿主对植入骨材料的吸收降解作用，能够更长久的给予力学支撑。

2)可调节局部成破骨活性的组织工程骨支架，适用于负重区骨缺损修复，能够局部缓慢释放出双磷酸盐，局部抑制破骨细胞导致的骨吸收作用和促进成骨细胞的骨生成作用，能够局部调节成破骨活性，促进植入骨材料与宿主骨的整合，有利于骨修复的爬行替代过程。

3)在不采用chamber的情况下，特定浓度双磷酸盐处理过的组织工程骨不但能有效的抑制宿主对异体骨的吸收，而且还能显著的提高植入部位的宿主骨的新骨形成能力，对骨修复具有巨大的优势。

附图说明

图1.对照组异种松质骨植入后6周胫骨近端Micro-CT扫描图。

图2.唑来膦酸复合后的异种松质骨植入后6周胫骨近端Micro-CT扫描图。

图3.实验组与对照组BMD比较，*P<0.05。

图4.实验组与对照组BVF比较，*P<0.05。

图5.实验组与对照组最大力学载荷比较，*P<0.05。

图6.实验组与对照组刚度（KN/mm）比较，*P<0.05。

具体实施方式

实施例1

取新鲜成年猪股骨髁，去除周围骨膜和软组织，灭菌蒸馏水喷枪高压冲洗，尽量去除血液成分及脂肪组织。将股骨髁松质骨制成直径3mm，长度4mm的圆柱形松质骨骨柱5个，采用超临界二氧化碳处理技术对骨材料去除脂肪组织，二氧化碳的临界温度为31.265℃，临界压力为72.9atm。置于-80℃冰箱冻存100天。采用无菌蒸馏水配制唑来膦酸（Zometa；Novartis，North Ryde，NSW，Australia）溶液，唑来膦酸溶液的浓度为10^-5M，骨柱和唑来膦酸溶液质量体积比为1：5，放置在37℃温度温箱浸润24小时。浸润结束后用无菌去离子水喷枪彻底清洗，去除游离双磷酸盐溶液。将复合唑来膦酸骨柱置于冷冻干燥机中冻干48小时。冻干机井内温度为-53℃，工作压强为1×10^-4mmHg。冻干结束后，立即用双层血浆袋封装。Gamma射线辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，辐照时间7小时。

对照组为浸润无菌蒸馏水24小时的骨柱5个，其余处理与唑来膦酸组完全一致。将所有骨柱随机植入10只体重在250±20g的标准SD雄性大鼠右侧胫骨平台，植入后6周脱颈处死所有试验动物，取右侧胫骨近端进行Micro-CT扫描观察，分辨率为27微米。结果显示：对照组异种松质骨植入后6周，植入物形状不规则，植入物降解明显（见图1）；唑来膦酸组植入的复合唑来膦酸组织工程骨结构形状规则并且完整，植入物未见明显降解，植入部位宿主骨密度显著增高，成骨显著强于对照组（见图2）。

实验组胫骨近段骨密度（Bone Mineral Density，BMD）为519.97±19.47mg/cc显著高于对照组301.86±21.11mg/cc(P<0.05)（见图3）；实验组胫骨近段骨体积分数（Bone VolumeFraction，BVF）为0.71±0.03显著高于对照组0.39±0.02(P<0.05)（见图4）。

上述Micro-CT扫描观察完成后我们将植入物远端及近段各3mm范围内截除，在力学机上进行胫骨长轴的力学破坏加载实验，结果发现实验组的最大力学载荷为132.31±6.25N，显著高于对照组70.13±5.41N（见图5）；实验组的胫骨近端刚度为59.91±5.13N/mm，显著高于对照组30.80±3.76N/mm（见图6）。本实施例中，骨柱浸润唑来膦酸后，局部与骨柱复合的唑来膦酸约为20±5ug，该给药量显著小于发明专利（公开号CN1529604A）所要求的给药浓度，并且显著高于Ola Belfrage等文献报道使用在Chamber实验中的浓度（4ug/植入物）。通过研究我们发现10^-4M至10^-7M之间的双磷酸盐处理后骨柱能最合适的保留植入骨的结构并促进与宿主骨的有效整合。

实施例2

取新鲜成年猪股骨髁，去除周围骨膜和软组织，灭菌蒸馏水喷枪高压冲洗，尽量去除血液成分及脂肪组织。将股骨髁松质骨制成直径3mm，长度4mm的圆柱形松质骨骨柱，采用超临界二氧化碳处理技术对骨材料去除脂肪组织，二氧化碳的临界温度为25℃，临界压力为75atm。置于-80℃冰箱冻存90天。采用无菌蒸馏水配制依替膦酸钠（Etidronate）溶液，依替膦酸钠溶液的浓度为10^-4M，骨柱和依替膦酸钠溶液质量体积比为1：1，放置在65℃温度温箱浸润1秒。浸润结束后用无菌去离子水喷枪彻底清洗，去除游离双磷酸盐溶液。将复合依替膦酸钠骨柱置于冷冻干燥机中冻干36小时。冻干机井内温度为-50℃，工作压强为1×10^-5mmHg。冻干结束后，立即用双层血浆袋封装。Gamma射线辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，辐照时间10小时。

实施例3

取新鲜成年猪股骨髁，去除周围骨膜和软组织，灭菌蒸馏水喷枪高压冲洗，尽量去除血液成分及脂肪组织。将股骨髁松质骨制成直径3mm，长度4mm的圆柱形松质骨骨柱，采用超临界二氧化碳处理技术对骨材料去除脂肪组织，二氧化碳的临界温度为35℃，临界压力为65atm。置于-80℃冰箱冻存150天。采用无菌蒸馏水配制阿伦膦酸钠（Alendrinate）溶液，阿伦膦酸钠溶液的浓度为10^-7M，骨柱和阿伦膦酸钠溶液质量体积比为1：100，放置在4℃温度温箱浸润48小时。浸润结束后用无菌去离子水喷枪彻底清洗，去除游离双磷酸盐溶液。将复合阿伦膦酸钠骨柱置于冷冻干燥机中冻干72小时。冻干机井内温度为-60℃，工作压强为1×10^-3mmHg。冻干结束后，立即用双层血浆袋封装。Gamma射线辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，辐照时间5小时。

Claims (10)

1.一种可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架，是通过将组织工程骨材料浸润在双磷酸盐溶液中，使双磷酸盐复合在组织工程骨材料上形成的。

2.如权利要求1所述的可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架，其特征在于，所述组织工程骨材料为同种异体皮质骨、松质骨或异种皮质骨、松质骨的冻干骨。

3.如权利要求1所述的可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架，其特征在于，所述双磷酸盐，包括：依替膦酸钠、氯屈膦酸钠、帕米膦酸二钠、阿伦膦酸钠、伊班膦酸钠和唑来膦酸。

4.如权利要求1所述的可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架，其特征在于，所述双磷酸盐溶液的浓度为10^-4～10^-7M。

5.权利要求1-4任一所述的可局部调节成破骨活性的组织工程骨支架的制备方法，包括以下步骤：

1)去除骨材料的脂肪组织；

2)将骨材料置于-80℃冰箱冻存90天以上，去除组织抗原性；

3)将骨材料浸润在双磷酸盐溶液中；

4)将复合双磷酸盐的组织工程骨材料彻底清洗，去除游离双磷酸盐溶液。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，采用超临界二氧化碳处理技术去除骨材料的脂肪组织，二氧化碳的临界温度为25～35℃，临界压力为65～75atm。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述骨材料和双磷酸盐溶液质量体积比为1：1～1：100，浸润时间1s～48h，浸润溶液温度4～65℃。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括：将步骤4）得到的复合双磷酸盐的组织工程骨支架置于冷冻干燥机中冻干36h～72h，所述冻干机井内温度为-60～-50℃，工作压强为1×10^-3～1×10^-5mmHg。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，还包括：复合双磷酸盐的组织工程骨支架冻干结束后，立即用双层血浆袋封装。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括：将封装好的复合双磷酸盐的组织工程骨支架用Gamma射线辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，辐照时间5-10小时。

Images