CN103589669A - 一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备和使用方法 - Google Patents

一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备和使用方法 Download PDF

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本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备和使用方法。耐盐脱氮复合菌剂由具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌、具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌和具有耐盐特性的盐单胞菌按照体积比1:1:（10~20）:（60~85）混合组成，采用上述耐盐脱氮复合菌剂对高盐废水进行脱氮处理，脱氮率至少为95%，出水水质达标排放。本发明的复合菌剂中四种微生物相互作用、相互影响，氨氮和总氮去除率高于任何一种微生物单独使用的效果，由于复合菌剂的耐受冲击能力比纯化的菌株强，能有效促进同步硝化反硝化的进行，使高盐废水脱氮效果明显提高。

Description

一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备和使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备和使用方法。
背景技术
高盐废水中除含有大量的有机污染物外，还具有大量的氯离子，这对高盐废水的传统生化处理产生了负面的影响。无机盐类在微生物生长过程中起着促进酶反应、维持膜平衡和调节渗透压的重要作用。但氯离子浓度过高，会对微生物的生长产生抑制，其主要原因在于：
（1）盐浓度过高时渗透压高，使微生物细胞脱水，引起细胞原生质分离；
（2）在含盐浓度高的情况下，盐析作用会使脱氢酶活性降低；
（3）高氯离子浓度对细菌有毒害作用；
（4）由于水的密度增加，活性污泥容易上浮流失。
一般来说海水的盐度在3%左右，工业上把盐度和海水相当甚至超过海水的废水成为高盐废水。目前对高盐废水的处理可分为物理化学法和生物法两大类，由于此类废水的溶解性有机物含量高，一般物理、化学方法难以处理并且处理成本高，而生物处理法具有经济、高效、无害的特点，仍然是首选的处理方法。但当废水中含有暂时性有毒物质，对微生物有毒害作用，用一般生物方法治理，降解速率较慢，菌种需要较长的一段时间来适应，而通过投加优势菌株可迅速有效降解目标污染物。由于生物处理系统是一个十分复杂的系统，投加单一菌株无法达到最佳处理状态。因此需要一种既可以脱氮又耐盐的复合菌剂来提高高盐废水的脱氮效率。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备和使用方法，目的是通过四种微生物相互作用、相互影响，明显提高高盐废水的脱氮效果。
一种耐盐脱氮复合菌剂，由具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌(Halomonas sp.)、具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌(Halomonas sp.)、具有硝化特性的芽胞杆菌(Bacillus sp.)和具有耐盐特性的盐单胞菌(Halomonas sp.)按照体积比1:1:（10~20）:（60~85）混合。
其中，所述的具有耐盐特性的盐单胞菌的菌落颜色为乳白色，菌株个体呈圆形，无芽孢，革兰氏染色为阴性，边缘整齐光滑，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用多种碳源。
所述的具有硝化特性的芽胞杆菌的菌落颜色为乳白色，菌株个体呈杆状，革兰氏染色为阳性，接触酶阳性，过氧化氢酶阳性。
所述的具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌的菌落颜色为乳白色，菌株个体呈圆形，无芽孢，革兰氏染色为阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用多种碳源。
所述的具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌菌落颜色为乳白色，菌株个体呈圆形，无芽孢，革兰氏染色为阴性，边缘整齐光滑，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用多种碳源。
上述耐盐脱氮复合菌剂的制备方法按照以下步骤进行：
（1）将具有耐盐特性的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌、具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌和具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌分别接种于固体培养基上进行活化；
（2）用接菌环取上述活化的四种菌落分别接种于相应的液体培养液中，在30℃、125r/min条件下进行恒温振荡，并在好氧条件下培养1~2天，获得四种液体菌剂种子液；
（3）将上述种子液扩大培养后，将扩大培养的具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌、具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌和具有耐盐特性的盐单胞菌按照体积比1:1:（10~20）:（60~85）混合，即为得到耐盐脱氮复合菌剂；
或者将步骤（2）中得到的四种液体菌剂种子液按照体积比1:1:（10~20）:（60~85）体积比混合，再进行扩大培养。
所述的具有耐盐特性的盐单胞菌的液体培养液配方为：牛肉膏：10g/L，蛋白胨：10g/L，NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：11.53g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；步骤（1）中所述的活化用固体培养基是在上述成分中加入占总重量加2%的琼脂粉。
所述的具有硝化特性的芽胞杆菌的液体培养液配方为：NaNO2：1g/L，MnSO4.H2O：0.01g/L，K2HPO4：0.75g/L，Na2CO3：1g/L，KH2PO4：0.75g/L，维生素液：2mL/L，微量元素液：2mL/L，NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；步骤（1）中所述的活化用固体培养基是在上述成分中加入占总重量加2%的琼脂粉。
所述的具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌和具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌的液体培养液配方为：CH3COONa：5g/L，K2HPO4：1g/L，FeSO4.7H2O：0.05g/L，NaNO2：0.8g/L，NaNO3：1g/L，维生素液：2mL/L，微量元素液：2mL/L，NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；其中微生素液的成分是 (g/L)：钴铵素 0.01；抗坏血酸 0.025；核黄素 0.025；柠檬酸 0.02；毗多醛 0.05；叶酸 0.01；对氨基苯甲酸 0.01；肌酸 0.025。 微量元素液的成分是（g/L）：Na2EDTA  63.70；ZnSO4  2.20;CaCl2  5.50；MnCl2.4H2O  5.06；FeSO4.7H2O 5.00；Na2Mo4.4H2O 1.10;CuSO4.5H2O 1.57；CoCl2.6H2O 1.61；步骤（1）中所述的活化用固体培养基是在上述成分中加入占总重量加2%的琼脂粉。
所述的扩大培养的扩大培养液的成分为：NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；控制其氨氮浓度为100 ~120mg/L，碳氮质量比（15~20）:1。培养条件：温度为25~30℃，pH为7~7.5，溶解氧为0.25 ~0.3mg/L，培养过程中pH不需要调节。
采用上述耐盐脱氮复合菌剂对高盐废水进行脱氮处理，按照以下步骤进行：
将耐盐脱氮复合菌剂按体积比5~8%接种到普通活性污泥中，通入待处理的高盐废水，控制废水温度为25~30℃、pH为7~7.5，在周期为10~14h的缺氧-好氧交替条件下进行处理 3~5天，脱氮率至少为95%，出水水质达标排放。
 与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
本发明复合菌剂中耐盐菌在高盐条件下能够去除COD；耐盐硝化菌能以氨氮为氮源进行硝化反应，脱氮的同时能去除COD；两株耐盐反硝化菌均能以氨氮作为氮源进行异养硝化-好氧反硝化同步脱氮，在脱氮的同时能去除COD，其中一株脱氮过程中有亚硝氮积累，一株脱氮过程中无亚硝氮积累。应用于含氨氮的高盐废水的同步硝化-反硝化脱氮处理过程。在含氮的高盐废水处理过程中，这四种微生物相互作用、相互影响，氨氮和总氮去除率高于任何一种微生物单独使用的效果，由于复合菌剂的耐受冲击能力比纯化的菌株强，能有效促进同步硝化反硝化的进行，使高盐废水脱氮效果明显提高。
具体实施方式
本发明中所述的具有耐盐特性的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌、具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌和具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌的菌种是购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
一种耐盐脱氮复合菌剂，由具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌、具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌和具有耐盐特性的盐单胞菌按照体积比1:1: 10: 85混合。
上述耐盐脱氮复合菌剂的制备方法按照以下步骤进行：
（1）将本发明具有耐盐特性的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌、具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌和具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌分别接种于固体培养基上进行活化；
（2）用接菌环取上述活化的四种菌落分别接种于相应的液体培养液中，在30℃、125r/min条件下进行恒温振荡，并在好氧条件下培养1~2天，获得四种液体菌剂种子液；
（3）将上述种子液扩大培养后，将扩大培养的由具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌、具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌和具有耐盐特性的盐单胞菌按照体积比1:1: 10: 85混合，，即为得到耐盐脱氮复合菌剂；
所述的具有耐盐特性的盐单胞菌的液体培养液配方为：牛肉膏：10g/L，蛋白胨：10g/L，NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：11.53g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；步骤（1）中所述的活化用固体培养基是在上述成分中加入占总重量加2%的琼脂粉。
所述的具有硝化特性的芽胞杆菌的液体培养液配方为：NaNO2：1g/L，MnSO4.H2O：0.01g/L，K2HPO4：0.75g/L，Na2CO3：1g/L，KH2PO4：0.75g/L，维生素液：2mL/L，微量元素液：2mL/L，NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；步骤（1）中所述的活化用固体培养基是在上述成分中加入占总重量加2%的琼脂粉。
所述的具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌和具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌的液体培养液配方为：CH3COONa：5g/L，K2HPO4：1g/L，FeSO4.7H2O：0.05g/L，NaNO2：0.8g/L，NaNO3：1g/L，维生素液：2mL/L，微量元素液：2mL/L，NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；步骤（1）中所述的活化用固体培养基是在上述成分中加入占总重量加2%的琼脂粉。
所述的扩大培养的扩大培养液中的氨氮浓度为100mg/L，碳氮质量比15：1；NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；培养条件：温度为25℃，pH为7，溶解氧为0.25mg/L，培养过程中pH不需要调节。
采用上述耐盐脱氮复合菌剂对高盐废水进行脱氮处理，按照以下步骤进行：
在8L的SBR反应器中进行，初始氨氮质量浓度为100/L左右，COD质量浓度为1500 mg/L左右。
将耐盐脱氮复合菌剂按体积比5%加入到MLSS浓度为2200mg/L的活性污泥中，控制温度为25℃、pH为7，溶解氧为0.11 mg/L~3.9 mg/L的缺氧-好氧交替条件下处理盐度为3%的废水，处理周期为14h，接种4天后，出水水质达到启动要求，氨氮的去除率稳定，均为95.76%。
实施例2
一种耐盐脱氮复合菌剂，由具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌、具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌和具有耐盐特性的盐单胞菌按照体积比1:1:15:70混合。
上述耐盐脱氮复合菌剂的制备方法按照以下步骤进行：
（1）将本发明具有耐盐特性的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌、具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌和具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌分别接种于固体培养基上进行活化；
（2）用接菌环取上述活化的四种菌落分别接种于相应的液体培养液中，在30℃、125r/min条件下进行恒温振荡，并在好氧条件下培养2天，获得四种液体菌剂种子液；
（3）将步骤（2）中得到的四种液体菌剂种子液按照体积比1:1:15:70混合，再进行扩大培养，扩大培养液中的氨氮浓度为120mg/L，碳氮质量比20：1；NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；培养条件：温度为30℃，pH为7.5，溶解氧为0.3mg/L，培养过程中pH不需要调节，得到耐盐脱氮复合菌剂。
采用上述耐盐脱氮复合菌剂处理高盐废水按照以下步骤进行：
在SBR反应器中，高盐废水初始氨氮质量浓度为120mg/L左右，COD质量浓度为1800mg/L左右。
将耐盐脱氮复合菌剂按体积比8 %投加到MLSS浓度为2800mg/L的活性污泥中，在温度为30℃、pH为7.5、溶解氧为0.11mg/L ~ 3.9mg/L的缺氧-好氧交替条件下处理盐度为3%的废水，处理周期为10~14h，接种3天后，出水水质达到启动要求，氨氮的去除率稳定。
对复合菌剂模拟高盐废水盐度冲击试验，在上述接种3天后，分别将进水水质的盐度改变为0%、5%和7%，经过10个周期的盐度冲击，再将进水水质盐度变为3%的废水，其中盐度冲击为5%和7%的废水分别经过6~8个和7~9个周期的系统恢复，脱氮率分别为94%~96%和93.5%~95%，其出水水质均符合城镇污水处理厂污染物一级A或B排放标准；盐度冲击为0%的废水经过10~12个周期的系统恢复，脱氮率为45%~50%，再次投加体积比3%~5%的复合菌剂，接种3~5个周期后，脱氮率达到94%~96%，其出水水质符合城镇污水处理厂污染物一级A或B排放标准。
实施例3
一种耐盐脱氮复合菌剂，由具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌、具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌和具有耐盐特性的盐单胞菌按照体积比1:1:20:60混合。
上述耐盐脱氮复合菌剂的制备方法与实施例2相同，不同之处是四种液体菌剂种子液按照体积比1:1:20:60混合，再进行扩大培养，扩大培养液中的氨氮浓度为120mg/L，碳氮质量比18：1；NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；培养条件：温度为28℃，pH为7.05，溶解氧为0.28mg/L，培养过程中pH不需要调节，得到耐盐脱氮复合菌剂。
采用上述耐盐脱氮复合菌剂处理高盐废水按照以下步骤进行：
将耐盐脱氮复合菌剂按体积比6%加入到盐度为3%的废水中，控制温度为25℃、pH为7.2，溶解氧为0.11mg/L~3.9 mg/L的缺氧-好氧交替条件下处理盐度为3%的废水，处理周期为12h，接种5天后，出水水质达到启动要求，氨氮的去除率稳定，为96.89%。

Claims (7)

1.一种耐盐脱氮复合菌剂，其特征在于由具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌、具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌和具有耐盐特性的盐单胞菌按照体积比1:1:（10~20）:（60~85）混合组成。
2.如权利要求1所述的一种耐盐脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：
（1）将具有耐盐特性的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌、具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌和具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌分别接种于固体培养基上进行活化；
（2）用接菌环取上述活化的四种菌落分别接种于相应的液体培养液中，在30℃、125r/min条件下进行恒温振荡，并在好氧条件下培养1~2天，获得四种液体菌剂种子液；
（3）将上述种子液扩大培养后，将扩大培养的具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌、具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌、具有硝化特性的芽胞杆菌和具有耐盐特性的盐单胞菌按照体积比1:1:（10~20）:（60~85）体积比混合，即为得到耐盐脱氮复合菌剂；
或者将步骤（2）中得到的四种液体菌剂种子液按照体积比1:1:（10~20）:（60~85）混合，再进行扩大培养。
3.根据权利要求2所述的一种耐盐脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于所述的具有耐盐特性的盐单胞菌的液体培养液配方为：牛肉膏：10g/L，蛋白胨：10g/L，NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：11.53g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；步骤（1）中所述的活化用固体培养基是在上述成分中加入占总重量加2%的琼脂粉。
4.根据权利要求2所述的一种耐盐脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于所述的具有硝化特性的芽胞杆菌的液体培养液配方为：NaNO2：1g/L，MnSO4.H2O：0.01g/L，K2HPO4：0.75g/L，Na2CO3：1g/L，KH2PO4：0.75g/L，维生素液：2mL/L，微量元素液：2mL/L，NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；步骤（1）中所述的活化用固体培养基是在上述成分中加入占总重量加2%的琼脂粉。
5.根据权利要求2所述的一种耐盐脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于所述的具有反硝化特性且脱氮过程中有亚硝氮积累的盐单胞菌和具有反硝化特性且脱氮过程中无亚硝氮积累的盐单胞菌的液体培养液配方为：CH3COONa：5g/L，K2HPO4：1g/L，FeSO4.7H2O：0.05g/L，NaNO2：0.8g/L，NaNO3：1g/L，维生素液：2mL/L，微量元素液：2mL/L，NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；其中微生素液的成分是 (g/L)：钴铵素 0.01；抗坏血酸 0.025；核黄素 0.025；柠檬酸 0.02；毗多醛 0.05；叶酸 0.01；对氨基苯甲酸 0.01；肌酸 0.025；微量元素液的成分是（g/L）：Na2EDTA  63.70；ZnSO4  2.20;CaCl2  5.50；MnCl2.4H2O  5.06；FeSO4.7H2O 5.00；Na2Mo4.4H2O 1.10;CuSO4.5H2O 1.57；CoCl2.6H2O 1.61；步骤（1）中所述的活化用固体培养基是在上述成分中加入占总重量加2%的琼脂粉。
6.根据权利要求2所述的一种耐盐脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于所述的扩大培养的扩大培养液的成分为：NaCl：26.726g/L，MgSO4：3.248g/L，MgCl2：2.26g/L，CaCl2：1.153g/L，NaHCO3：0.198g/L，KCl：0.721g/L；控制其氨氮浓度为100 ~120mg/L，碳氮质量比（15~20）:1培养条件：温度为25~30℃，pH为7~7.5，溶解氧为0.25 ~0.3mg/L，培养过程中pH不需要调节。
7.使用如权利要求1所述的耐盐脱氮复合菌剂进行废水处理，其特征在于按照以下步骤进行：
将耐盐脱氮复合菌剂按体积比5~8%接种到普通活性污泥中，通入待处理的高盐废水，控制废水温度为25~30℃、pH为7~7.5，在周期为10~14h的缺氧-好氧交替条件下进行处理 3~5天，脱氮率至少为95%，出水水质达标排放。
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