CN103562718A

CN103562718A - 植物疾病检测

Info

Publication number: CN103562718A
Application number: CN201280025051.9A
Authority: CN
Inventors: C·E·戴维斯; O·菲恩; A·M·丹德卡尔; A·阿克肖诺夫; 赵伟祥; W·张; F·马迪内里; K·J·斯科格尔森
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2011-03-21
Filing date: 2012-03-21
Publication date: 2014-02-05
Also published as: US20140127672A1; WO2012129341A3; WO2012129341A2; BR112013024423A2

Abstract

本公开涉及植物疾病的检测。具体而言，本公开提供了植物疾病检测的方法、组合物和装置。

Description

植物疾病检测

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年3月21日提交的美国临时申请No.61/465,649的优先权，该文献以引用方式全文并入本文。

技术领域

本公开总体而言涉及植物疾病检测，更具体而言，本公开涉及早期检测柑橘属植物的感染性疾病的方法和系统。

ASCII文本文件形式的序列表的提交

以下提交的ASCII文本文件形式的内容以引用方式全部并入本文：序列表1-15的计算机可读形式（CRF）（文件名：Table1.txt，包含134KB；Table2.txt，包含93KB；Table3.txt，包含94KB；Table4.txt，包含25KB；Table5.txt，包含48KB；Table6.txt，包含65KB；Table7.txt，包含21KB；Table8.txt，包含55KB；Table9.txt，包含140KB；Table10.txt，包含119KB；Table11.txt，包含85KB；Table12.txt，包含113KB；Table13.txt，包含94KB；Table14.txt，包含104KB；以及Table15.txt，包含6KB）。这些文件在2011年3月21日建立。

背景技术

植物病原体通过在全世界内破坏农作物而在许多国家对农业生产提出了重大的挑战。

具有主要的经济影响的疾病的实例为“柑橘黄龙”病或黄龙病（HLB），其在东南亚、巴西和USA破坏柑橘农作物。HLB为一种媒传疾病，其是由亚洲韧皮杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus(CaLas)）细菌引起的，并通过食用韧皮部的昆虫柑桔木虱（Asian citrus psyllid）散播。尽管对人健康无害，但是由于HLB对生产、树衰退、果实大小和形状的影响，所以其破坏了柑橘植物。甜橙、柑橘和蜜柑是高度易受影响的，然后为酸橙、葡萄柚以及其他市售的重要的柑橘种类。据报道，仅有几种柠檬栽培品种和几种其他的物种（例如Citrus indica和Citrus macroptera）显示出对细菌具有一些耐受性或可能的抗性。

基于核糖体区域序列的数据，韧皮杆菌（Candidatus Liberibacter）为变形菌的α亚类(Jagoueix et al.,1994)。通过亚洲韧皮杆菌柑桔木虱（Diaphorina citri）传播的CaLas在受感染柑橘的韧皮部生存，并且一旦获得，便在昆虫媒介的一生内传播。杀虫剂可以减少木虱群体，但是由于细菌持续在媒介中，所以单独的一些木虱能够散播疾病。

由于柑橘植物在长期内保持无疾病症状，所以重要的是在症状出现之前识别感染。如果在早期检测到，则可以通过在商业化的果园里选择性地除去树来终止或减少疾病由感染的树的传播。受感染的树可以用于提升的营养治疗，从而减少症状以及降低发展。

到目前为止，具有较少的确定的方法来检测具有韧皮杆菌细菌的柑橘感染（如果其无症状）。聚合酶链式反应（PCR）测试为用于诊断HLB的一种潜在的方法。但是，PCR是昂贵且耗时的方法，由于植物中细菌的加载是不均匀的分布的并且可以随着时间波动，所以其进一步受到挑战。

由于CaLas生存在韧皮部，这种途径可能是造成部分树被感染后细菌快速散播的原因。就该原因而言，假定CaLas存在于受感染的树的无症状叶上，但是浓度接近或低于PCR检测的极限(4.6x10²l/g)。

产生主要的经济影响的另一种植物病原体为柑橘衰退病毒（Citrustristeza virus(CTV)）。CTV为植物基病毒，其属于多形多核病毒属，长线形病毒科，并且适于在其宿主的韧皮部组织中复制。CTV具有长度大约2000nm、直径为10-12nm的丝状结构。估计其RNA基因组的大小为大约20Kb，并且其首先由Karsaev et al在1995年测序(Kersev1995)。CTV被认为具有任何已知植物病毒的最大基因组之一。CTV主要感染芸香科植物，其包含经济重要的果实农作物，例如甜橙、克莱门氏小柑橘、酸橙和葡萄柚栽培品种。这些栽培品种通过将新的根茎嫁接到现存的幼枝上来繁殖。因此，任何受感染的接穗和根茎都起到人工媒介的作用，从而将病毒引入新的区域，然后通过蚜虫、粉虱和水蜡虫在局部水平上散播。最近70年中，估计超过8亿棵树（主要为克莱门氏小柑橘和甜橙种类）由于全世界内CTV的感染而被毁坏。到目前为止，CTV表现成为柑橘工业的现实且明显的经济负担。

根据所感染的宿主物种以及接穗-根茎的组合，CTV感染的农作物发展成3种明显的症状：（1）苗黄型（SY）表征为褪绿叶、受感染的宿主的根系统减少以及产生低质量的果实；（2）推断在接穗/根茎之间的坏疽诱导出立衰病（QD），从而最初导致叶凋谢以及树叶减少，然后在出现最初症状之后的几周诶整个柑橘树最终死亡；（3）茎纹病（SP）较少关于宿主植物的致命，但是会显著降低活力，其由此会大大地影响农作物的产率；即使在耐受疾病的根茎，这些症状也是明显的。

控制柑橘农作物的CTV感染的量度包括检疫期、建立接穗证明程序、除去及消除受感染的树、以及引入耐受的根茎。这取决于受感染的面积/区域的严重性和大小。

到目前为止，在生物及分子水平广泛地对CTV进行表征(Bruessow2010)。用于检测柑橘果实农作物的CTV感染的方法包括测试某些酸橙栽培品种的病毒索引、电子显微镜(EM)(Bar-Joseph1979)、实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、以及光谱分析(FT-IR)。

本发明提供了用于检测植物疾病的改善的方法和组合物。

发明概述

本公开涉及通过分析植物挥发性化合物VOC来检测诸如黄龙病（HLB）之类的植物疾病以及植物中的柑橘衰退病毒（CTV）。此外，本公开还涉及通过分析植物基因表达来检测诸如黄龙病（HLB）之类的植物疾病以及植物中的柑橘衰退病毒（CTV）。

在一个实施方案中，本发明提供了诊断柑橘植物中的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病。

在一个实施方案中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：沉香醇,十三烷(C₁₃H₂₈),戊酮(4-OH-4-Me-2-),二十六烷,十四烯(1-),二十三烷,香叶醛,十四烷,苯乙醛,水杨酸甲酯,cumacrene,石竹烯,十六醇,罗勒烯(e-β-),香叶草基丙酮,二氧化碳,丙烷,2-甲基-戊烷,o-二甲苯,2-乙基-1,4-二甲基-苯,1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯,2,2,3,4-四甲基-戊烷,十五烷(C₁₅H₃₂),己烯乙酸酯,十三醛,vocBB45061,vocBB45212,46541,83748,62469,45491,51824,48023,48272,46850,45071,48807,47176,57101,50888,45074和90562；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：沉香醇,十三烷(C₁₃H₂₈),戊酮(4-OH-4-Me-2-),二十六烷,十四烯(1-),二十三烷,香叶醛,十四烷,苯乙醛,水杨酸甲酯,cumacrene,石竹烯,十六醇,罗勒烯(e-β-),香叶草基丙酮,二氧化碳,丙烷,2-甲基-戊烷,o-二甲苯,2-乙基-1,4-二甲基-苯,1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯,2,2,3,4-四甲基-戊烷,十五烷(C₁₅H₃₂),己烯乙酸酯,十三醛,vocBB45061,vocBB45212,46541,83748,62469,45491,51824,48023,48272,46850,45071,48807,47176,57101,50888,45074和90562；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中通过测量由感染黄龙病的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量来确定预定值。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：沉香醇,十三烷(C₁₃H₂₈),戊酮(4-OH-4-Me-2-),二十六烷,十四烯(1-),二十三烷,香叶醛,十四烷,苯乙醛,水杨酸甲酯,cumacrene,石竹烯,十六醇,罗勒烯(e-β-),香叶草基丙酮,二氧化碳,丙烷,2-甲基-戊烷,o-二甲苯,2-乙基-1,4-二甲基-苯,1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯,2,2,3,4-四甲基-戊烷,十五烷(C₁₅H₃₂),己烯乙酸酯,十三醛,vocBB45061,vocBB45212,46541,83748,62469,45491,51824,48023,48272,46850,45071,48807,47176,57101,50888,45074和90562；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中通过测量由未感染黄龙病的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量来确定预定值。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：沉香醇,十三烷(C₁₃H₂₈),戊酮(4-OH-4-Me-2-),二十六烷,十四烯(1-),二十三烷,香叶醛,十四烷,苯乙醛,水杨酸甲酯,cumacrene,石竹烯,十六醇,罗勒烯(e-β-),香叶草基丙酮,二氧化碳,丙烷,2-甲基-戊烷,o-二甲苯,2-乙基-1,4-二甲基-苯,1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯,2,2,3,4-四甲基-戊烷,十五烷(C₁₅H₃₂),己烯乙酸酯,十三醛,vocBB45061,vocBB45212,46541,83748,62469,45491,51824,48023,48272,46850,45071,48807,47176,57101,50888,45074和90562；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中通过测量由感染黄龙病的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量来确定预定值，其中所述的参照柑橘植物与所述的柑橘植物处于相同的发育阶段。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：沉香醇,十三烷(C₁₃H₂₈),戊酮(4-OH-4-Me-2-),二十六烷,十四烯(1-),二十三烷,香叶醛,十四烷,苯乙醛,水杨酸甲酯,cumacrene,石竹烯,十六醇,罗勒烯(e-β-),香叶草基丙酮,二氧化碳,丙烷,2-甲基-戊烷,o-二甲苯,2-乙基-1,4-二甲基-苯,1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯,2,2,3,4-四甲基-戊烷,十五烷(C₁₅H₃₂),己烯乙酸酯,十三醛,vocBB45061,vocBB45212,46541,83748,62469,45491,51824,48023,48272,46850,45071,48807,47176,57101,50888,45074和90562；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中通过测量由未感染黄龙病的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量来确定预定值，其中所述的参照柑橘植物与所述的柑橘植物处于相同的发育阶段。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：沉香醇,十三烷(C₁₃H₂₈),戊酮(4-OH-4-Me-2-),二十六烷,十四烯(1-),二十三烷,香叶醛,十四烷,苯乙醛,水杨酸甲酯,cumacrene,石竹烯,十六醇,罗勒烯(e-β-),香叶草基丙酮,二氧化碳,丙烷,2-甲基-戊烷,o-二甲苯,2-乙基-1,4-二甲基-苯,1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯,2,2,3,4-四甲基-戊烷,十五烷(C₁₅H₃₂),己烯乙酸酯,十三醛,vocBB45061,vocBB45212,46541,83748,62469,45491,51824,48023,48272,46850,45071,48807,47176,57101,50888,45074和90562；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中使用质谱来测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：沉香醇,十三烷(C₁₃H₂₈),戊酮(4-OH-4-Me-2-),二十六烷,十四烯(1-),二十三烷,香叶醛,十四烷,苯乙醛,水杨酸甲酯,cumacrene,石竹烯,十六醇,罗勒烯(e-β-),香叶草基丙酮,二氧化碳,丙烷,2-甲基-戊烷,o-二甲苯,2-乙基-1,4-二甲基-苯,1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯,2,2,3,4-四甲基-戊烷,十五烷(C₁₅H₃₂),己烯乙酸酯,十三醛,vocBB45061,vocBB45212,46541,83748,62469,45491,51824,48023,48272,46850,45071,48807,47176,57101,50888,45074和90562；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中使用差示迁移光谱仪来测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：沉香醇,十三烷(C₁₃H₂₈),戊酮(4-OH-4-Me-2-),二十六烷,十四烯(1-),二十三烷,香叶醛,十四烷,苯乙醛,水杨酸甲酯,cumacrene,石竹烯,十六醇,罗勒烯(e-β-),香叶草基丙酮,二氧化碳,丙烷,2-甲基-戊烷,o-二甲苯,2-乙基-1,4-二甲基-苯,1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯,2,2,3,4-四甲基-戊烷,十五烷(C₁₅H₃₂),己烯乙酸酯,十三醛,vocBB45061,vocBB45212,46541,83748,62469,45491,51824,48023,48272,46850,45071,48807,47176,57101,50888,45074和90562；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中所述的柑橘植物为巴伦西亚橘植物。

在一个实施方案中，本发明提供了诊断柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的CTV疾病。

在一个实施方案中，本发明提供了诊断柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：月桂烯,蒈烯(δ-3-),罗勒烯(e-β-),十六醇,柠檬烃,二十四烷,布藜烯(α-)；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的CTV疾病。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：月桂烯,蒈烯(δ-3-),罗勒烯(e-β-),十六醇,柠檬烃,二十四烷,布藜烯(α-)；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的CTV疾病，其中通过测量由感染CTV的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量来确定预定值。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：月桂烯,蒈烯(δ-3-),罗勒烯(e-β-),十六醇,柠檬烃,二十四烷,布藜烯(α-)；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的CTV疾病，其中通过测量由未感染CTV的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量来确定预定值。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：月桂烯,蒈烯(δ-3-),罗勒烯(e-β-),十六醇,柠檬烃,二十四烷,布藜烯(α-)；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的CTV疾病，其中通过测量由感染CTV的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量来确定预定值，并且其中所述的参照柑橘植物与所述的柑橘植物处于相同的发育阶段。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：月桂烯,蒈烯(δ-3-),罗勒烯(e-β-),十六醇,柠檬烃,二十四烷,布藜烯(α-)；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的CTV疾病，其中通过测量由未感染CTV的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量来确定预定值，并且其中所述的参照柑橘植物与所述的柑橘植物处于相同的发育阶段。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；b）测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量，其中所述的化合物选自：月桂烯,蒈烯(δ-3-),罗勒烯(e-β-),十六醇,柠檬烃,二十四烷,布藜烯(α-)；以及c）将一种或多种挥发性化学化合物的测定量与一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的CTV疾病，其中使用质谱仪和/或差示迁移光谱仪来测量样品中一种或多种挥发性化学化合物的数量。

在一个实施方案中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物产生的核酸分子样品；b）测量样品中一种或多种核酸分子的数量；以及c）将一种或多种核酸分子的测定量与一种或多种核酸分子的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病。

在一个实施方案中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物产生的核酸分子样品；b）测量样品中一种或多种核酸分子的数量，其中所述的核酸分子选自：GH3.1(S22545043)，GH3.4(S44237769)，KA02(S44303609)，水杨酸甲基转移酶(S44277040)，WRKY70(S44288591)，MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824)，HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶环化酶(S22583829)，NN脂质转移蛋白质(LTP)(S44279331)，酸性纤维素酶8(S22606212)，ω-6-FAD(S44244604)酸性纤维素酶(S22606212)，萜烯合成酶1(S44285742)，ERTF2(S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯还原酶(S34125138)，脂氧化酶2(S34124539)，NNLTP(NCBI编号:EY754661.1)，β-淀粉酶(S44303510)，棒曲霉素3(S22533016)，葡萄糖-磷酸-运送蛋白2(S22591828,S22591828,S44257732,S22591828)，ENT-异贝壳杉烯酸羟化酶2(S44251582)，棒曲霉素3(S22533016)，α-淀粉酶(S44224848)，WRKY70(S44225142,S44227900,S44288591)；以及c）将一种或多种核酸分子的测定量与一种或多种核酸分子的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物产生的核酸分子样品；b）测量样品中一种或多种核酸分子的数量，其中所述的核酸分子选自：GH3.1(S22545043)，GH3.4(S44237769)，KA02(S44303609)，水杨酸甲基转移酶(S44277040)，WRKY70(S44288591)，MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824)，HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶环化酶(S22583829)，NN脂质转移蛋白质(LTP)(S44279331)，酸性纤维素酶8(S22606212)，ω-6-FAD(S44244604)酸性纤维素酶(S22606212)，萜烯合成酶1(S44285742)，ERTF2(S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯还原酶(S34125138)，脂氧化酶2(S34124539)，NNLTP(NCBI编号:EY754661.1)，β-淀粉酶(S44303510)，棒曲霉素3(S22533016)，葡萄糖-磷酸-运送蛋白2(S22591828,S22591828,S44257732,S22591828)，ENT-异贝壳杉烯酸羟化酶2(S44251582)，棒曲霉素3(S22533016)，α-淀粉酶(S44224848)，WRKY70(S44225142,S44227900,S44288591)；以及c）将一种或多种核酸分子的测定量与一种或多种核酸分子的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中所述的核酸分子为mRNA分子。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物产生的核酸分子样品；b）测量样品中一种或多种核酸分子的数量，其中所述的核酸分子选自：GH3.1(S22545043)，GH3.4(S44237769)，KA02(S44303609)，水杨酸甲基转移酶(S44277040)，WRKY70(S44288591)，MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824)，HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶环化酶(S22583829)，NN脂质转移蛋白质(LTP)(S44279331)，酸性纤维素酶8(S22606212)，ω-6-FAD(S44244604)酸性纤维素酶(S22606212)，萜烯合成酶1(S44285742)，ERTF2(S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯还原酶(S34125138)，脂氧化酶2(S34124539)，NNLTP(NCBI编号:EY754661.1)，β-淀粉酶(S44303510)，棒曲霉素3(S22533016)，葡萄糖-磷酸-运送蛋白2(S22591828,S22591828,S44257732,S22591828)，ENT-异贝壳杉烯酸羟化酶2(S44251582)，棒曲霉素3(S22533016)，α-淀粉酶(S44224848)，WRKY70(S44225142,S44227900,S44288591)；以及c）将一种或多种核酸分子的测定量与一种或多种核酸分子的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中通过测量由感染黄龙病的参照柑橘植物所产生的一种或多种核酸分子的数量来确定预定值。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物产生的核酸分子样品；b）测量样品中一种或多种核酸分子的数量，其中所述的核酸分子选自：GH3.1(S22545043)，GH3.4(S44237769)，KA02(S44303609)，水杨酸甲基转移酶(S44277040)，WRKY70(S44288591)，MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824)，HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶环化酶(S22583829)，NN脂质转移蛋白质(LTP)(S44279331)，酸性纤维素酶8(S22606212)，ω-6-FAD(S44244604)酸性纤维素酶(S22606212)，萜烯合成酶1(S44285742)，ERTF2(S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯还原酶(S34125138)，脂氧化酶2(S34124539)，NNLTP(NCBI编号:EY754661.1)，β-淀粉酶(S44303510)，棒曲霉素3(S22533016)，葡萄糖-磷酸-运送蛋白2(S22591828,S22591828,S44257732,S22591828)，ENT-异贝壳杉烯酸羟化酶2(S44251582)，棒曲霉素3(S22533016)，α-淀粉酶(S44224848)，WRKY70(S44225142,S44227900,S44288591)；以及c）将一种或多种核酸分子的测定量与一种或多种核酸分子的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中通过测量由未感染黄龙病的参照柑橘植物所产生的一种或多种核酸分子的数量来确定预定值。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物产生的核酸分子样品；b）测量样品中一种或多种核酸分子的数量，其中所述的核酸分子选自：GH3.1(S22545043)，GH3.4(S44237769)，KA02(S44303609)，水杨酸甲基转移酶(S44277040)，WRKY70(S44288591)，MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824)，HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶环化酶(S22583829)，NN脂质转移蛋白质(LTP)(S44279331)，酸性纤维素酶8(S22606212)，ω-6-FAD(S44244604)酸性纤维素酶(S22606212)，萜烯合成酶1(S44285742)，ERTF2(S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯还原酶(S34125138)，脂氧化酶2(S34124539)，NNLTP(NCBI编号:EY754661.1)，β-淀粉酶(S44303510)，棒曲霉素3(S22533016)，葡萄糖-磷酸-运送蛋白2(S22591828,S22591828,S44257732,S22591828)，ENT-异贝壳杉烯酸羟化酶2(S44251582)，棒曲霉素3(S22533016)，α-淀粉酶(S44224848)，WRKY70(S44225142,S44227900,S44288591)；以及c）将一种或多种核酸分子的测定量与一种或多种核酸分子的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中通过测量由感染黄龙病的参照柑橘植物所产生的一种或多种核酸分子的数量来确定预定值，其中所述的参照柑橘植物与所述的柑橘植物处于相同的发育阶段。

在一个方面中，本发明提供了诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：a）获得由柑橘植物产生的核酸分子样品；b）测量样品中一种或多种核酸分子的数量，其中所述的核酸分子选自：GH3.1(S22545043)，GH3.4(S44237769)，KA02(S44303609)，水杨酸甲基转移酶(S44277040)，WRKY70(S44288591)，MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824)，HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶环化酶(S22583829)，NN脂质转移蛋白质(LTP)(S44279331)，酸性纤维素酶8(S22606212)，ω-6-FAD(S44244604)酸性纤维素酶(S22606212)，萜烯合成酶1(S44285742)，ERTF2(S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯还原酶(S34125138)，脂氧化酶2(S34124539)，NNLTP(NCBI编号:EY754661.1)，β-淀粉酶(S44303510)，棒曲霉素3(S22533016)，葡萄糖-磷酸-运送蛋白2(S22591828,S22591828,S44257732,S22591828)，ENT-异贝壳杉烯酸羟化酶2(S44251582)，棒曲霉素3(S22533016)，α-淀粉酶(S44224848)，WRKY70(S44225142,S44227900,S44288591)；以及c）将一种或多种核酸分子的测定量与一种或多种核酸分子的预定值比较，从而诊断柑橘植物中的黄龙病，其中通过测量由未感染黄龙病的参照柑橘植物所产生的一种或多种核酸分子的数量来确定预定值，其中所述的参照柑橘植物与所述的柑橘植物处于相同的发育阶段。

附图简述

图1-针对GC停留时间和补偿电压（CV）绘制的GC/DMS图，其示出了由HLB-感染的Hamlin橘树得到的VOC的相对离子计数。

图2-用于由GC/DMS数据提取信息的小波变换。原始的光谱数据可以分解为低频部分和高频部分。

图3-健康（下方线）与HLB感染症状（上方线）Hamlin橘树的GC概况片段。

图4-通过使用与Adams文库相匹配的停留指数和质谱来识别挥发性BinBase数据库(“vocBB”)中的挥发性代谢物。面板（A）示出了Adams指数与Fiehn指数的相关性；面板（B）示出了数据库中与水杨酸甲酯相应的MS光谱。

图5-用于占据挥发性BinBase数据库的4种柑橘精油的聚类图。数据库中，所有的精油均创建了新的入口。通过vocBB数据处理，所有的样品均被正确的集中。

图6-HLB感染的植物中的挥发性能,Ft.Pierce,FL。左侧面板：在感染后6周，套入袋中的叶，其吸收Twister挥发物。右侧面板：通过PCR和症状描述监测疾病的进程。

图7-对于健康和HLB感染的植物而言，在植物发育过程中暂时排放柑橘挥发物。

图8-在健康和HLB感染的柑橘植物之间，显著差异(p<0.05)的代谢物的数量。正方形标记的线：所有的化合物；菱形标记的线：具有所识别的结构的化合物。

图9-在健康和HLB感染的柑橘植物之间，显著差异(p<0.05)的代谢物（由星形显示）的实例。上方：所识别的挥发物；下方：结构上未识别的挥发物。

图10-与香味和芳香化合物有关的途径的HLB调节。

图11-与使用qRT-PCR进行的茉莉酮酸枝生物合成以及确认有关的特定基因的HLB调节。CO=健康；AH=表观健康；AS=无症状；以及SY=有症状的植物。

图12-在成熟果实中萜类化合物途径的确认：在该途径中对两种基因进行qRT-PCR分析。CO=健康；AH=表观健康；AS=无症状；以及SY=有症状的植物。

图13-在幼叶和成熟叶子中萜类化合物途径的确认：在该途径中对两种基因进行qRT-PCR分析。CO=健康；AH=表观健康；AS=无症状；以及SY=有症状的植物。

图14-对于HLB疾病的早期检测而言，单萜化合物作为潜在生物标志物的识别。

图15-对于叶和果实中的HLB疾病而言，水杨酸甲基转移酶（一种早期的生物标志物）的上调节的qRT-PCR证实。

图16-在果实中通过HLB调节的基因/途径的网络。

图17-部分（A）为与泛素依赖的降解过程有关的HLB调节的基因；部分（B）为果实中HSP82的qRT-PCR分析；部分（C）为由拟南芥知识库，在柑橘中推断的蛋白质-蛋白质相互作用的网络。

图18-健康植物与仅感染CTV的植物的主要成分分析（“PCA”）得分图：可以观察到健康和感染CTV植物之间的分离，并且除了一些可能的异常值以外，这两类可以大体上分离。

图19-所有三类的PCA得分图：健康、CTV和CTV+Stubborn。在健康和所有CTV相关的样品之间仍可以观察到清楚的分离，但是在CTV和CTV+Stubborn之间存在明显的重叠。

图20-与CTV具有较强关系的化学品的3种实例：月桂烯、蒈烯(δ-3-)、和罗勒烯(e-β-)。这些化学品为在“健康与仅感染CTV”（图18）和“健康与CTV相关”（图19）存在的18种化学品中的3种。

图21-基于SPME GC/MS HLB生物标志物的HLB检测(Florida)。在HLB疾病和健康样本之间可以观察到基于9种可分辨的生物标志物的分离。

图22-使用两种平行的化学分析系统（气相色谱质谱仪(GC/ITMS)和差示迁移光谱仪(GC/DMS)）监测的得自所选的植物叶子的VOC。将由光谱输出得到的停留时间配对并编入指数，并且在两种数据组中相当的光谱特征可以设置用于识别柑橘健康和疾病的假定的生物标志物。

图23-两种相关的品种华盛顿脐橙和巴伦西亚橘的GC/ITMS(TIC)光谱，补偿至相同规模。

图24-由各品种（华盛顿脐橙和巴伦西亚橘）得到的3种质谱相对彼此显示的在2种样品中存在的突出峰的展开图。上方3个光谱得自华盛顿脐橙，下方3个光谱得自巴伦西亚橘。

图25-VOC标志物的对数归一化浓度的以及它们跨越2个品种（华盛顿脐橙和巴伦西亚橘）的分布概况的盒形图：峰13(RT68.464min)、峰18(RT75.037min)、峰24(RT121.567min)和峰34(RT141.903)。

图26-基于GC/ITMS数据的PCA得分图，其中使用了通过Student t检验被识别为明显的4种变量：示出了由各主要成分捕获的总可释方差。

图27-由巴伦西亚橘叶子的顶部空间的分析得到的总离子色谱和GC/DMS光谱。

图28-根据GC/DMS光谱，巴伦西亚橘和华盛顿脐橙的平均信号强度以及它们的差异（上方面板：阳离子光谱；下方面板：阴离子光谱）。

图29-基于GC/DMS数据和Student t检验的所选像素，基于（A）仅阳离子光谱、（B）仅阴离子光谱、以及（C）同时两种离子光谱的主要成分分布：（+：巴伦西亚橘；O：华盛顿脐橙）。通过主要成分1和2解释的方差为(A：49%和14.0%)、(B：40.0%和17.0%)以及(C：43.6%和16.0%)。

图30-就华盛顿脐橙品种而言，所有SPME-GC/ITMS光谱的点积值总和（TIC）。

图31-就巴伦西亚橘而言，所有SPME-GC/ITMS光谱的点积值总和。

图32-使用用于现场取样的手提箱大小的便携式GC/DMS传感器。左侧面板：便携式GC/DMS结构的简单显示；中间面板：使用便携式GC/DMS传感器的现场取样和分析；右侧面板：用于提供电力的太阳能面板。

图33-使用便携式GC/DMS的分离植物类别的基准研究。面板A：由植物叶子得到的VOC的GC/DMS；面板B：分离植物类别的主要成分的分析。

图34-跨越整个信号领域的Student t检验的P值(p<0.1)。

图35-就上方的3个主要成分而言，各个像素的加载系数。

图36-健康和HLB的平均光谱。

图37-健康和CTV之间的分离。

图38-基于整个停留时间范围（左侧面板）和最初的3分钟（右侧面板）的GC/DMS信号的小波系数，HLB和健康之间的分离。

图39-使用健康和CTV样品的GC/DMS信号的小波系数，健康和CTV样品的分离。

图40-显示由健康和疾病的巴伦西亚和Hamlin橘树得到的VOC的相对总离子计数的色谱。

实施方案的具体描述

呈现以下描述使本领域的普通技术人员能够进行和使用各实施方案。具体的装置、技术和应用的描述仅以实例的方式提供。对本文所述的实施例进行的修改对于本领域的普通技术人员而言很容易是显而易见的，并且在不脱离各实施方案的精神和范围的条件下，本文所定义的一般原理可以用于其它实施例和应用。因此，各实施方案无意于限定本文所述的实施例，并且显示但符合权利要求所述的范围。

本公开涉及植物疾病的诊断。

疾病

在一些实施方案中，本发明公开了用于检测植物的黄龙病（HLB）/柑橘黄龙病的方法和组合物。在一些方面中，本文公开了用于检测柑橘植物的HLB/柑橘黄龙的方法和组合物。

在一些实施方案中，本发明公开了用于检测植物的柑橘衰退病毒（CTV）的方法和组合物。在一些方面中，本文公开了用于检测柑橘植物的CTV的方法和组合物。

挥发性化合物

在一些实施方案中，本公开涉及挥发性化合物（VOC）。如本文所用，“挥发性化合物”涉及任何种类的“挥发性化合物”，包括“诱导的挥发性化合物”（IVOC）和“生物生成的挥发性有机化合物”（BVOC）。

植物向大气中排放大量的它们的固定碳作为VOC；这些VOC的生产是宿主植物的内部生理状态的应答。例如，当植物被昆虫或食草动物食用时，它们的直接防御应答是释放挥发性有机化合物(Farmer,2001)。在应激反应下所排放的挥发性化合物通常被称为“诱导的VOC”（IVOC），其由植物叶子、果实和根释放。这种应答不仅在生物攻击下被诱导，而且也可以被非生物应激诱导，从而暂时改变植物的VOC概况。IVOC在植物-植物交流(Baldwin et al.2006;Bezemer and van Dam2005;Rohloff and Bones2005)、食草动物防御(Glendinning et al.2009;Kessler and Baldwin2001;Runyon et al.2006)中起到重要作用，并且显示有助于生物应激的抗性(Kishimoto et al.2005;Park et al.2007)。因此，在植物系统中，所排放的VOC的组合物（其数目达几千种）包含潜在代谢过程的重要的生物化学信息(Dudareva et al.2004;Sumner et al.2003;Weckwerth2008)。可以使用分析方法收集和测量表达的VOC，从而提供植物健康状态的短时快照。因此，VOC的测量作为监测植物生理过程的非侵入性且快速的方式的吸引人的手段，包括：开花(Müller et al.2002)、成熟（ripening）(Herrmann et al.2002)、成熟（maturing）(Rapparini et al.2001)、应激(Karl et al.2008;Lee et al.2009;Loreto et al.2006)、以及疾病状态(Paolini et al.2008)。

捕获和分析VOC的方法

在一些实施方案中，本发明提供了用于捕获由植物得到的VOC的方法。如本文所提供，植物VOC取样可以由整株植物、果实和叶子原位实施，或者由分离的植物组织直接实施(Tholl et al.2006)。

在一些方面中，可以将所排放的VOC收集在定位于最接近整株植物的固体吸附剂上，或者使用真空系统收集在吸附剂上，从而在现场的条件下由植物取样大量的空气。在一个方面中，普通使用的技术使用了直接静态顶空取样方法，由此植物VOC被收集/吸附在表面官能化的所谓的固相微萃取（SPME）纤维上。然后，在热条件下所收集的挥发物会解吸附，并且挥发物被引入到用于化学分析的GC/MS系统中(Stewart-Jones andPoppy2006)；该取样方法适用于概括新鲜和干燥的植物样品(Zini et al.2002)。

在一些实施方案中，本发明提供了用于分析VOC的方法。由于植物所排放的大量的VOC，所以可以与由各植物系统收集全球VOC指纹平行使用多种分析技术(Goff and Klee2006)。

GC/MS

在一个方面中，使用气相色谱质谱（GC/MS）来分析植物VOC(Lytovchenko et al.2009)。气相色谱质谱为发展良好的分析分离和监测技术，其中络合的样品混合物色谱分离分级成更简单的成分，并且洗脱的成分以线性方式被引入到MS中用于检测和定量。此外，GC/MS理想地适用于分析低分子量的有机化合物，例如VOC，从而生成存在于样品中分子化合物的原子和结构信息。诸如分析热解吸附（TD）之类的样品引入技术与GC/MS（使用了Tenax-TA和PDMS膜）以连接方式连接，用于取样非侵入性分析生物样品所使用的VOC(Yun)。

在其他方面中，可以使用核磁共振（NMR）或液相色谱质谱（LC/MS）来分析植物VOC。

在一些方面中，使用便携式检测装置来检测所关注的生物标志物。如果选择装置是便携式的，则可以进行原位分析。便携式检测装置包括但不限于离子迁移光谱(IMS)、差示迁移光谱(DMS)/场不对称离子迁移光谱(FAIMS)、以及基于GC技术的单元。

DMS和GC/DMS

在一个方面中，使用差示迁移光谱(DMS)来分析植物VOC。DMS为气相分离和检测技术；其通过以下过程进行操作：在越过短的大分子距离上在快速交替的高低电场下利用带电离子的非线性行为来诱导分离和随后的检测(Krebs et al2005)。其在环境压力下具有ppb水平的敏感度下的操作能力(Eiceman et al2004)、其较低的电力消耗、以及其较小的尺寸和进一步小型化的潜力使得DMS成为特别良好地适用于气体样品的分析以及VOC的内场分析。在一些方面中，DMS与气象色谱（GC）偶联（以连接方式连接），以便取得其他的色谱分离。

DMS已经广泛地用于细菌样品的表征(Prasad et al.2007;Schmidt et al.2004)。此外，还用于病毒的研究(Ayer et al.2008)。DMS已经成功地用于分析由增殖细菌样品得到的VOC(Shnayderman et al.2005)、碳化的火灾残害残余物以及喷气燃料(Lu and Harrington2007;Rearden et al.2007)，以用于辨别应用。GC/DMS已经用于表征和区别由正常健康柑橘果实的皮部分排放的挥发性化合物、以及感染柑橘“膨胀”紊乱的那些(Zhao et al.2009)。

在一个实施方案中，本发明提供了使用GC和DMS检测来分析由生物样品得到的VOC的方法。在一些方面中，GC与DMS的组合增加了DMS的诊断能力。在GC/DMS试验中，各化学品可以通过其各自的补偿电压（CV）和停留时间来分离和表征，其中所述的补偿电压和停留时间指示了特定的化学品物质。GC/DMS图提供了由植物排放的挥发性化合物的快照，其可以用作化学品识别标志（图1）。

在一些实施方案中，本发明提供了实施GC/DMS分析的方法。在一个方面中，各个GC/DMS样品使用三维数据结构表征，其中所述的三维数据结构由停留时间、补偿电压和相应的信号强度构成。为了利用3-D数据结构中所有的信息，可以在无需总结跨越停留时间或补偿电压的信号的条件下保持原始数据。主要成分分析（PCA）可以用于3-D数据，从而初步显现由不同的组得到的样品的分布。基于PCA结果，可以设计下一步来研究所述的数据。

在一些方面中，使用小波变换将主要信息浓缩成低频区域，同时将大部分的噪声内容物移至高频区域（图2）。基于小波系数的选择策略，可以保持相关系数以用于进一步分析。在一些方面中，可以使用多变量分析方法（包括线性方法，例如主要成分分析(PCA)和偏最小二乘法(PLS)；以及非线性方法，例如支持向量机）以显现和定量检验各组之间的分离。针对由生物标志物文库得到的化合物校正VOC检测装置

在一些方面中，可以使用由生物标志物文库得到的化合物标准品来训练和校正VOC检测装置。经训练的装置能够针对络合物背景并以极低的浓度区别所关注的化合物（例如基于DMS/FAIMS的装置的检测极限可以低至几ppb）。

在一些方面中，如果使用吸附膜或其他预浓缩器和/或背景去除手段预浓缩所关注的化合物，则可以进一步改善检测极限。

基因表达

在一些实施方案中，本公开涉及植物基因表达。如本领域的任一技术人员公知，在有机体中，基因以DNA编码。通常，为了使基因表达，编码基因的DNA被转录成mRNA，然后mRNA被翻译成蛋白质。基因转录成mRNA称为“基因表达”。在基因组水平下，所有的mRNA共同称为“转录物组”，同样有机体中所有的DNA被称为其“基因组”。

分析基因表达的方法

用于分析基因表达的方法是本领域公知的。方法包括例如RNA印迹法、实时PCR、微阵列和RNAseq（使用下一代DNA测序技术的整个转录物组测序）。响应于任何特定病原体或害虫的完全型疾病在复杂的RNA群体的表现，包括编码（mRNA）和非编码（小RNA）序列。可以使用新的下一代DNA测序方法（NGS）将上述情况分析至前所未有的深度，其中所述的方法揭示了极稀有的mRNA、剪切变体、等位基因变体和SNP。已经应用于植物中(Navarro et al.,2009;Donaire et al.,2009)的该技术取得了所研究的有机体的大量的生物信息学知识。就缺乏整个基因组序列信息的植物物种而言，可以替代使用广泛的EST数据库。通常使用qRT-PCR分析来证实所获得的转录物组数据，或者与蛋白质组或代谢物组分析整合。此外，使用生物网格理论来分析深入的转录物组概况可以帮助定义基因调节网络并识别重要的疾病特异性生物标志物。

在一个方面中，用于基于杂交的快速检测的微阵列技术（在Carter andCary2007中有所描述）用于基因表达分析。这种整合的采样-反馈核酸装置可以用于例如识别恰好在果园的植物中的所关注基因的表达。此外，该装置经得起未经训练的员工的现场使用，并且可以使用低成本的侧向流层析技术来实现。

在另一个方面中，可以使用定量实时PCR(qRT-PCR)来评价基因的表达，其中所述的定量实时PCR为已经建立用于病原体检测的技术。可以由样品提取mRNA，并评价作为特定疾病的生物标志物的特定mRNA的表达水平。在一个方面中，本发明提供了基于疾病特异性基因表达的生物标志物，可以使用qRT-PCR或上文所述的现场可调节的微阵列来检测所述的生物标志物，从而进行疾病特异性的诊断。

植物

在一些实施方案中，本公开涉及植物疾病的检测。在一些方面中，本公开涉及柑橘植物的疾病检测。本发明所提供的方法、组合物和装置可以举例但非限定地用于检测以下类型的植物的疾病：柑橘（包括华盛顿脐橙、巴伦西亚橘、和Hamlin橘品种、柑橘、克莱门氏小柑橘、柠檬、酸橙和葡萄柚）、马铃薯和西红柿。

疾病检测的方法

在一些实施方案中，本发明提供了检测植物疾病的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过分析由植物得到的VOC来检测植物疾病的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过分析植物的基因表达来检测植物疾病的方法。

通过VOC分析的疾病检测方法

在一些实施方案中，本发明提供了通过VOC分析的植物疾病检测方法。

在一些方面中，本公开涉及通过监测植物释放的VOC来确定植物材料中疾病存在的方法，其中所述的植物材料例如为整株植物、叶材料、果实、浆果、花、接穗、花器官、根茎、种子、球茎、海藻、植物的块茎。

在一个方面中，本公开涉及其中通过VOC分析来检测植物疾病的方法。在通过VOC分析来检测植物疾病的方法中，获得针对疾病进行测试的植物所释放的VOC样品。然后，通过一种或多种方法来分析植物所释放的VOC样品，以便确定样品中存在的一种或多种VOC的特性和/或数量。然后，将在样品中存在的VOC的特性和/或数量与由健康和/或受感染的植物得到的VOC值相比较，以便确定待测试植物是否患有疾病。在一些方面中，在进行测试植物的VOC分析之前，由健康和/或受感染的植物的VOC值是已知的，并且将由测试植物得到的VOC值与健康或疾病植物相关的VOC的预定值相比较，以便确定测试植物的疾病状态。在一些方面中，在进行测试植物的VOC分析的同时或之后，确定由健康和/或受感染的植物得到的VOC值，并且一旦与健康或疾病植物相关的VOC值是已知的，则将由测试植物得到的VOC值与由健康和/或受感染的植物得到的VOC值相比较，以便确定测试植物的疾病状态。

在一个方面中，本公开涉及这样的方法，其中使用合适的分析方法预先绘制VOC概况，其中所述的合适的分析方法例如气相色谱质谱（GC/MS）、和/或气相色谱/差示迁移光谱（GC/DMS）；并且指示特定疾病存在情况的VOC识别标志被识别。就非原位分析而言，可以使用特定的吸附表面来收集VOC，例如固相微萃取（SPME）和Twister装置。

在一些方面中，可以使用GC/MS来实施吸附在SPME纤维上的VOC分析。由于VOC的分布和/或组成被存在的病原体改变，所以GC/MS概况可以起到病原体存在或缺乏的识别标志的作用。但是，由于MS允许用于化学品识别，所以可能有利的是仅选择描述了植物健康状态的具有统计学意义的VOC的GC峰。任何强峰的选择算法可以用于取得上述目的。与这些峰有关的质谱可以用于建立所关注的挥发物的化学品特性。任何合适的MS结构分析方法（例如电子电离(EI)/化学电离(CI)的组合，MSⁿ等）都可以使用。

在一个方面中，本公开涉及在合适的时候使用用于体内和体外测量植物材料的化学品识别标志的合适的现场传感器装置来场内测量植物VOC的方法。可以实施此类测量来检测与特定疾病有关的VOC识别标志，并基于之前收集的VOC文库来检测病原体的存在和特性。可以使用合适的数据挖掘方法。由原体生物标志物的数据库得到的化合物可以用于设备的训练/校正，其中所述的原体生物标志物的数据库是在使用所选的GC/MS和/或其他合适的分析方法进行场内检测之前集合得到的。

在一个方面中，本发明提供了连接的分析系统来监测和测量用于植物疾病检测的柑橘植物品种所排放的挥发性有机化合物。在一些方面中，基于VOC的传感器可以用于检测对病原体感染产生的宿主植物应答，以及通过植物的场内取样来监测植物的疾病状态，从而寻找感染前和感染后所排放的VOC识别标志内的差异。在一些方面中，可以了解由柑橘树叶散发的背景VOC的基线变化。在一些实施方案中，实施分析来确定普通栽培的柑橘品种之间存在多少变化性，这可以影响疾病特异性VOC的任何文库的生成。

在一些方面中，相同物种的柑橘植物的不同品种具有相似的但不同的VOC表达概况，并且通过分析由植物排放的VOC，这种识别标志可以用于两种不同的但是极其相关的柑橘品质之间的区别。在一些方面中，可以使用将两种检测技术的输出相关联的GC/MS和GC/DMS检测来建立用于DMS的柑橘挥发物的VOC识别标志。

在一些方面中，本发明提供了通过识别并测量指示特定疾病（例如柑橘的HLB或CTV）的化学识别标志、基于柑橘以及其他植物所释放的挥发性代谢物来分类柑橘以及其他植物的健康状态的方法。在一些方面中，分类过程涉及两个主要的步骤：1）绘制指示某些病原体存在的VOC分布；以及2）场内测量VOC识别标志并与之前绘制的VOC概况相比较，以便确定植物的健康状态。此外，可以进行多种分析方法的应答的比对。

植物VOC概况的绘制

可以使用非便携式的分析设备，例如GC/MS，来实施VOC的最综合的分析。使用指定的特异性吸附表面（例如固相微萃取(SPME)纤维或其他固体吸附剂相(例如Twister)），样品的这种原位收集是可行的。在一些方面中，分析考虑了挥发性化合物可以根据叶的年龄、类型、一年的季节等其他因素而改变。

通常，理想的是减少试验中潜在变量的数量。纤维的选择允许精细调节收集用于进一步研究的化合物的范围；可以使用多种类型的纤维来收集更大量的化合物。在一个方面中，具有Carboxen/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）聚合物涂层的SPME纤维用于收集柑橘植物所排放的挥发物。

在一个方面中，按照以下实施VOC取样过程。在通过GC/MS进行分析之前，纤维或吸附剂相限定用于根据制造商的建议，由背景环境化学品中除去任何起始点被吸附的化学品。就初始取样而言，纤维定位于铝保持器（用于保护脆弱的尖端）中的叶表面附近。为了限定叶VOC上昼夜循环的作用，可以在一天的特定时间点时实施取样。暴露时间取决于植物VOC生产的效率。待考虑的一个因素可以为环境温度；在一些方面中，最大的VOC生产可以在60-75F范围内发生。暴露时间可以根据条件而改变。在一个实施方案中，暴露时间可以为大约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12小时。在一些方面中，在最佳的VOC生产条件下，暴露时间可以为大约6小时，并且在非最佳VOC生产条件下可以为大约12小时（例如在一年的变冷时间的夜晚）。在取样后，可以提交纤维用于生物化学分析。

在一些方面中，可以实施由不同的分析技术得到的数据的相关性。由GC/DMS得到的化合物识别标志可以与GC/MS相关，使得可以在两组数据组中减小化学化合物的识别。GC/MS色谱上的单个的峰可以与DMS的输出光谱相关。使用合适的参照化合物的比对光谱允许GC/MS信号区域中的峰与GC/DMS区域中的匹配相当的峰相关。这种匹配可以允许建立用于DMS传感器的化学品文库数据。在一些方面中，可以将重要的VOC代谢物生物标志物定位于GC/DMS信号空间中，其中所述的生物标志物并非呈现于GC/ITMS数据中，或者反之，由于对两种检测器的某些化学品的敏感性不同。

在一些方面中，如果仅考虑由病原体生物标志物得到的信号而非考虑总的分析空间，则可以进一步改善使用GC/DMS装置的分类精确性。可以使用由生物标志物文库得到的化合物标准品来训练和校正检测装置。经训练的装置能够对复杂的背景及极低的浓度来区别所关注的化学品（基于DMS/FAIMS的装置的检测极限可以低至几ppb）。如果使用吸附膜或其他预浓缩器和/或背景去除手段来预浓缩所关注的化合物，则可以进一步改善检测极限。当与特定疾病相关的化学化合物被检测到时，传感器将提供正的输出。如果由与某些疾病相关的数据库得到的大量的化学品被检测到时，则正的输出将更有效力（假阳性的几率较低）。可以使操作者慎重的是在某些条件下，哪种效力阈值将植物考虑为不含病原体的或受感染的是最佳的。任何合适的是，可以针对特定的植物种类、果园、一天的时间、季节等进行调节。

通过VOC分析检测植物的HLB

在一些实施方案中，本发明提供了用于通过分析VOC来检测植物HLB/柑橘黄龙病的方法。可以通过本文所述的方法由植物得到VOC，并且可以如本文所述来分析VOC，以便识别在生病的以及对照植物中呈现的化学品。所选的VOC可以用于HLB病原体的检测，以及在HLB感染过程中植物VOC的排放与代谢物的变化的相关性。

在一些方面中，本公开涉及用于确定由于HLB疾病相关的柑橘树叶排放的挥发性化合物的方法。此外，本公开涉及这样的方法，其中通过利用气相色谱质谱（GC/MS）来记录VOC概况，以及识别指示HLB病原体存在的生物标志物。可以使用特定的吸附表面（例如固相微萃取(SPME)和Twister装置）来收集VOC。

此外，在一些方面中，本公开还涉及利用合适的数据挖掘方法来建立健康和HLB生病植物的气相色谱中的差异。本公开具体涉及HLB生物标志物的特性，其中所述的生物标志物包括但不限于以下化合物：二氧化碳、丙烷、2-甲基-戊烷、o-二甲苯、十三烷(C₁₃H₂₈)、2-乙基-1,4-二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯、2,2,3,4-四甲基-戊烷、烃（例如十五烷(C₁₅H₃₂)等）。

通过VOC分析检测植物的CTV

在一些实施方案中，本发明提供了通过分析VOC来检测植物柑橘衰退病毒（CTV）。可以通过本文所述的方法由植物获得VOC，并且可以如本文所述来分析VOC，以便识别在生病的和对照的植物中呈现的化学品。所选的VOC可以用于CTV病原体的检测，以及在CTV感染过程中植物VOC的排放与代谢物的变化的相关性。

VOC分析可以用于检测柑橘品种中的CTV，并且在一些方面中，其可以用于场内实时监测植物的健康。在一个方面中，由于VOC分析是非侵入性的，则其是有利的。生物生成的挥发性有机化合物（BVOC）为所有活的有机体、特别是用于所述的目的以及保持、生长和功能的植物所产生的VOC形式。此外，BVOC作为由于非生物/生物应激（水和水应激）、锌和营养缺陷的应激反应的一部分而被释放。此外，BVOC还可以称为“诱导的VOC”（IVOC）。作为CTV感染后的结果，由柑橘品种的叶所排放的BVOC/IVOC概况可以显著改变。

在一些方面中，柑橘品种的场内VOC取样方法用于健康和CTV感染的农作物之间的区别，其中所述的取样方法使用了具有飞行质谱分析的热脱附气相色谱(GC/TOF-MS)时间的Twister和静态顶空取样。在一些方面中，本发明提供的VOC取样方法用于监测针对CTV的植物健康。

本公开具体涉及CTV生物标志物的特性，其中所述的生物标志物包括但不限于以下化合物：月桂烯、蒈烯(δ-3-)、罗勒烯(e-β-)、十六醇、柠檬烃、二十四烷、以及布藜烯(α-)。

通过基因表达分析的疾病检测方法

在一些实施方案中，本发明提供了通过基因表达分析的植物疾病检测方法。

在一个方面中，在通过基因表达分析检测植物疾病的方法中，获得由用于疾病测试的植物所表达的核酸（例如RNA）样品。然后，通过一种或多种方法来分析植物表达的核酸样品，以便确定样品中存在的一种或多种核酸的特性和/或数量。然后，将样品中存在的核酸的特性和/或数量与由健康和/或受感染的植物得到的基因表达值相比较，以便确定测试植物是否患有疾病。在一些方面中，已知由健康和/或受感染的植物得到的基因表达值后，将测试植物的基因表达分析的分析时间以及由测试植物得到的基因表达值与健康或生病植物相关的基因表达的预定值相比较，以便确定测试植物的疾病状态。在一些方面中，在测试植物的基因表达分析的同时或之后确定由健康和/或受感染的植物得到的基因表达值，并且一旦已知与健康或生病的植物相关的基因表达值，便将由测试植物得到的基因表达值与由健康和/或受感染的植物得到的基因表达值相比较，以便确定测试植物的疾病状态。

在一些方面中，通过基因表达分析的植物疾病检测是基于宿主早期应答的分析，以及在特定高生理学活性组织（例如叶或果皮组织）中早期调节基因的识别。在一些方面中，在集中与宿主应答的多个qRT-PCR检验中使用这些基因，该qRT-PCR检验可以用于补充定向于病原体的疾病测试，或者在病原体效价低于用于疾病检测的另一种设备的敏感度阈值时，允许在无症状阶段进行早期检测。

疾病和环境条件影响了宿主植物的短距离和长距离信号发射机制。在叶组织中发生的感染可有诱导其他组织（例如果实）的转录物组应答，在这种情况下，感染信号通过诱导宿主应答基因而被扩增。病原体诱导的基因可以以几百或几千个RNA分子来转录，同时病原体DNA可以以仅仅几个拷贝存在并且可以低于检测的敏感度水平。基因中各宿主应答的表达可以是组织和/或发育阶段依赖性的。在某些方面中，特定的植物组织可以具有响应于病原体的基因表达模式（其可以被用作植物病原体的传感器）。

在一些方面中，基因表达生物标志物可以用于通过澄清现存树木的疾病状态来改善疾病管理程序。在一些实施方案中，植物基因表达的分析允许在较早的无症状阶段进行疾病的检测，其中限定植物的继发感染仍在实践。此外，在一些方面中，由于基因表达生物标志物成为可利用的，所以其可以用于使潜在的治疗策略合法化，并且用于在柑橘胚质筛选抗性，或者使转基因方法合法化。在一些方面中，通过分析响应于病原体的柑橘基因的表达，可以在基因改善程序中使用传统的或生物技术方法，针对抗性栽培品种筛选柑橘胚质，而使其包含在内。

识别基因表达和VOC之间的相关性

在一些实施方案中，本发明提供了响应于病原体和/或环境条件而使得植物基因表达与植物VOC释放具有相关性的方法。

在一些方面中，早期感染或环境应答的基因表达宿主生物标志物可以容易地整合到当前及未来的疾病诊断技术和平台（例如PCR、侧向流微阵列(LFM)、差示迁移分光计(DMS)和GC/MS）中，以用于共检测特定的基因转录物或挥发物，由此轻微地升高植物疾病检测的领域、范围和/或精确性。

此外，本公开涉及不同分析方法的相关性，即，涉及联合使用的不同分析方法的设备响应的比对。

实施例

以下实施例进行示例性的，并且无意于以任何方式限定本公开的任何方面。

实施例1：基因表达和HLB

研发合适的试验设计来检验宿主应答以及清楚地识别在不同感染阶段由HLB调节的应答生物标志物。在幼年和成熟阶段，针对果实和叶，分析4种类型的组织。最初的两种类别为有症状的和无症状的样品（皮和叶），其得自位于Fort Pierce(St.Lucie County,FL)的the USHRL-USDAFarm的、受感染的“巴伦西亚”甜橙(C.sinensis L.Osb.)树。使用由树冠的不同区域收集到的4-6片叶的叶柄，在CaLas存在下，通过PCR分析树。第三个类别为在相同区域，由PCR阴性表观健康的树得到的果实。第四个类别由水果构成，其得自位于Citrus Research and Education Center(LakeAlfred,FL)处的未发生疾病的区域中的健康“巴伦西亚”树。使用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)提取来提取RNA，然后使用RNeasy MinElute Cleanup kit(Qiagen,Valencia,CA)，根据制造商的说明书来纯化。使用RNA来实施深入的转录物组分析（其使用了Illumina Genome Analyzer II，根据制造商的说明书进行）以用于cDNA文库的构建和序列运行分析。使用生物分析器确定各文库的品质(BioRad,Hercules,CA)。各文库以独立的泳道运行，从而获得测序的每个cDNA分子的末端至多85个碱基对的读序长度。这种类型的过程被称为RNAseq。

使用Velvet软件处理并收集原始数据。使用BWA(Li and Durbin,2009)实施单个读序和叠连群与甜橙的单一基因组(15,808序列；NCBI UnigeneBuild#11,4/20/09)比对。

使用Mapman and Blast2GO软件实施转录物组数据的功能分析，从而在途径和网络中分类差异调节的基因，并理解在不同的疾病阶段所诱导的细胞代谢中的主要变化。在统计分析之后，最受疾病影响的途径被识别，并且在这些途径中，选择似乎在无症状阶段受到高度调节的重要基因。使用qRT-PCR分析来分析这些基因，从而证实它们的表达图案，并核实它们在其中HLB病原体尚未被其他检测方法检测到的植物中是否可以作为感染的早期指示剂工作。

在6对比较（对照、表观、无症状和有症状的阶段）间的果实中，受到CaLas感染的差异调节的基因（由甜橙的单一基因(在NCBI中呈现)表示）示于表1-6中。相对于叶，在表观健康、无症状和有症状的阶段下，HLB差异调节的基因示于表9-14中。

使用Taqman Real Time PCR，以下基因显示在果实组织中，在疾病的无症状阶段，是统计学差异表达的，并且它们可以被认为是宿主的HLB生物标志物：GH3.1(上调节的)(S22545043)；GH3.4(上调节的)(S44237769)；KA02(下调节的)(S44303609)；水杨酸甲基转移酶(上调节的)(S44277040)；WRKY70(上调节的)(S44288591)；MYB-相关的TF(上调节的)(S44256583)；U-盒(S22566824)；HSP82(下调节的)(S44237646)；蔗糖酶(上调节的)(S35152777)；萜烯合成酶环化酶(下调节的)(S22583829)；NN脂质转移蛋白质(LTP)(上调节的)(S44279331)；酸性纤维素酶8(下调节的)(S22606212)；ω-6-FAD(下调节的)(S44244604)。

与叶分析相关（未成熟和成熟阶段），在qRT-PCR分析中识别在无症状阶段的多种差异调节的基因，其可用作生物标志物。在未成熟阶段，这些基因为：酸性纤维素酶(S22606212)；萜烯合成酶1(S44285742)；ERTF2(S44250648)；12-氧代-植物二烯酸酯还原酶(S34125138)；脂氧化酶2(S34124539)；NNLTP(NCBI编号:EY754661.1)；β-淀粉酶(S44303510)；棒曲霉素3(S22533016)；葡萄糖-磷酸-运送蛋白2(S22591828,S22591828,S44257732,S22591828)。在成熟阶段，这些候选的生物标志物为：ENT-异贝壳杉烯酸羟化酶2(S44251582)；棒曲霉素3(S22533016)；α-淀粉酶(S44224848)；WRKY70(S44225142,S44227900,S44288591)。

实施例2：HLB感染-VOC的GC/MS

基于试验室的传统气相色谱质谱（GC/MS）分析允许识别在VOC生产中由于病原体感染而产生的差异，并使用MS数据识别特定的“生物标志物”化合物。使用GC/MS实施吸附在SPME纤维上的VOC的分析（图3）。在加热时，吸附的化学品可以解吸附，从而被引入到GC/MS设备中并进行分析。由于VOC的分布由于病原体的存在而改变，所以GC/MS概况可以揭示与病原体存在或缺乏相关的化学化合物。可以使用任何强峰的选择算法来选择可以区别健康和受感染的植物的统计学显著的峰。在我们的实施例中，所得的数据按照以下进一步处理。

为了减少色谱数据的范围并抵抗由可能的噪声和轻微的信号未对准而产生的潜在干扰，使用自回归（AR）模型来提取各色谱的特征。[Zhao2009,Zhao2008]p阶AR模型可以通过以下等式（1）表示：（请参见由所引用的原文得到的等式）（1），其中x(n)为数据系列的信号点，ai为AR系数，p为模型阶数，而en为估测误差。AR模型的目的在于使用系数ai(i=1,…,p；p：模型阶数)由其之前的p值（x(n-1),x(n-2),…,x(n-p)）预测第n个值x(n)。AR建模方法的目标在于估计AR系数，该系数可以通过优化方法拟合原始数据。使用该模型，可以使用p维的特征向量(a1,a2…ap)来表征各色谱概况。作为识别区别峰的第一步，色谱峰基于预定容窗内峰位丰度以及平局值穿越率（mean-value crossing rate）而位于各概况中。将点i的相邻范围的单一边长设定为k，如果点i具有比范围[i-k,i+k]内所有的点具有更高的强度，则点i被认为是峰候选物。为了确保所选的峰并非为噪声信号，则信号点(.)的平均值穿越率被定义。如果在范围[i-k,i+k]内具有峰，则该峰及其相邻的点需要明确地高于该范围内信号的平均值。简言之，该峰位容窗内的信号点不会围绕平均值振动。除了过零率以外，我们建议引入称为“平均值穿越率”(η)的标准，从而确定围绕平均值的信号振动。平均值穿越率越低，则所观察到的信号越不可能是噪声。就橘树样品的色谱而言，使用k=10和η=50%的值。在检测峰以后，Studentt检验用于相应的峰强度。代表了小p值(p<0.05)的峰被认为是统计学显著的且潜在的生物标志物。为了研究对照和受影响的植物之间的分类，主要成分分析（PCA）和主要成分回归（PCReg）分别用于在视觉上和数量上检验分类的结果。留一法策略（其为用于小样品组的典型的证实策略）与PCReg结合，从而提供诊断精确性的定量评估[Bullinger,2008;Freitas,2008]。

对GC峰进行记录，其中所述的GC峰被识别为健康和疾病批料的GC概况的区别特征。与这些峰相关的质谱用于建立所关注的化学化合物的化学特征。可以使用合适的MS结构分析方法，例如电子电离(EI)/化学电离(CI)的组合、MSⁿ等。所得的化学品列表可以用作用于特定植物类型的生物标志物检测的参照数据库。此类数据库可以扩展至多种病原体。当发现新的生物标志物时，可以进一步更新数据库。此外，发现会得到不够强的差异的化合物可以由数据库中除去。

在本公开中，表明受HLB病感染的Hamlin橘树的特异性化学化合物包括但不限于：二氧化碳、丙烷、2-甲基-戊烷、o-二甲苯、十三烷(C₁₃H₂₈)、2-乙基-1,4-二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯、2,2,3,4-四甲基-戊烷、烃（例如十五烷(C₁₅H₃₂)等）。通过监测这些化合物，可以监测HLB感染的植物。可能的是得到特定的VOC的生物化学途径是未知的；但是这些化合物的测量连同代谢物的表达的绘制可以使诊断植物感染（其可以帮助种植者进行判定）成为可能。

实施例3：HLB感染-SPME GC/MS HLB（Florida）

在该研究中，确定9种不同的生物标志物在HLB和健康植物之间产生分离。就18种收集的样品（9种HLB感染的，而9种健康的）而言，我们发现9个具有显著Student t检验结果(p<0.1)的峰（图21）。确定可以用于区别HLB感染的和健康的植物的9种潜在的生物标志物如下：二氧化碳、丙烷、2-甲基-戊烷、o-二甲苯、十三烷(C₁₃H₂₈)、2-乙基-1,4-二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯、2,2,3,4-四甲基-戊烷、烃（例如十五烷(C₁₅H₃₂)等）。具体而言，在HLB中，o-二甲苯、十三烷、2-乙基-1,4-二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯、2,2,3,4-四甲基-戊烷、十五烷是上调节的；在HLB感染的植物中，二氧化碳、丙烷、2-甲基-戊烷、十三烷是下调节的。使用留一法证实策略，PLSR产生的分类精确率为83.33%（健康为6/9，HLB为9/9）。

实施例4：挥发性数据库的研发

研发分析并解释挥发物概况的数据库，其中所述的挥发物概况是使用Twister-GC-TOF方法由实地和温室样品得到的。可以通过公共互联网查询界面(http://eros.fiehnlab.ucdavis.edu:8080/binbase-compound/,choose‘volatile’when selecting the database)，针对光谱、化合物识别器或化合物名称来查询挥发物的BinBase数据库（vocBB）。

图4中，面板（A）示出了挥发性化合物如何被识别为真正的代谢物：首选，使用市售的Adams挥发物文库，其使用了传统的基于烷烃的Kovats停留指数，该指数被转化我们的基于（更合适的）脂肪酸甲酯的“Fiehn停留指数”。除了购买的真正的标准品以外，所有的2000个Adams挥发物光谱均被转化，并支持Fiehnlab vocBB。例如，在超过2100种挥发物概况中，潜在的挥发性化合物水杨酸甲酯（参见在成熟果实和幼叶中，响应于HLB感染的水杨酸甲酯转移酶的诱导(图15)）均检测为阳性，其中所述的超过2100种挥发物概况是目前为止已经获得的，并且由Adams文库通过匹配的质谱和停留指数来注释，参见图4中的面板（B）。

到目前为止，vocBinBase数据已经储存了1465有效的挥发物光谱，其中183种被识别为起源于例如Twister涂料或有塑料袋包装材料的化学加工品。此类加工品的峰自动地由数据输出中排除，即，不能混乱柑橘植物感染的IVOC概况的统计学分析。此外，vocBB以这样的可能性为特征：使用数据库识别器注释所识别的代谢物，以便通过共同的酶和基因注释直接将挥发物概况与基因组数据整合。例如，水杨酸甲酯在KEGG生物化学途径中储存为C12305，其与苯甲酸途径图谱07110相连。尽管KEGG未分配基因编号给水杨酸甲酯的形成或降解，但是备选数据库证实了生物途径，如下：通过TAIR AraCyc来源，将水杨酸甲酯与拟南芥基因AtBSMT1(At3g11480)连接的MetaCyc数据库。

因此，已经通过允许多个数据库识别器与挥发物概况数据组一起输出而建立的vocBB挥发物数据库。所有识别的代谢物均被拨入vocBB中以用于这些多个穿越数据库的编号，以便简单地将挥发物概况与基因表达网络整合。

vocBB数据库本身是由实际Twister GC-TOF质谱概况构建的。从2010年7月起，vocBB包含120万个质谱，这些质谱是由研究18种物种的2125个样品生成的。大量的市售可得的物种参照标准品（也称为“精油”）已经用于增加物种的数量，并由此增加了储存在数据库中的真正的挥发性代谢物的数量。例如，多种柑橘精油作为沉淀器样品用于同样证明了TwisterGC-TOF技术的功能的数据库中，以及处理这些数据的数据库中。在数据库中，香柠檬、甜橙、葡萄柚和柠檬的挥发物概况生成了挥发性代谢物的许多新的入口（图5）。使用所述概况的数据的简单的等级聚类，这些精油的所有样品均正确地聚类而不具有任何错误的分类。该测试提供了这样的证据：Twister GC-TOF能够简单地检测挥发物并使用用于分类样品来源的强度（在聚类图中，由蓝色变为红色）。因此，对于柑橘挥发物而言，所述的研究可以作为原理论证。此外，显示由于我们获得了这样的证据：与表观健康和对照树相比，在HLB感染的柑橘果实中存在大量的基因表达差异，所以柑橘的果实精油可以用于HLB感染的检测。

此外，在受控的温室条件下实施HLB感染的研究。图6示出了HLB感染的试验建立和记录。在使用HLB接种（Cleopatra根茎x巴伦西亚橘接穗）柑橘植物后，在第6、11、16和21周时，记录22种受感染的植物的挥发物概况。通过PCR检测感染的发展以及症状的发展。清洁的Twister和清洁的袋通过邮递送至Florida中的场所；然后挥发物被诱捕到Twister上，该Twister使用Reynolds^TM烤肉袋放置在受感染的和健康的对照植物的封闭的柑橘树枝中。在10AM开始1小时的暴露时间、摇晃各植物达5分子来实施取样。作为阴性对照，在各时间点，通过Twister挥发物吸附取样温室空气以及得自空袋的空气。空气温度为75°F，湿度为89.6%。随后，通过邮递将Twister送回至UC Davis用于分析。

总计，在该研究中检测到456种挥发性化合物，与阴性对照相比，其中260种化合物在袋封的样品中，保持为以更高的浓度被检测。有趣的是，在该研究中，检测到191种挥发性代谢物，这些物质之前在vocBinBase数据库中不存在，在次证明与目标方法相比，数据库方法的用途，其中在所述的目标方法中，分析物可以被预定义，并随后进行筛选。使用停留时间和MS匹配，这些新的、柑橘依赖的代谢物中的一些代谢物被清楚地识别，如上文给出：z-石竹烯、苯甲酸苄酯、莰烯、δ-3-蒈烯、香茅醛、2,5-二甲氧基-p-异丙基苯、二乙基琥珀酸酯、p-乙基苯乙酮、十四烷酸异丙酯、cis-p-孟-2-烯-1-醇、甲基癸基酮、香叶酸甲酯、橙花醛、2-辛醇、α-松萜、顺香桧烯水合物、香桧烯、反式倍半香桧烯、γ-萜品烯、异松油烯、n-十四醇乙基α-侧柏烯。

总体而言，在受控的HLB感染时间过程研究中，79种代谢物被识别，由此可用于途径分析以及与转录物组数据相比较。在一元统计学及多变量工具中分析挥发物概况。原则上，单变量方法由于其更容易理解而是有利的，并且可以在潜在的场测试以及证实研究中以更直接的方式使用潜在的生物标志物。并不奇怪，当柑橘树仍年幼并且活跃地发育具有不断成熟的叶时，在该研究中影响挥发物概况的最重要的参数为时间过程本身。

因此确定，几乎所有的挥发性代谢物或者通过增加强度或者通过降低强度而受到植物发育的影响，并且在11-16WAI下有时甚至受到最强排放的影响。图7示出了整合了健康和受感染的植物的示例性的短暂概况。显而易见的是在信号强度下，可能是由于叶成熟，许多萜类化合物减少，这在HLB感染的果实中在基因表达萜类化合物途径的下调节中有所反应。同样如图7所示，经过一段时间，其他化合物增加。

随后，与健康对照相比较，针对HLB感染的影响来研究挥发物概况。如通过检测HLB感染的症状和PCR阳性检测而明显的是，在感染后的第6周时，最初的几株植物被检测到PCR阳性，而在第21周时，大部分接种的植物测试到PCR阳性，并且实际显示可见的疾病症状以及矮化生长。相似地，存在最初极少数的挥发性化合物，其在健康和受感染的植物之间具有显著差异p<0.05，而在感染后的第21周，100种挥发物经测试是不同的。

令人惊奇的是，大部分这些显著的差异在排放中受到抑制（图8），而仅有几种化合物增加。与一些基因表达研究所表明的结果不同，在感染后我们未发现萜类化合物的增加，或者甚至未检测到水杨酸甲酯的存在。水杨酸甲酯作为信使化合物以细胞内的水平工作，并且可以不作为潜在的生物标志物被释放到大气中。

相反，我们识别了大量的潜在的挥发性代谢物生物标志物用于检测HLB感染，其中的一些标志物在症状明显之前形成。其实例在图9中给出，其中显示己烯乙酸酯和十三醛在第21周在HLB感染下作为两种差异调节的化合物，而结构尚未识别的代谢物可以甚至在较早的时间点下表明HLB感染（图9）。代谢基因中的差异范围（参见以下实施例5）表明主要和次要代谢物可以在挥发物排放之前受到上调节。

实施例5：基因表达数据和挥发物的相关性

在本实施例中，研发生物调节网络来关联和显现通过深入的转录物组测序而获得的基因表达数据。这些活动是通过以下完成的：基于柑橘的转录物组的分析而致力于发现和证实用于HLB早期检测的生物标志物。

我们使用了之前公开的叶的转录物组分析的数据组，以及使用RNA-seq技术在Illumina GA-II分析器上在我们的试验室中由柑橘果实皮组织得到的那些。由柑橘果实皮组织得到的数据组表明以下所述并证实的信息。这些数据组包含158656个叠连群，与NCBI甜橙单一基因组相比，该单一基因组包含15808个唯一的基因（在我们仍不具有参照柑橘基因组序列时进行了此项工作）。

大约一半（45.7%）的这些基因（15808）能够与我们的叠连群相匹配，并且超过90%的绘制读序被指定为1柑橘NCBI单一基因。一旦叠连群匹配，我们便使用与该叠连群相关的读序的总数作为计量来测量该基因的表达。我们在有症状、无症状、表观健康以及野生型果实之间进行了6对比较，从而计算单个基因表达的变化（对数倍数比）。在我们所检测的15808个基因中，我们发现在HLB感染的不同阶段，大约1156-1723个基因是差异表达的（上调节或下调节）。

接着，我们使用Pathexpress软件(Conesa et al.,2005)和MapMan软件对这些基因进行功能表征。我们观察到在差异调节的途径中，许多途径涉及会导致挥发性（香味和芳香）化合物的生物合成的途径，并且当它们在果实的无症状和有症状阶段受到调解时，我们在图10中强调了这些途径。在导致萜类化合物合成的途径以及其他重要的途径中，观察到转录的变化。这些途径包括在质体中发生的、类异戊二烯生物合成的非甲羟戊酸途径或者4-磷酸-2-C-甲基-D-赤藻糖醇/5-磷酸-1-脱氧代-D-木酮糖途径(MEP/DOXP途径)。此外，质体4-羟-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸还原酶(ISPH)和香叶草基香叶草基pirophosphate合成酶1基因在HLB感染的果实中受到上调节，并且可能影响与该途径有关的类胡萝卜素的生物合成以及挥发性化合物。在胞液中，HLB调节的途径包括会产生倍半萜烯和固醇的茉莉酸、甲羟戊酸途径。

转录物组分析显示在疾病的早期和晚期阶段，引入了编码脂肪氧合酶、丙二烯氧化物合成酶和12-氧植物二烯还原酶的基因（图11）。这些结果是使用qRT-PCR分析证实的，其中所述的分析选择了2种基因：脂氧合酶2和12-氧植物二烯还原酶。

成熟果实的定量实时分析证实了通过深入的转录物组概况确定的表达模式。有趣的是，在在成熟的叶中，在有症状的阶段诱导了所述的两种基因，而且，这证明茉莉酸介导的防御应答是通过叶组织中的HLB感染而诱导的。

编码多种类型的萜烯合成酶（其与单萜和二萜的生物合成有关）的基因显示受到HLB疾病的差异调节，该证据可能影响了柑橘果实的芳香组合物及营养性质（图12）。这些酶涉及多种萜烯、赤霉素、brassinoesteroid、生物碱和植物挥发物的合成和运输，这些酶在植物的繁育和防御中起到不同的作用(Mercke et al.,2004)。在4种类型的植物的果实和叶中，使用qRT-PCR来分析与萜类化合物代谢有关的2种基因（图12和13）。数据证明在HLB感染的果实中，萜类化合物途径受到下调节。相反，在幼叶中，萜烯合成酶3和萜烯合成酶环化酶由HLB疾病诱导，同时，在成熟的叶中，萜烯合成酶3在无症状和有症状阶段受到下调节（图13）。当我们的数据不能预示所编码的酶的底物特异性时，这些萜类化合物基因的转录调节未必一定预示哪种特定类型的萜烯被诱导。我们能说的是这些基因的诱导可能在无环、单环和双环单萜的生产中引起差异（图14）。

表现出被诱导的另一种挥发物途径为水杨酸相关的途径，响应于HLB感染而诱导的水杨酸甲基转移酶在成熟的果实和幼叶中观察到（图15）。这种基因造成了水杨酸甲酯中水杨酸的转化，并且已知其在不同的植物中在病原体攻击后被诱导(Loughrin et al.,1993;Huang et al.,2006)。在TMV接种的烟叶中生产的气态MeSA与受感染的和健康的植物之间的传播有关的空气传播的防御信号，并且在感染后生产的气态MeSA的量在相邻的健康烟草植物中诱导PR-1蛋白质的表达(Shulaev et al.,1997)。尽管多种病原体诱导了水杨酸甲酯的生产，但是识别由感染的叶和果实排放的挥发物中的水杨酸甲酯可以用于HLB诊断。

除了会导致生产挥发物途径的途径以外，我们识别出许多用于疾病早期检测的、差异调节的其他生物标志物。我们构建了这样的网络，基于已知的途径和文献分析，所述的网络连接了不同的途径。在图16中示出的这种网络提供了对果实中由HLB疾病诱导的代谢的鲜明的洞察。碳水化合物代谢在果实中被改变，并且蔗糖代谢和糖酵解受到严重的影响，同时在质体中，与光反应有关的多个基因被诱导。

激素功能障碍在响应于HLB感染的宿主中可以起到重要的作用。有趣的是，在有症状的果实中，赤霉素和细胞分裂素相关的基因主要受到下调节，同时乙烯的生物合成和信号传导被诱导。关于细胞功能的调节，蛋白质的降解和修饰过程受到所述疾病的高度影响。实际上，与C3HC4类型的RING指纹蛋白质（其与泛素的降解过程有关）有关的基因在HLB感染的果实中是差异表达的（图17A）。在无症状和有症状阶段，这些结果与基因热休克蛋白质82的下调节相连（图17B）。这种基因热休克蛋白质82的基因通过使用文献-辅助的蛋白质相互作用的数据库(Cusick et al.,2009)来构建生物调节网络而被识别，从而在柑橘中推断出使用graphviz软件可视的所预测的PPI网络（图17C）。有趣的是，热休克蛋白质（HSP82和HSP70）（在柑橘中，在所推断的PPI网络中是高度相互作用的蛋白质）在由感染的果园得到的3种类型的果实（表观健康、无症状和有症状的阶段）中受到下调节。这些蛋白质起到分子伴侣的作用，从而稳定蛋白质、减少蛋白质的错折叠或有利于蛋白质的再折叠，其中所述的蛋白质在应激事件中已经变性。在植物细胞中，HSP70和HSO90涉及信号传导，从而导致植物防御。推测，在HLB疾病的不同阶段下所观察到的热休克蛋白质的下调节会增加果实中蛋白质的错折叠的过程。

实施例6：与CTV有关的VOC

检验Twister-GC-TOF方法对CTV检测的作用。在该研究中，除了收集健康和CTV样品以外，我们还收集使用2种被称为“CTV”和“stubborn”的疾病感染的另一种类的样品。总之，我们得到12中CTV样品、10种健康样品以及11种CTV+stubborn样品。

对单变量和多变量数据分析而言，Twister数据组生成了峰表。总之，分析33种样品，并在穿越整个样品组中检测383个普通的峰；125个BVOC代谢物被识别，而其余的263个未识别。然后，将数据经历主要成分分析（PCA）以及最小二乘法判别分析(PLS-DA)以用于分类和确认。

我们发现，3个种类的样品共用了383个峰（其中的120个被识别）。首先，我们对所有的383个峰使用Student t检验，从而具有它们的p值以用于CTV和健康之间的比较。通过建立p值阈值为<0.1，保留41个峰用于分析。图18基于41种所选的化学品示出了CTV和健康之间的分离。使用留一法证实策略，PLSR产生的分类精确率为86.36%（CTV为10/12，对照为9/10）。

图18为仅为CTV与健康的PCA得分图。可以观察到健康和感染的CTV之间的分离，并且除了一些可能的异常值以外，可以广泛地分为2类。然后将所指导的分析用于数据组，并使用留一法证实（L-O-O）方法评估模型的精确率。使用4种PLS成分，得到的精确率为96.36%。使用加载图和单变量分析，可以监测到VOC有助于健康和CTV之间的分离。

然后，我们将CTV和CTV+stubborn结合为整个一组，并使用Studentt检验得到p值，从而用于健康以及组合组之间的比较。此外，使用<0.1作为阈值，保留31个峰用于分析。图19示出了基于31个峰的健康与组合组之间的分离。使用留一法证实策略，PLSR产生的分类精确率为84.85%（组合组为18/23，对照为10/10）。这表明即使一些感染CTV的树感染了另一种疾病，仍能良好地检测CTV感染的树。

在2个可分离的峰组中呈现18个峰（一组为“健康与CTV”，另一组为“健康与CTV相关的”），这样我们可以假定它们应该与CTV具有更稳定的关系。3种所选的化学品为月桂烯、蒈烯(δ-3-)、以及罗勒烯(e-β-)（图20）。基于28个峰，使用留一法证实策略，对“纯的”CTV样品的检测的精确率增加至90.91%（CTV为10/12，对照为10/10）。

总之，用于各组比较的高的诊断精确率证明Twister-GC-TOF方法对CTV感染和CTV相关的生物标志物检测的作用。

实施例7：由巴伦西亚橘和华盛顿脐橙得到的VOC的比较

材料和方法

如图22所示，使用连接的分析设备分析由柑橘树叶样品所排放的VOC概况。Varian Saturn4000系列气相色谱电离离子阱质谱(GC/EI-ITMS)(Varian;Walnut Creek,CA)修改为与位于同一CG温箱中的2个相同的CG柱(VF-5ms,Varian)相连的前方的2个注射口。由2个复制的SPME纤维上得到的化学品同时解吸附到2个注射口中，并且解吸附的样品VOC经历相同的GC温箱温度概况，然后使用2个传感器垂直检测。使用离子阱质谱分析由1个柱上得到的洗脱化合物（左侧），同时将另一个柱的输出收集到DMS（右侧）中。MS测量允许在特定的停留时间下获得片段离子物质的荷质比(m/z)，其中所述的停留时间对于特定的化学品而言是独特的。通过将这些m/z痕量与标准NIST08及Wiley09数据库相比，我们可以通过MS匹配识别VOC样品中存在的特定化学化合物。同样，差示迁移分光计测量了正离子和氟离子物质的丰度，其记录为扫描补偿电压（sweepingcompensation voltage）的函数。

A.用于试验的柑橘样品

萎缩柑橘树的华盛顿脐橙以及巴伦西亚橘变种（Four Winds Growers,Inc.;Winters,CA）购买得到，其被嫁接到相同的根茎上，并在试验室条件下，在人工白光和受控的温度（21±2℃）下生长并储存。为了测量叶的挥发物概况，我们研发了捕获这些化合物的方法。在高于根茎嫁接上由树上分离单片叶，使用蒸馏水（DI）漂洗，染色后干燥，并立即放置在10mL硼硅酸盐玻璃顶空取样瓶，并使用Teflon隔膜覆盖（Supelco;Walnut Creek,CA）。洗涤叶，从而除去覆盖在叶上的任何杀虫剂：任何杀虫剂的存在均会导致GC/ITMS和GC/DMS光谱的显著差异。由各品种共收集得到的17种叶样品用于分析（每个品种2棵树）。

将样品放置在温度受控的铝盘中，并保持在45℃，从而平衡由叶散发至顶空中的挥发性化合物。使用85μm聚丙烯酸酯涂敷固相微萃取(SPME,Supelco;Walnut Creek,CA)纤维用于收集挥发物。将纤维插入顶空中，并暴露1小时。成对取样，并允许同时进行GC/MS和GC/DMS分析。在每次使用之前，加热PSME纤维，并限定在恒定流速的氦气下在250℃条件下达90分钟，从而除去被吸附在聚合物上的任何残余的不相关的化合物。

B.气相色谱质谱（GC/MS）

为了分析被吸附在SPME纤维上的化学化合物，将它们在250℃下在GC注射口处解吸附达7.5分钟。使用Varian Saturn4000series GC/ITMS实施色谱分析，其中所述的Varian Saturn4000series GC/ITMS全套装配有Combipal3000自动化取样处理系统，并使用2个30m x0.25mm x0.25μm相柱(VF-5ms,Varian)（其固定相为组成为5%苯基、95%二甲基的聚硅氧烷）。将其中的1个柱与离子阱质谱仪(Varian;Walnut Creek,CA)相连，而另一个相同的柱与差示迁移分光计(SVAC-1;Sionex;Bedford,MA)相连。GC温箱被低温骤冷(cryochill)至5℃，以帮助在色谱分离之前将初始解吸附的挥发物集中在柱头上。在流动速率1mL/min的氦气下，运行2个分析柱(Airgas,Inc.;Woodland,CA)。GC概况如下设定：初始温度设定为5℃并保持15分钟；以1℃/min梯度升高至75℃并保持15分钟；以1℃/min的梯度升高至100℃并保持15分钟；以5℃/min的梯度升高至125℃并保持5分钟；以5℃/min的梯度升高至140℃。使用无分流注射将注射口保持在250摄氏度，以确保所有化合物完全转移至分析柱中。

使用离子阱质谱记录气相色谱以生产总离子分析图（TIC）。传输线和离子阱歧管分别保持在180℃和270℃下。使用电子源(70eV)使分析物分子形成片段。MS扫描范围设定至记录为35-400Th范围。通过使用质谱检索V2.0软件将离子碎片图谱与使用了NIST08和Wiley09质谱文库的质谱数据库而试验性地识别洗脱的化学化合物。

C.气相色谱差示迁移光谱(GC/DMS)

在该研究中使用的差示迁移光谱（DMS）单元中，当离子经过密封的反射性63Ni源、并在反应性离子载气物质（其也是在该过程中生成的）之间间接通过电荷转移时，由气体分子生成离子。然后，离子通过具有所施加的零均不对称无线电频率电压脉冲的电极，其中所述的脉冲具有短的强正脉冲以及长的弱负脉冲。在弱和高的视野条件下，离子流动性的非线性使得离子彼此之间分离，并产生2种试验记录：1个记录为针对正电荷离子物质，而另一个为针对负电荷离子物质。通过施加补偿电压，允许所选的离子通过，并登记它们的离子电流。信号振幅反应了样品中化学品的丰度。在该研究中，我们使用了1100V的RF、-43V至15V的补偿电压扫描，并且使用流动速率为250mL/min的5级超纯氮载气。

GC/MS数据分析

分析由各种柑橘品种得到的17种样品。选择最可重复的色谱来形成用于多变量分析的平衡色谱组。总之，使用10个SPME GC/ITMS光谱，每个品种5个。基于光谱的总点积值来进行选择，值越低，结果越可重复。（参见图30和31）。使用样品11,13,14,15,16（得自2种品种）。在初步研究中，我们观察到与叶的表面积成比例的VOC丰度的变化，其依次随着叶组织的大小而变化。SPME CG/ITMS的视觉检查表明分别在49-86min和119-149min下存在2种主要的峰的突出聚类，并且在2个各自的聚类内的洗脱峰显示高度保守的停留时间以及MS碎片概况（图23和表16）。在图24中，针对华盛顿脐橙和巴伦西亚橘，我们展示3种GC概况；如可以见的那样，VOC概况彼此高度相似。显而易见的是，在由2种品种生产的VOC之间存在高度的重叠。通过人工检查以及注释创建由2种品种得到的位于TIC光谱内的所有主要峰的峰表，并且记下停留时间和碎片图案，并使用MS检索V2.0针对NIST08/Wiley09质谱数据进行试验性的匹配（参见表16）。将41VOC峰定位；通过峰高对VOC丰度定量；然后将随后的峰表进行多变量分析（PCA）。为了防止与混合因素（例如叶影响分类的叶的大小）的任何可能的偏差，对各样品，将所选的峰高对所有所选峰的总丰度（总峰高）归一化。然后，使用Student t检验而检测到统计显著差异的峰。然后，使用PCA检测基于不同的峰的2种品种的分离（图26）。

GC/DMS数据分析

GC/DMS数据由正离子光谱和负离子光谱构成，各光谱显示离子丰度为停留时间和补偿电压的函数。为了检验2种品种的GC/DMS信号的分离，我们使用了Student t检验来检测可辨的像素，该像素具有区别2种品种的潜力。为了进一步检验所选的数据点的特征，分别使用PCA和主成分回归（PCR）来视觉呈现基于这些数据点的品种的差异，并定量研究所选像素的可分离性。

结果和讨论

考虑到已知植物会散发大量的挥发性化合物，并不惊奇的是我们能够通过GC/MS和GC/DMS检测大量的排放的VOC。色谱峰分析显示大量的低丰度化合物、以及较高丰度的更普遍的化学品物质（图23）。如我们所预计的那样，我们观察到在华盛顿脐橙和巴伦西亚橘品种之间存在许多大丰度的化学品的重叠，表明2种品种可能具有会导致生产这些排放的VOC的极相似的生物化学过程。

总之，在华盛顿脐橙和巴伦西亚品种中，通过人工检查由GC概况识别41种主要的VOC（表16）。然后，使用(p<0.05)阈值，对归一化的峰使用Student t检验。发现在2种品种之间具有显著差异的4种VOC以及可能的化学品匹配列于表17中。图25中示出了这4个明显的VOC峰的归一化丰度（Y轴），其示出了2种品种的VOC丰度的差异。此外，还基于4种可潜在区别的VOC进行随后的PCA分析（图26）。由PC1和PC2捕获的总变化率分别为93.62%和6.06%，因此表明数据组中的大部分的变化率是通过PC1捕获的，并且一些较少的贡献得自PC2。基于由我们的原始的Student t检验得到的4种重要的VOC，2组之间的分离是显而易见的。

表15为在2种品种中突出的、41种主要的VOC的峰识别表，显示了停留时间。给定峰的ID、质谱概况以及NIST05内的可能匹配：正向和反向匹配得分如所示。

表16.发现在华盛顿脐橙和巴伦西亚橘之间具有显著差异的GC峰的可能化学品匹配。

植物VOC的生产响应于环境条件的改变而变化，并在一天的某个小时达到最大，其中在所述的时间时，条件（温度、光强度）达到植物进行光合作用和VOC生产的代谢最佳条件(Casado et al.2008)。通过增多对活叶的取样以及在一整天中的多次取样，获得与在自然的白天和夜晚循环下的VOC生产有关的更完整的模型，而非仅仅是在一段时间内的快照。这可以解释在该研究中由柑橘排放的挥发性化学品中所观察到的一些变化，并且对利用用于非侵入性快速疾病诊断的合适的VOC概况还具有较大的含义(Cevallos-Cevallos et al.2009;Rouseff et al.2008;Zhang and Hartung2005)。

如之前提及的那样，我们使用GC/DMS和GC/ITMS来概括由2种柑橘品种排放的VOC识别标志。具有前方2个注射口（其与所包含的相同的分析柱相连）的设备的优点之一在于其允许与平行检测系统一起运行的VOC样品进行同时分析（图22）。这种双重系统允许我们建立用于GC/DMS的化学化学品识别标志的文库，其中所述的GC/DMS可以与GC/ITMS数据关联，表明可以确定2个数据组中峰的化学化学品的识别。制备2份柑橘叶样品，并使用2份经条件处理的SPME纤维对叶上方的小瓶顶空进行取样（每瓶1份SPME纤维），并且如在试验部分中所述，分别在GC/ITMS和GC/DMS上分析这些样品。GC/ITMS色谱上的单个的峰与DMS的输出光谱相关（图27）。在该实施例中，使用标记为#1-2的2个区域显示DMS光谱，就此而言，比对的GC/ITMS质谱用于识别经检测的VOC。发现化学品匹配为通常在以下植物物种中观察到的化合物：香桧烯、蒈烯、萜品醇和可巴烯。该图从概念上显示其如何可以由识别GC/ITMS信号区域中的峰移至GC/DMS区域中的匹配相当的峰。此类匹配允许我们建立用于DMS传感器的化学品文库数据库。此外，这意味着其可以定位GC/DMS信号空间中的重要的VOC代谢物生物标志物，其中所述的生物标志物不存在于GC/ITMS数据中，或者存在于其数据中，这是由于对2种检测器的某些化学品的敏感性不同。

用于检验2种品种的GC/DMS信号之间的分类的直观方法为在穿越整个光谱图中比较它们的平均信号强度（图28）。在这种情况下，我们示出了在穿越2个品种的正电子光谱和负电子光谱的所有点的平均信号强度（左侧面板：对于华盛顿脐橙而言，n=13；对巴伦西亚橘而言，n=14），以及在2中品种数据组之间的信号减除差异（右侧面板）。正离子光谱和负离子光谱显示在华盛顿脐橙和巴伦西亚橘样品之间存在差异的光谱内的点，从而表明可以存在分离GC/DMS生物标志物中针对不同的品种的组中生成的VOC概况的一些基础。在这种情况下，如果光谱内的点对信号品种数据组而言是高度变化的，则平均光谱往往降低这些点的重要性。在减后图像中，仅仅可重复的系统性的点差是显著的，并且我们发现在数据组中存在这些点的多个区域：多于在传统的MS数据组中发现的点的区域。

我们使用Student t检验来检测GC/DMS信号空间中品种之间的潜在可区分的特征（像素）(p<0.005)，并在正信号中检测到958个像素，在负信号中检测到1194个像素，这在2个品种组之间存在统计学差异。然后，我们使用主成分分析（PCA）来检验这些像素是否包含分离2个品种的足够的信息（图29）。我们发现在正离子光谱信号空间（图29A）及负离子光谱信号空间（图29B）中良好分组的2个品种。当2个信号空间在PCA中联系在一起并同时使用时，我们发现分离2个组的区分功率大致相等（图29C）。

然后，使用主成分回归定量研究这些所选像素的可分离性。相似地，“留一法”（LOO）策略用于该任务(Wold et al.2001)。分类结果为：基于正光谱，为96%（PC值=7）；基于负光谱，为100%（PC值=3）；以及基于正的和负的完整数据，为100%（PC值=3）。

我们的研究显示，尽管可以测量柑橘品种组之间的VOC差异，但是这些差异是相对微小的。在现场测量过程中，我们预计存在可能掩饰所关注的化学化学品的VOC的显著背景来源；因此柑橘生物标志物的生物化学VOC是重要的。我们发现GC/DMS在监测多种柑橘挥发物中比单独的GC/ITMS更有效，并且该传感器可以为在农业群落中研发用于场内VOC监测的备选平台。同时，所有这些结果对于研发用于场内诊断目的的流动VOC监测平台而言具有很强的含义，特别令人感兴趣的是，其用于监测柑橘农作物中载体传播疾病的传播。植物VOC将随着叶和植物的年龄、温度、季节、应激条件、以及其他生理和环境因素而改变。在疾病引起的应激过程中植物应答的分析将提供用于设计早期疾病检测的重要线索，从而避免疾病的传播。基于VOC的生物标志物令人欣然接受地不用于最先进的、但是缓慢的目前用于跟踪柑橘疾病的生物化学检验(Irey et al.2006;Liet al.2009;Li et al.2008;Teixeira et al.2005a;Teixeira et al.2005b;Wang etal.2006)。例如，在柑橘树中，进行破坏的黄龙病的传统的诊断方法依赖于症状的外观以及使用实时聚合酶链式反应技术的现场的病原体检验，由于有机体并未均匀地分布在所感染的树的组织中并由此容易遗漏，所以所述的诊断方法是成问题的(Tatineni et al.2008)。在病原体通过商业化的果园进行最初的传播时，所述的疾病是无症状的，并且与极低的效价有关，其使用许多当前的PCR方法是不可检测的(Teixeira et al.2008)。疾病特异性的VOC生物标志物变化可以在植物出现症状之前，从而允许潜在的无症状的检测。在今后的研究中，一个重要的主题在于连续表征与柑橘疾病相关的VOC，其以在这些物种中所观察到的正常背景VOC的变化存在。在这些情况下，挥发性生物标志物可以指向植物组织中特异的生物化学途径，其中所述的组织随着植物感染的进程而改变，这允许我们识别假定的生物化学目标，从而减慢或阻止在这些极重要的商品农作物中的疾病的传播。甚至更重要的是VOC的模糊的化学识别，其中所述的VOC以低丰度存在。此外，我们的结果强调了使用不同的传感器模式来研发用于现场疾病诊断的相关VOC文库、以及研发增强我们理解由这些传感器产生的大的数据组的高级算法的需要。

结论

我们研发了用于比较由华盛顿脐橙和巴伦西亚橘植物的叶得到的挥发性有机化合物的表达和变化性的方法。我们发现，与GC/ITMS和GC/DMS检测结合的基于SPME的样品的收集是用于获得化学信息（与柑橘植物的新鲜叶所排放的VOC相关）的快速、简单和可靠的方法。我们进一步证明PCA为检验不同柑橘品种的VOC分布的有前途的方法，以及PCR为定量区分品种的工具。在该工作中获得的结果表明DMS显示出解决额外的低丰度化学化合物的良好潜力（感谢ITMS数据）。可以将TIMS和DMS数据组之间的数据相关联，并识别所检测的VOC。建立VOC识别标志可以有助于研发便携式DMS传感器系统，从而现场检测挥发物并允许对植物的健康和应激应答进行实时的分析。

实施例8：便携式GC/DMS的研发

研发便携式DMS传感器系统，并用于现场取样。图32示出了基于便携式DMS的现场取样过程的典型情况。为了证明新系统的可行性和可靠性，我们将该新的传感器系统用于试验室基准的试验。简言之，我们使用所述的GC/DMS收集并分析了4种植物的每一种植物的10份样品（华盛顿脐橙、月橘、印第安橘以及巴伦西亚橘）。待分析的包含VOC的空气直接取自叶表面，并且各样品仅运行10分钟。图33中的主成分分布显示4种植物类别的清晰的分离，这表明GC/DMS“手提箱”用于基于VOC的柑橘植物疾病检测的可行性。

基于便携式GC/DMS的柑橘疾病生物标志物的检测

我们研究了用于HLB检测的VOC诊断。在现场取样之前，我们完成了初步的研究，包括在UC Davis校园内由温室柑橘的样品收集草案的优化。与Lake Alfred,FL的合作者实施现场测试，以便说明天气和季节性（树的开花期、果实的收获等）的改变。在2010年11月、2010年12月、2011年1月以及2011年2-3月开始出行。这段时间框包括果实的成熟、果实的收获以及开花期。使用基于聚合物的吸附装置（SPME和Twister）以及2个便携式GC/DMS分析单元平行实施样品的收集。到目前为止，使用SPME收集多于100份样品，并使用GC/MS进行分析。针对相同的成对匹配的树记录至少200次单独的GC/DMS运行，其中所述的树用于SPME样品的收集。此外，使用Twister装置取得大约250份样品（2010年12月、2011年2-3月）。对于所有上述试验而言，一个品种（Hamlin）的多棵树被包含在内。取得样品用于HLB感染的以及假定的健康树（由跟踪人员在LakeAlfred FL在CREC设施下选择）。

在Florida比较了2种GC/DMS“手提箱”的工作条件的稳定性之后，我们选择集中于由1个“手提箱”得到的数据。在12月和1月由该“手提箱”收集的样品用于生物标志物检测工作。总之，在这2个月中获得55份健康样品和62份HLB样品。首先，使用作为最广泛使用的区分方法的Student t检验来检验GC/DMS图的各像素的可分离性。图34通过将p值阈值建立为0.1来显示Student t检验的P值图谱。在该图中，褐色的斑点表示潜在的生物标志物的区域，由于它们具有显著的低p值(<0.1)和足够高的信号强度。此外，我们还通过检验一对顶部主成分的加载载体而使用主成分分析来检测潜在的生物标志物。图35示出了其中具有较大的加载系数的区域（顶部5%）。如我们所知，加载系数越大，相应的像素具有的贡献越大。因此，所述的斑点（由淡红色变为褐色）为通过主成分分析确定的潜在的生物标志物区域。明显地，图34和35具有大的所选的斑点的重叠，这表明所选的生物标志物区域的可靠的。为了进一步检验这些所选的潜在的生物标志物的物理含义，我们针对图36中的健康和HLB样品绘制平均光谱。可以容易地看见所选的潜在的生物标志物斑点较好地与平均GC/DMS光谱斑点上的峰区域一致。

然后，我们对由Student t检验所选的潜在的生物标志物位置使用偏最小二乘回归（PLSR）。使用留一法策略，我们得到了71%的分类精确率（PLS值=5）。当我们对12月样品和1月样品使用单独的PLSR时，12月的精确率为80%，1月的精确率>95%。它们高于组合样品组的精确率（即，71%），表明2个取样时间之间的可能的背景变化。

用于无症状疾病检测的DMS传感器系统的现场和温室测试

在现有的180DMS光谱下，收集大量的DMA数据组，这些数据组与由严重感染的、轻微感染的柑橘树以及由健康的对照得到的CIV识别标志（每棵柑橘树进行9次测量）。在排除严重噪声污染的样品以及具有罕见的信号迁移的样品之后，我们具有13份CTV样品、15份轻微的CTV样品、以及34份健康的样品。首先，使用PCA来检测健康和CTV之间的分离。由图37清楚的是最初的二主成分已经可以在2个组之间产生良好的分离。此外，在由不同的2天收集得到的健康样品之间存在不清楚的分离，其可以表明轻微的环境改变。使用留一法策略，基于PLSR模型的精确率为对于健康情况为33/34，对于HLB情况为13/13。

图8：HLB感染的GC/DMS分析

使用便携式GC/DMS单元收集HLB病原体感染的柑橘树的GC/DMS数据。在对样品进行筛选后，我们对健康的树保留55次运行，对HLB感染的树保留62次运行，其中所述的树得自使用GC/DMS收集的整个样品组。

对各像素，我们使用Student t检验来检测HLB和健康之间的可分离性。我们绘制了p值图谱。p值(<0.1)的像素为均匀的“红色”，而其他像素为“蓝色”。这些“红色”的像素为潜在的生物标志物。比较健康和HLB的平均光谱图，我们可以进一步证实这些“红色”像素的物理含义(p<0.1)。

使用所选的像素，具有穿越证实策略的PLSR模型产生HLB检测的精确率为71%。

小波变换为数据降维和信号集中提供了有用的工具（特征提取）

使用小波变换，原始的光谱数据可以分解成低频部分和高频部分。低频部分通常相应于显示的信号，可以进一步分解为下一阶。根据我们的经验(Zhao et al.,2009;Felinger and Kare,2004)，我们将原始数据分解为第3阶。在该研究中，在第3阶下的低频系数被用作用于检测分析的原始数据的代表。

小波变换帮助增高精确率并且最初的3分钟信号产生了甚至更高的精确率

对于各样品光谱数据而言，我们分别在整个停留时间范围和最初的3分钟内使用小波变换（图38）。然后，对小波系数使用PLSR，从而定量证实分类的精确率。

使用穿越证实策略，对基于整个时间范围的分类，PLSR产生78%的精确率，而对基于最初3分钟的分类，产生了82%的精确率。这二者均高于基于t检验所选的像素的精确率，并且最初3分钟似乎比整个时间范围具有相当良好或甚至更好的检测结果。

实施例9：CTV感染的GC/DMS分析

使用便携式GC/DMS单元收集用于CTV病原体感染的柑橘树的GC/DMS数据。在筛选由Pauma Valley,CA收集得到的样品之后，我们对健康树保留58次运行，对CTV感染的树保留51次运行。对各样品光谱实施小波分析，并使用PLSR定量证实检测离子精确率。对各样品光谱使用3阶小波变换。使用留一法证实策略，得到检测精确率为97.25%（对健康而言为56/58，对CTV而言为50/51）（图39）。

参考文献

Claims

1.一种诊断柑橘植物黄龙病的方法，该方法包括：

a）获得由所述的柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；

b）测量所述的样品中的一种或多种挥发性化学化合物的数量；其中所述的化合物选自：沉香醇,十三烷(C₁₃H₂₈),戊酮(4-OH-4-Me-2-),二十六烷,十四烯(1-),二十三烷,香叶醛,十四烷,苯乙醛,水杨酸甲酯,cumacrene,石竹烯,十六醇,罗勒烯(e-β-),香叶草基丙酮,二氧化碳,丙烷,2-甲基-戊烷,o-二甲苯,2-乙基-1,4-二甲基-苯,1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯,2,2,3,4-四甲基-戊烷,十五烷(C₁₅H₃₂),己烯乙酸酯,十三醛,vocBB45061,vocBB45212,46541,83748,62469,45491,51824,48023,48272,46850,45071,48807,47176,57101,50888,45074和90562；以及

c）将所述的一种或多种挥发性化学化合物的测定量与所述的一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断所述的柑橘植物中的黄龙病。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的预定值是通过测量由感染黄龙病的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量而确定的。

3.权利要求1所述的方法，其中所述的预定值是通过测量由未感染黄龙病的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量而确定的。

4.权利要求2或3的任意一项所述的方法，其中所述的参照柑橘植物与所述的柑橘植物处于相同的发育阶段。

5.权利要求1所述的方法，其中使用质谱来测量所述的样品中的一种或多种挥发性化学化合物的数量。

6.权利要求1所述的方法，其中使用差示迁移分光光度计来测量所述的样品中的一种或多种挥发性化学化合物的数量。

7.权利要求1-6的任意一项所述的方法，其中所述的柑橘植物为巴伦西亚橘植物。

8.一种诊断柑橘植物的柑橘衰退病毒（CTV）的方法，该方法包括：

a）获得由所述的柑橘植物释放的挥发性化学化合物样品；

b）测量所述的样品中的一种或多种挥发性化学化合物的数量；其中所述的化合物选自：月桂烯,蒈烯(δ-3-),罗勒烯(e-β-),十六醇,柠檬烃,二十四烷,布藜烯(α-)；以及

c）将所述的一种或多种挥发性化学化合物的测定量与所述的一种或多种挥发性化学化合物的预定值比较，从而诊断所述的柑橘植物中的CTV病。

9.权利要求8所述的方法，其中所述的预定值是通过测量由感染CTV的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量而确定的。

10.权利要求8所述的方法，其中所述的预定值是通过测量由未感染CTV的参照柑橘植物所释放的一种或多种挥发性化学化合物的数量而确定的。

11.权利要求9或10的任意一项所述的方法，其中所述的参照柑橘植物与所述的柑橘植物处于相同的发育阶段。

12.权利要求8所述的方法，其中使用质谱来测量所述的样品中的一种或多种挥发性化学化合物的数量。

13.权利要求8所述的方法，其中使用差示迁移分光光度计来测量所述的样品中的一种或多种挥发性化学化合物的数量。

14.一种诊断柑橘植物的黄龙病的方法，该方法包括：

a）获得由柑橘植物产生的核酸分子样品；

b）测量所述的样品中的一种或多种核酸分子的数量，其中所述的核酸分子选自：GH3.1(S22545043)，GH3.4(S44237769)，KA02(S44303609)，水杨酸甲基转移酶(S44277040)，WRKY70(S44288591)，MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824)，HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶环化酶(S22583829)，NN脂质转移蛋白质(LTP)(S44279331)，酸性纤维素酶8(S22606212)，ω-6-FAD(S44244604)酸性纤维素酶(S22606212)，萜烯合成酶1(S44285742)，ERTF2(S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯还原酶(S34125138)，脂氧化酶2(S34124539)，NNLTP(NCBI编号:EY754661.1)，β-淀粉酶(S44303510)，棒曲霉素3(S22533016)，葡萄糖-磷酸-运送蛋白2(S22591828,S22591828,S44257732,S22591828)，ENT-异贝壳杉烯酸羟化酶2(S44251582)，棒曲霉素3(S22533016)，α-淀粉酶(S44224848)，WRKY70(S44225142,S44227900,S44288591)；以及

c）将所述的一种或多种核酸分子的测定量与所述的一种或多种核酸分子的预定值比较，从而诊断所述的柑橘植物中的黄龙病。

15.权利要求14所述的方法，其中所述的核酸分子为mRNA分子。

16.权利要求14所述的方法，其中所述的预定值是通过测量由感染黄龙病的参照柑橘植物所产生的一种或多种核酸分子的数量而确定的。

17.权利要求14所述的方法，其中所述的预定值是通过测量由未感染黄龙病的参照柑橘植物所产生的一种或多种核酸分子的数量而确定的。

18.权利要求16或17的任意一项所述的方法，其中所述的参照柑橘植物与所述的柑橘植物处于相同的发育阶段。