CN103571859B - 芍药4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(PLIspE)基因及其编码产物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(PLIspE)基因及其编码蛋白与用途，该基因为首次利用构建cDNA文库从芍药中克隆而得，填补了从我国传统中药材芍药中分离克隆出4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶基因的空白。本发明所提供的4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(PLIspE)基因具有SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(PLIspE)基因可以通过生物技术提高芍药中4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖代谢产物的含量，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及利用芍药cDNA文库克隆4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的有机酸、萜类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。
背景技术
药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。药用植物的化学成分复杂，种类繁多，其中主要含有有机酸类、黄酮类、挥发油、萜类、二萜类、微量元素等多种成分，芍药Paeonialactiflora不仅是名花，还是一味常用中药，其根可供药用。其中白芍具有镇痉、镇痛、通经等作用。芍药根中含有芍药苷、安息香酸等活性成分，其中芍药苷属于单萜类化合物，具有显著的镇痛、镇静、抗惊厥、，解痉、解热、抗炎、抗溃疡、抗过敏、降血糖、调节免疫、保护肝脏等作用(杨俊，方红编。芍药[M]。北京：中国中医药出版社，2001，113)。
4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritolkinase，IspE)是位于质体中的萜类化合物生物合成途径脱氧木酮糖-5-磷酸途径(DXP)中的关键酶，其表达量可能与芍药苷等萜类成分的含量密切相关。IspE能催化4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇(4-(Cytidine5′-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol，CDP-ME)生成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-赤藓糖醇-2-磷酸(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol-2-phosphate，CDP-ME2P)，再经过2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(MCS)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、异戊烯基单磷酸激酶(IPK)的作用生成异戊烯基焦磷酸(IPP)或二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，再进一步合成各种不同的萜类化合物张长波，孙红霞，巩中军，祝增荣。植物萜类化合物的天然合成途径及其相关合酶[J]。植物生理学通讯，2007，43(4)：779-786)。芍药4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(PLIspE)基因的克隆，为利用基因工程提高芍药活性成分含量提供重要物质基础，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的芍药中4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶基因及其氨基酸序列。
发明内容
本发明的目的在于提供一种芍药4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(PLIspE)基因。
本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。
本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。
本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。
本发明所提供的芍药4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(PLIspE)基因，为以下核苷酸序列之一：
(1)具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
该基因所编码的蛋白质为芍药4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(PLIspE)基因，是以下氨基酸序列之一：
(1)具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；
(2)SEQIDNO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
本发明所提供的4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(PLIspE)基因是首次从芍药中克隆制备的，体外实验表明，IspE能催化4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇(CDP-ME)生成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-赤藓糖醇-2-磷酸(CDP-ME2P)的活性。利用本发明可以通过基因工程技术来提高芍药等植物中萜类物质含量。
附图说明：
图1：PLIspE功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；
图2：PLIspE系统进化树(邻接法)；
图3：表达载体pQE30-PLIspE构建；
具体实施方式
实施例1、芍药cDNA文库的构建
1、芍药总RNA的分离和检测
取芍药(Paeonialactiflora)的根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L-1，EDTA25mmol·L-1，NaCl2.0mol·L-1，PVP402％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10MLiCl，混匀后放置4℃沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μLSSTE(SDS0.5％，NaCl1mol·L-1，Tris-HCl(pH8.0)10mmol·L-1，EDTA1mmol·L-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2小时；4℃13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于100μLDEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。
2、cDNA文库的构建
采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTMMicromRNAPurifiCationKit，Pharmacia公司)分离mRNA后，采用Clontech公司的CreatorSmartcDNALibraryConstructionKit(Cat.No.634903)进行建库，原理为SMART(switchmechanismat5′endofmRNAtemplate)。
实施例2：芍药相关基因的克隆
随机挑取5000个单克隆进行菌落PCR鉴定。取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。依次加入：Taqbuffer2.5μL，MgCl2(25mM)1.8μL，dNTP(2.5mM)1μL，M13+引物(10pmol)1μL，M13-引物(10pmol)1μL，Taq酶0.4μL。PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，94℃40秒，54℃40秒，72℃4分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。选择条带单一扩增产物送至华大基因公司进行测序，获得芍药相关基因序列。
实施例3、PLIspE基因的生物信息学分析
本发明涉及的芍药4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶基因全长cDNA的长度为1212bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于1-1212bp。将芍药全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的IspE有较高的同源性，同时具有典型的4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol2-phosphatesynthase(IspE)结构域。如图1。
实施例4、PLIspE基因功能的研究
1.原核表达载体的构建
以PLIspEcDNA为模板，利用引物P1：5′-ATGGCTTCCTCTCATTTCC-3′，P2：5′-TTACTCAAATGACTGAGAAAGATCA-3′进行PCR反应，反应体系同实验例2。取5ul扩增产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为1212bp。利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化切胶回收目的片段产物。将回收产物和pQE30连接转化后，对PCR检测合格的克隆提质粒，该质粒命名为pQE30-PLIspE(图3)。
2.工程菌的诱导表达
将质粒pQE30-PLIspE转入M15[pREP4]表达菌株中，加入含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2×TY培养基37℃培养。当菌液OD600到0.3-0.4时，加入0.4mMIPTG30℃诱导表达3h。3000g离心10min后，加入pH8.540mMTtis-HCL缓冲液(5mM2-巯基乙醇，60g/ml苯甲基磺酰氟，1mg/ml溶菌酶和1片/10ml的complete-miniEDTA-free)。30℃培养20分钟后超声破碎(5×30s破碎，1min冷却)然后4℃，10000g离心30分钟回收上清液并补充硫酸鱼精蛋白(1.25mg/ml)，室温孵育15分钟，然后4℃13000g离心20min。利用Hi-trapChelatingcolumns(Amersham)柱纯化蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为44.5kD处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致。
3.IspE活性测定
IspE可以催化CDP-ME和1分子ATP生成CDP-MEP和ADP，磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)在丙酮酸激酶(pyruvatekinase，PK)作用下生成丙酮酸，同时把1分子ADP转换成ATP，而丙酮酸和NADH在乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LDH)作用下生成L-乳酸。利用乳酸的量来间接测量IspE酶比活力。活性测定按以下条件进行：1mL反应体系为100mMTris-HCl(pH7.5)，1mMDTT，2.5mMMgCl2，0.75mMPEP，0.42mMNADH，32ULDH，23UPK，1.5mMATP，0.2mMCDP-ME和重组酶蛋白。空白对照用蒸馏水替换CDP-ME，其他组分一样。反应体系先30摄氏度孵育5min，然后加入ATP开始反应。在波长340nm处记录吸光度并绘制随时间变化图，根据条件选取40-120s之间线性区域的斜率计算IspE酶活。利用公式酶比活力＝酶的活力单位/粗酶蛋白质含量来计算PLIspE酶的比活力，最终PLIspE酶的比活力为500U/g。
4.突变IspE活性测定
以PLIspEcDNA为模板，利用突变引物P3：5′-ATGGCTTCATCTCATTTCC-3′，P4：5′-TTACTCAAATGACTGAGAAAGATCA-3′进行PCR反应，原核表达载体的构建、工程菌的诱导表达、粗酶IspE活性测定方法同上，结果表明突变PLIspE转基因工程菌株经诱导后活力与正常PLIspE没有显著差异。
Claims (3)
1.一种芍药4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶基因，其特征在于，该基因核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.一种芍药4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
3.重组载体，其特征在于：含有权利要求1所述芍药4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶基因全序列。
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| XP_002267319.2;无;《GenBank》;20111207 * |
| 结核分枝杆菌类异戊二烯合成途径中IspD和IspE酶学功能研究;施文钧;《复旦大学博士学位论文》;20080715;全文 * |
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