CN103513039A - 一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法 - Google Patents

一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，包括定向肽库的设计、定向肽库的合成构建、目标蛋白的体外表达纯化、定向肽库与目标蛋白的反应、定向肽库的肽段洗脱分离、定向肽库的肽段线性化、线性化肽段的鉴定测序步骤，所述定向肽库由线性肽或环状肽组成。运用该方法可筛选鉴定出各种激酶、抗体、蛋白酶以及任何可能与蛋白质结合的分子的结合肽段的一致序列。

Description

一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法
技术领域
本发明涉及用于研究化合物与蛋白质相互作用的定向肽库以及定向肽库芯片技术，具体涉及到用简并线性或环状肽库来研究单个化合物与蛋白质相互作用的一致序列，以及用高通量的方法系统性地研究各种蛋白质信号基团之间的特异性作用。
背景技术
许多生物学过程通过蛋白质与其他化合物的相互作用来进行，包括酶和底物的结合（比如激酶，蛋白酶，磷酸酶与它们的底物的结合），抗原抗体反应，受体与配体的相互作用，以及蛋白特定结构域的相互作用例如SH2结构域与含有磷酸酪氨酸的靶蛋白的相互作用。分析某种物质结合的特异性，比如酶结合的特异性，通常的方法是鉴定其作结合的一系列自然底物所含有的序列特征，通过比较不同的底物的序列，确定该酶所识别结合的一致序列。例如，蛋白激酶的特异性在于在体内和体外识别的底物磷酸化位点。多种研究表明，底物磷酸化位点附近的氨基酸残基决定了体内蛋白激酶是否能对其进行识别。一旦通过实验证明了某种序列特征，根据此一致序列所设计合成的一系列将每个氨基酸残基逐个突变的肽段进行实验，分析磷酸化反应的Km和Vmax的变化。
然而，用这种经典的方法来鉴定蛋白结合的特异性有严重的局限性。其过程花费的人力物力巨大，假定的结合序列上每一个氨基酸残基都要做突变。而且，如果突变不能覆盖所有其他氨基酸的可能性，理论上则没有达到最优化的实验组合。比如，要确定一个9～12个氨基酸组成的肽段上的激酶活性位点，按传统的尝试将达到大约2010的组合方式，即1.024×1013的可能性。另外，传统的方法往往由于底物的不确定性而无法实施。比如，细胞外的信号激活了多种激酶，造成了多种底物的磷酸化，哪种激酶磷酸化哪种底物很难确定。一个更难解决的难题是在鉴定某种蛋白尤其是酶的底物结合特异性时，它们的体内底物往往是低丰度的，体内的方法往往很难做检测。
寻找特殊蛋白的抑制剂也为临床的应用提供了便利。例如淋巴细胞的激活和人类疾病密切相关，包括移植反应，自身免疫疾病和感染。T细胞的激活需要一些酪氨酸激酶的激活。寻找这些激酶的抑制剂在临床上有极大意义。肽段作为小分子能够作为药物进入细胞并发挥作用，然而目前还没有很好的酪氨酸激酶抑制剂，天然存在的结合底物往往不是最佳的结合底物，如何设计出最佳的结合序列作为药物的应用是难点。
综上，鉴定某个蛋白的相互作用结合特异性序列很有意义，也迫切需要更简便的方法。本发明利用定向的简并线性或环状肽库，来筛选特定蛋白所结合的一致序列。环状肽库是对线性肽库的改进。线性肽库中的肽段由天然的a-氨基酸组成，缺点在于，这种暴露的线性肽段不能很好地模拟相对较大的蛋白的靶结合序列的空间构像。此外，由天然氨基酸构成的线性肽段在体内很容易被蛋白酶所降解。因此，用于鉴定化合物之间结合序列的新型的肽库和改进的方法的研制很有必要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，包括定向肽库的设计、定向肽库的合成构建、目标蛋白的体外细胞表达、定向肽库与目标蛋白的反应、定向肽库的肽段洗脱分离、定向肽库的肽段线性化、线性化肽段的鉴定测序步骤，其特征在于：所述定向肽库由线性肽或环状肽组成，所述线性肽是由(Xaa)n-Zaa-(Xaa)m所示的氨基酸组成的多肽，所述环状肽是由环-((Xaa)n-Zaa-(Xaa)m-R-R′)所示的氨基酸组成的多肽；其中，Xaa代表任何天然或非天然的a-氨基酸，Zaa代表非简并的天然或非天然的a-氨基酸，比如，针对激酶的底物磷酸化位点特异性序列的肽库，其非简并的氨基酸可以是酪氨酸，丝氨酸或者苏氨酸。R-R′是环状肽的连接处，当需要线性化肽段时可将该连接处切开。n和m代表0～10个氨基酸数目。环状肽由线性肽经过肽键环化而成，线性肽库也可以用来进行该技术的操作，但环状肽为优化的方法。
本发明的定向肽库是指由某些位置的氨基酸序列固定的肽段和其他位置具有各种组合的环状肽段形成的库或者是由线性肽段组成的库。肽库的简并性决定了其多样性，比如在只有两个位置简并的肽库中，包含了400个唯一肽段（202），然而，在8个位置简并的库中，大约包括2.5×1010个唯一肽（208）。
本发明的进一步的技术方案，采用BOP/HOBt化学反应偶联法合成可溶性的线性肽或可溶性的环状肽或在固定支持相上直接合成线性肽或环状肽，采用Na-FMOC封闭法保护线性肽或环状肽的氨基酸，环状肽在R-R′处连接成环，在环状肽库的简并位置，加入等量的不同种的已用Na-FMOC封闭的氨基酸于反应体系中。
优选的，所述固定支持相为纤维素膜，使用超精密针头在每张大小为8×12cm的SPOT膜上点样1600个肽段，每个点样的肽段产量约为5nmol。也可将合成的带生物素的多肽库点在芯片上。
优选的，所述肽段合成的长度为5～25个氨基酸，优选7～15个氨基酸长度，9～11个氨基酸的长度为最佳。羧基端加上其他氨基酸修饰可以促进肽的溶解度，例如多聚赖氨酸的尾巴。为了测序的准确性，可在氨基酸末端加上其他氨基酸，例如在N端可加上Met-Ala双肽。根据需要可以进行修饰的改进，例如在筛选肽段作为抑制剂时，可以在肽段上连入穿膜肽，提高肽段的跨膜特性。
本发明的进一步的技术方案，目标蛋白的体外表达纯化的方法是用细菌或真核细胞来表达便于纯化的融合蛋白，以GST为优。用昆虫细胞表达GST-目标融合蛋白，昆虫细胞用裂解液裂解，所述裂解液包括20mM Tris pH8.0，150mMNaCl，10%甘油，2mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟化物PMSF，0.15U/mL抑肽酶，20mM亮肽酶素，1mM二巯基苏糖醇DTT和1%乙基苯基聚乙二醇，随后用谷胱甘肽亲和柱纯化目标蛋白，如GST-SLK1，GST-cyclin B-Cdc2和GST-cyclin A-CDK2，目标是降低激酶和肽的分离难度或者避免蛋白酶不纯的问题。
本发明的进一步的技术方案，就蛋白激酶的底物而言，所述定向肽库与目标蛋白的反应体系为：将纯化的目标蛋白加入300μL含有1mg线性肽或环状肽混合物的溶液中，所需各种因子的浓度为100mM ATP，包含约6×105cpm的[γ-32P]ATP，1mM DTT，10mM MgCl2和50mM pH7.0的Tris，室温孵育10min。
本发明的进一步的技术方案，所述定向肽库的肽段洗脱分离的步骤是：肽段混合物以pH5.5-6.0的高盐溶液（如50mM MES，1M NaCl，pH5.5）上柱子，在这种条件下，磷酸化后的肽段结合金属离子柱，而非磷酸化的肽段直接流过柱子，然后柱子用pH6.0的低盐溶液（如pH6.0的50mM MES）洗去非磷酸化肽段的非特异结合以及多余的盐离子，最后，以pH8.0的洗脱溶液（如500mMNH4CO3，pH8.0）洗脱结合的磷酸化肽段。
如果目标蛋白不是激酶，可将纯化蛋白固定在经磷酸盐缓冲液（PBS溶液）平衡后的琼脂糖珠子上，形成柱子，再与300μL含有1mg的多肽库以亲合作用的方法富集与纯化蛋白结合的多肽。
本发明的进一步的技术方案，所述定向肽库的肽段线性化是由溴化氢打断肽键或由蛋白酶切割。
本发明的进一步的技术方案，所述线性化肽段的鉴定采用Edman降解法或质谱法自动化测序。
测序之后，对于每个简并位置的氨基酸，用下列的公式计算得到相对丰度：
若单个氨基酸相对丰度为1，那么可以认为，这个氨基酸并没有被富集或选择；若在某简并位置，倾向于使用某些氨基酸，则相对丰度>1；若在某简并位置，倾向于不使用某些氨基酸，则相对丰度<1。
定向肽库的设计并不要求库中的每个分子必须达到检测所需要的足够量。在与原混合物比较选择后的分子的特性时，也并不要求单个分子的含量一样。比如，一个肽库可以由8个单位组成，1%在位置1含有缬氨酸，10%在位置1含有甘氨酸，5%在位置1含有谷氨酸，剩余17种氨基酸在该位置的丰度是可变的（但已知含量）。同样的，在位置2，20个氨基酸的丰度是已知的但可以分布不均一的，这个库的简并性达到20的8次方，即2.5×1010。通常1mg的肽库用于实验，208的简并度意味着每种分子含量在1/2.5×1010=3.9×10-17mol，即使某种肽段是以100倍于平均丰度存在，仍然只有目前检测技术能检测到的含量的千分之一。虽然单个分子的含量无法被检测出，Edman降解提供了一种从特定位置定量单个氨基酸的方法。比如经检测，8%的经选择后的肽在氨基末端含有缬氨酸，8%含有甘氨酸，剩余的氨基酸经检测与其在原库混合物中的含量相比基本不变。那么可以说靶分子倾向于结合末端为缬氨酸的氨基酸，因为在这个位置，缬氨酸的相对丰度为8%/1%=8。相反，虽然甘氨酸在选择后的丰度也达到8%，但相对丰度只有8%/10%=0.8，可以说甘氨酸是被选择性的排除在该位置。当位置1的序列特征确定后，再用第二轮Edman降解确定第2个、第3个等等位置的情况。因此，该方法不要求库中的每个肽段达到可以被检测到的含量。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：运用该方法不仅可以检测蛋白质与其他分子之间的相互作用，而且可快速而系统地筛选鉴定出各种激酶、抗体、蛋白酶以及任何可能与蛋白质结合的分子的结合肽段的一致序列。
具体实施方式
运用该方法中的线性肽库技术筛选Zap70的抑制剂。首先设计了酪氨酸定向的简并肽库：Met-Ala-X-X-X-X-Tyr-X-X-X-X-Ala-Lys-Lys-Lys，X代表除了Trp、Cys、Tyr的任何氨基酸。理论简并性178=6.9×109，运用N-a-FMOC封闭保护法进行氨基酸合成，以及BOP/HOBt化学反应偶联。Met-Ala是用于测序时确认肽段存在的添加氨基酸，+5位置Ala的存在可以估计测序中的肽段丢失情况。多聚赖氨酸的存在增加了可溶性。
ZAP70用昆虫病毒表达系统稳定表达于SF9细胞，用谷胱甘肽亲和柱纯化了600μg ZAP70-GST融合蛋白，并固定在亲和柱上，在包含100μM ATP，1mMDTT，5mM EDTA，50mM Tris，pH7.4的溶液环境下，加入450μg的肽库与其在室温孵育10分钟（只有ATP而没有Mg2+离子，防止肽段的磷酸化）。未结合的肽段通过快速洗而去除，结合的肽段通过30%乙酸于室温洗脱10分钟，离心浓缩干燥过夜，H2O溶解，用Applied Biosystems model477A蛋白测序仪测序。
本实验设置了阴性对照，即用GST对照柱结合肽库，测得的每种氨基酸的丰度将扣除阴性对照柱的结合检测量。按照相对丰度RA的公式计算相对丰度。其中，相对丰度RA小于1.5的氨基酸信息被去除。筛选出的RA值大于1.5的氨基酸信息如下：
表1  ZAP70的最佳结合模块
从表1的结果可以看出，ZAP70的最佳结合肽段序列为：Lys-Leu-Ile-Leu-Tyr-Leu-Leu-Leu-Leu，即KLILYLLLL。然而，蛋白酪氨酸激酶的底物周围-2、-3、-4的位置往往倾向Glu，事实上最佳的底物是Glu-Glu-Glu-Glu-Tyr-Phe-Phe-Ile-Ile，两者似乎有点矛盾。
通过激酶反应检测反应动力学（表2），可以发现，最优结合肽段的Km和Vmax值都降低了，尤其是Vmax。Km为速度是最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征性常数。Km值越小，酶与底物的亲和力越大。Km值最小的底物可以认为是酶的最佳反应底物。Vmax指反应最大速度。Km和Vmax值都降低了意味着最优结合肽段结合能力更强，但是反应更慢。当将-4位的Lys突变为Glu时，Km值大大升高，结合能力大大变弱，意味着-4位的Lys对高亲和力的结合是必需的。
表2  Zap70结合肽段的动力学
Figure BDA00003492705800081
为了将最佳结合肽段送至细胞内，融合加入了穿膜肽，形成了RQIKIWFQNRRMKWKK-KLILYLLLL，用CD3的抗体处理Jurkat细胞，淋巴细胞被激活，将ZAP70的已知底物PLCg和LAT做免疫沉淀，用磷酸化的抗体检测，表明该融合肽段特异性地降低了ZAP70底物的磷酸化，达到了抑制激酶的效果。荧光素酶报告基因检测表明该肽段能特异性地抑制IL-2基因启动子的活性，10μM的浓度就能造成70%的抑制效果。该细胞通透性的融合肽段确实能够作为ZAP70的抑制剂来抑制T细胞的激活。
本实施例成功的鉴定出ZAP70的抑制肽段，用以前的设计肽段的方法去寻找最佳底物并不能发现该肽段，因为它的亲和常数虽然很高，但是化学反应很慢。本实施例为筛选其他蛋白激酶的高效特异性抑制剂提供了很好的参照。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，包括定向肽库的设计、定向肽库的合成构建、目标蛋白的体外表达纯化、定向肽库与目标蛋白的反应、定向肽库的肽段洗脱分离、定向肽库的肽段线性化、线性化肽段的鉴定测序步骤，其特征在于：所述定向肽库由线性肽或环状肽组成，所述线性肽是由(Xaa)n-Zaa-(Xaa)m所示的氨基酸组成的多肽，所述环状肽是由环-((Xaa)n-Zaa-(Xaa)m-R-R′)所示的氨基酸组成的多肽；其中，Xaa代表任何天然或非天然的a-氨基酸，Zaa代表非简并的天然或非天然的a-氨基酸，R-R′是环状肽的连接处，n和m代表0～10个氨基酸数目。
2.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：采用BOP/HOBt化学反应偶联法合成可溶性的线性肽或可溶性的环状肽或在固定支持相上直接合成线性肽或环状肽，采用Na-FMOC封闭法保护线性肽或环状肽的氨基酸，环状肽在R-R′处连接成环，在环状肽库的简并位置，加入等量的不同种的已用Na-FMOC封闭的氨基酸于反应体系中。
3.根据权利要求2所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述固定支持相为纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述线性肽或环状肽的肽段长度为5～25个氨基酸。
5.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：目标蛋白的体外表达纯化的步骤为：用昆虫细胞表达GST-目标融合蛋白，昆虫细胞用裂解液裂解，所述裂解液包括20mM Tris pH8.0，150mM NaCl，10%甘油，2mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟化物PMSF，0.15U/mL抑肽酶，20mM亮肽酶素，1mM二巯基苏糖醇DTT和1%乙基苯基聚乙二醇，随后用谷胱甘肽亲和柱纯化目标蛋白。
6.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽库与目标蛋白的反应体系为：将纯化的目标蛋白加入300μL含有1mg线性肽或环状肽混合物的溶液中，所需各种因子的浓度为100mM ATP，包含约6×105cpm的[γ-32P]ATP，1mM DTT，10mM MgCl2和50mM pH7.0的Tris，室温孵育10min。
7.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽库的肽段洗脱分离的步骤是：肽段混合物以pH5.5-6.0的高盐溶液上金属离子柱，然后柱子用pH6.0的低盐溶液洗去非磷酸化肽段的非特异结合以及多余的盐离子，最后，以pH8.0的洗脱溶液洗脱结合的磷酸化肽段。
8.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽库的肽段线性化是由溴化氢打断肽键或由蛋白酶切割。
9.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述线性化肽段的鉴定采用Edman降解法或质谱法自动化测序。
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