CN103509132A

CN103509132A - 一种蜜柚柚皮多糖的分级提取方法及其产物和产物的应用

Info

Publication number: CN103509132A
Application number: CN201310449231.6A
Authority: CN
Inventors: 冯志斌; 陶红; 郭文; 卓浩廉
Original assignee: China Tobacco Guangdong Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Guangdong Industrial Co Ltd
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: CN103509132B

Abstract

本发明一种蜜柚柚皮多糖的分级提取方法及其产物和产物的应用提供一种蜜柚柚皮烟草保润剂制备方法，以蜜柚果皮为材料，采用高速剪切乳化结合复合酶二次破壁方法提取柚皮多糖，有机溶剂变温渗透沉淀制备不同溶剂分级的柚皮多糖，并采用凝胶色谱研究了分级多糖分子量分布差异。不同分级的多糖分子量测定表明：不同溶剂分级的多糖分子量有显著差异，其中a粗多糖的峰①的重均分子量为24100Da，b粗多糖的峰①的重均分子量为11700Da，c粗多糖的峰①的重均分子量为2130Da。表明乙醇浓度越低，沉淀多糖的分子量越大。柚皮多糖的最优保润浓度为1.5g/100Ml,当选择不同溶剂时，柚皮多糖的保润效果有所差别，其中水溶的柚皮多糖的保润性明显高于醇溶的柚皮多糖，总体来说均高于目前使用的保润剂，如丙二醇。

Description

一种蜜柚柚皮多糖的分级提取方法及其产物和产物的应用

技术领域

本发明涉及多糖提取领域，更具体地，涉及一种蜜柚柚皮多糖的提取分级方法及其产物应用。

背景技术

柚子属于芸香科柑橘，是大众化的水果之一，广东梅县柚子是广东省“三高”农业战略龙头产品，目前梅州金柚的栽培已近百年历史，全市总面积40万亩，产量30万吨以上，全省金柚产量高达40万吨，是全国最大的金柚商品生产基地。1995年被国家首批百家中国特产之乡组委会命名为“金柚之乡”。目前全市总面积30万亩，产量30万吨以上，是全国最大的金柚商品生产基地。1995年被国家首批百家中国特产之乡组委会命名为“金柚之乡”。农民种植水果增产不增收，大大挫伤了农民的积极性。李时珍的《本草纲目》中指出：“柚，功能消食，解酒毒，去肠胃中恶气，长发滋燥，疗妊妇不思食口淡”。柚皮占整个柚子的43%～48％，含有多种对人体健康有益的非营养性生理活性成分，如黄酮类化合物、活性多糖、类柠檬苦素、香精油、天然色素、膳食纤维等，这些成分高于柚果实。目前多糖提取方法主要有水浸提法、酸碱提取法、微波提取法等，传统高温提取法工艺周期较长，而且能耗大、效率低；酸碱提取易破坏环多糖的立体结构和活性；微波法省时但效率不高；超声波法虽然效率较高，但噪音较大，仪器价格昂贵。

目前食品行业生产中使用的保润剂主要是多元醇类化合物，如丙二醇、甘油、木糖醇和山梨醇等。这些保润剂均靠其吸湿性而对载体产生保润作用, 其保润效果并不理想。多糖分子中存在大量羟基和羧基等基团，可与水分子形成氢键，并相互交联形成网状结构，起到很好的保水作用。其次多糖具有良好的成膜性能，可在食品表面形成一层均匀的薄膜，减少食品表面的水分蒸发而完成保润作用。柚皮具有抑菌、抗氧化且具有止咳、化痰、理气、抗炎、止痒等功效。

高剪切分散乳化( High shear dispersing emulsifier，HSDE)技术是一种新型纳米、微米和均质化技术。物料在多层转子和定子之间的间隙内高速运动，可形成高切线和高频机械效应，形成较强动能，使物料产生挤压、摩擦、剪切等多种受力，最终使物料充分混合、搅拌、细化达到理想要求。近年来，该技术已成为天然产物有效成分提取中一种重要方法。HSDE 结合复合酶二次破壁技术应用于柚皮多糖的提取未见报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种适合柚皮提取分级的方法。

首先提供一种蜜柚柚皮多糖的分级提取方法，包括以下几步，

S1. 取柚皮，根据柚皮重量，加入纤维素酶0.5-5.0%和果胶酶1.0-3.5%，在45-60℃下，加入水，所述的水和柚皮的重量比为10~35：1，高剪切分散乳化机10000r/min下处理2-20min，酶解1-2.5小时，得酶解液，

S2. 取S1所得的酶解液，加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为45~55%，温度25℃-4℃变温醇析，离心，离心得沉淀物一和上清液一，所得的沉淀物一为a粗多糖，

S3. 取步骤S2所得的上清液一逐步加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为65~75%，25℃-4℃变温醇析，离心，离心得沉淀物二和上清液二，所得的沉淀物二为b粗多糖，

S4. 取步骤S2所得的上清液二加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为85~95%，25℃-4℃变温醇析，离心，离心得沉淀物三和上清液三，所得的沉淀物三为c粗多糖。

优选方案为，所述的纤维素酶用量为1.5%，果胶酶用量为1.5%，所述的酶解时间为120min，水和柚皮的重量比为1:25，酶解的温度为50℃。

所述的蜜柚优选梅州金柚。

更进一步的提供一种蜜柚柚皮a粗多糖，经Waters凝胶渗透色谱分析得，所述的a粗多糖的峰①的重均分子量为24100Da，数均分子量为21300Da，峰位分子量为28540 Da，分子量分布宽度为1.13。

所述的a粗多糖的峰②的重均分子量为2180Da，数均分子量为2060Da，峰位分子量为2650 Da，分子量分布宽度为1.06。

更进一步的提供一种蜜柚柚皮b粗多糖，经Waters凝胶渗透色谱分析得，所述的b粗多糖的峰①的重均分子量为11700Da，数均分子量为11200Da，峰位分子量为13540Da，分子量分布宽度为1.04。

所述的b粗多糖的峰②的重均分子量为1920Da，数均分子量为2030Da，峰位分子量为2390 Da，分子量分布宽度为1.05。

更进一步的提供一种蜜柚柚皮c粗多糖，其特征在于，经Waters凝胶渗透色谱分析得，所述的c粗多糖的峰①的重均分子量为2130Da，数均分子量为1890Da，峰位分子量为2540Da，分子量分布宽度为1.12。

上述的制备方法获得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在保润方面的应用。

上述的制备方法获得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在烟草保润方面的应用。具体的应用方法为，将a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖的水溶液喷加于烟草表面。

本发明的优点如下：

本发明利用岭南特色水果柚子皮止咳、化痰、理气、抗炎等功能特性，着重研究柚皮多糖的提取工艺和不同溶剂分级多糖的分子量差异，以期探索出一种高效的柚子多糖提取工艺，诠释不同分子量多糖功效机理，为食品添加剂开发和药品原料开发奠定理论基础，此研究也是大力发展水果加工，保持农村经济的持续健康发展、促进农民收入增加的主要措施之一。

乙醇通过降低多糖水溶液的介电常数，增加溶质分子的静电作用力，多糖发生聚合析出，另外乙醇减少多糖与水的作用，使多糖脱水而相互聚集沉淀。由表2可知，一定浓度的乙醇对应沉淀一定量的多糖，采用高速剪切乳化结合复合酶二次破壁方法提取，不同浓度有机溶剂变温渗透沉淀制备多糖，不同级份多糖含量有差异，柚皮多糖提取率为10.39g/100g，其a粗多糖中的多糖为5.6 g/100g柚粉，b粗多糖中的多糖为1.9 g/100g柚粉，c粗多糖中的多糖为1.8 g/100g柚粉。然而现有技术采用水提醇沉淀法提取了柚皮多糖，纯化后其平均收率为6.92%；采用石油醚回流脱脂，热水提取沙田柚柚皮多糖的方法，测得柚皮水溶性多糖含量是7.28%。

本发明的提供的a、b和c粗多糖在烟草保润上有很好的功用，保润的效果好。

附图说明

图1为液料比对酶法提取柚皮多糖得率的影响。

图2为酶用量对酶法提取柚皮多糖得率的影响。

图3为酶解时间对复合酶提取柚皮多糖得率的影响。

图4为酶解温度对复合酶提取柚皮多糖得率的影响。

图5为a粗多糖分子量色谱图。

图6为b粗多糖分子量色谱图。

图7为c粗多糖分子量色谱图。

图8为不同分级的柚皮多糖在醇溶条件下自身水分散失率变化。

图9为不同分级的柚皮多糖在水溶条件下自身水分散失率变化。

图10为不同浓度的柚皮多糖对载体烟叶保润性的影响。

图11为不同溶剂对柚皮a粗多糖保润性的影响。

图12为不同溶剂对柚皮b粗多糖保润性的影响。

图13为不同溶剂对柚皮c粗多糖保润性的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1

S1. 取柚皮，根据柚皮重量，加入纤维素酶1.5%和果胶酶1.5%，在50℃下，加入水，所述的水和柚皮的重量比为25：1，高剪切分散乳化机10000r/min下处理10min，酶解1.5小时，得酶解液，取一部分酶解液，浸提，得到多糖含量为9.49%

S2. 取S1所得的酶解液，加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为45~55%，温度25℃-4℃变温醇析，离心，离心得沉淀物一和上清液一，所得的沉淀物一为a粗多糖的得率为13.12%，a粗多糖中多糖的纯度为42.2%，纯化后a多糖得率为5.6%，

S3. 取步骤S2所得的上清液一加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为65~75%，温度25℃-4℃变温醇析，离心，离心得沉淀物二和上清液二，所得的沉淀物二为b粗多糖的得率为4.38%，b粗多糖中多糖的纯度为42.8%，纯化后b多糖得率为1.9%，

S4. 取步骤S2所得的上清液二加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为85~95%，温度25℃-4℃变温醇析，离心，离心得沉淀物三和上清液三，所得的沉淀物三为c粗多糖的得率为3.20%，c粗多糖中多糖的纯度为56.2%，纯化后c多糖得率为1.8%。

实施例2 料液比、酶量、酶解时间和酶解温度对提取的影响。

一、材料

蜜柚采自梅州柚子园，选择同品种、大小、果色均匀、成熟度基本一致，无机械损伤、无病虫侵染等蜜柚作为试验材料。将果皮切成薄片后在恒温干燥箱进行烘干，粉碎机将其磨成粉末备用。试剂为分析纯葡萄糖，无水乙醇，丙二醇，5%苯酚，浓硫酸，去离子水，氯仿，正丁醇，活性炭等均购于广州一马生物科技有限公司。果胶酶：天津酶制剂厂；纤维素酶：上海伯奥生物科技有限公司。

二、仪器

DU-730型紫外可见分光光度计（日本岛津分析仪器厂）；恒温水浴锅（广东环凯微生物科技有限公司）；电热恒温培养箱（上海索谱仪器有限公司）；旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂）；凝胶渗透色谱（美国Waters公司）；

三、实验方法

（1）复合酶提取制备柚皮多糖条件优化

①液料比对多糖得率的影响

准确称量30g 柚粉，纤维素酶和果胶酶的酶均在添加量1%、温度45℃、pH6.5，液料比分别按 10:1、15: 1、25: 1、30: 1、35: 1处理，高剪切分散乳化机10000r/min下处理10min混匀，恒温酶解，反应结束后，将其置于100℃水浴中10min使酶灭活，冷却至室温，离心，在上清液中加入无水乙醇至最终浓度为80%，4℃静置过夜，置于4000r/min离心机中离心20min，收集沉淀。测定沉淀物多糖含量及计算得率。

② 酶解时间对多糖得率的影响

准确称量30g 柚粉，纤维素酶和果胶酶的酶均在添加量1%、温度45℃、pH6.5，酶解时间分别按30、 60、90、120、150、180m i n 处理，同上。

③酶解温度对多糖得率的影响

纤维素酶和果胶酶的酶均在添加量1%，液料比、酶解时间和PH按照确定的最佳值，酶解温度分别按 40、45、50、55、60、65℃处理，同上。

④酶添加量对多糖得率的影响

酶解时间、液料比、酶解温度和PH按照确定的最佳值，酶添加量分别按 0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%处理，同上。

⑤ 复合酶法正交试验

根据单因素试验结果，用正交试验对影响提取的因素：酶解时间、复合酶添加量、液料比及酶解温度进行条件优化。

（2）柚皮多糖的提取分级制备

有机溶剂沉淀分级法---------------参照史军花等方法

按照优化工艺条件提取多糖，在200mL的柚皮提取浓缩液中，加入无水乙醇400mL和去离子水200mL，配制成乙醇浓度为50%的混合液。将混合液于温度25℃-4℃变温醇析。将醇析后的混合液，在4000 r/min离心机下，进行沉淀分离，用烧杯分别收集沉淀物和柚皮澄清液，沉淀物即50%的乙醇沉淀的柚皮粗多糖，编号为a粗多糖。如上述方法，分别采用70%、90%的乙醇继续醇沉柚皮澄清液，分别得到b粗多糖、c粗多糖。将a粗多糖、b粗多糖、c粗多糖冷冻干燥备用。

3.多糖含糖量的测定采用苯酚-硫酸法^[8]

多糖得率(%) = [多糖质量(g) / 原料质量(g)]×l00%

4.多糖分子量测定采用Waters凝胶渗透色谱(。

（3）结果与分析

1、液料比对酶法提取柚皮多糖得率的影响

不同的液料比会影响到提取溶剂对活性物质的溶解情况。复合酶提取料液比对多糖得率的影响如图1所示。由图1可知，多糖得率随液料比的增加而逐渐升高，20:1时达到最大，之后继续增大液料比，多糖得率平缓到30:1，随后下降。有这样的趋势可能是因为液料比过低，活性物质不能充分溶解，影响到提取率。随着液料比的过多增加，稀释了体系使酶浓度降低，酶与底物的结合不充分，多糖得率下降。考虑到成本，选择15:1~25:1为柚皮多糖提取的最适液料比。

2、复合酶量对酶法提取柚皮多糖得率的影响

每种酶在反应体系中的加入量对多糖的得率有很大影响，酶用量对多糖得率的影响见图2。由图2可见，随着酶用量的增加，酶与底物接触机会增加，多糖得率随之升高。当酶量大于1.5%时，多糖得率下降，原因可能是酶的种类不同，活性中心结构不同，空间结构不同，由于当酶浓度升高到一定程度，酶分子过于饱和，一部分没有机会与底物结合，酶解速度降低，因此，酶用量范围果胶酶和纤维素酶为1~2%较理想。

3、酶解时间对酶法提取柚皮多糖得率的影响

浸提时间影响到溶剂与不同细胞位置活性物质的接触，并将其溶解提取出来。浸提时间越长，溶剂能够充分渗透到柚皮细胞组织的各个部位，与活性物质充分接触溶解，从而提高产率。由图3可知，当酶解时间为90min时，多糖的提取率最大，超过120min，多糖提取率反而下降。因此，选择60-120min为柚皮多糖提取的最适酶解时间。

4、酶解温度对酶法提取柚皮多糖得率的影响

酶解温度对复合酶提取柚皮多糖得率的影响如图4所示，由图4可知，随着温度的升高多糖提取率也升高，两种酶最适温度不同，果胶酶 50℃~55℃、纤维素酶45℃时得率达至最大，因为随着温度升高，分子运动速度加快，渗透、扩散、溶解速度加快，同时，高温可以引起细胞膜结构的变化，弱化或破坏了细胞壁的完整性，使多糖易于从柚皮的外层细胞转移到溶剂中。继续升高温度，酶蛋白开始变性，酶活力减弱直至完全丧失，反应速度亦逐渐降低，多糖得率随之下降。综合考虑, 选择45-50℃最适酶解温度。

5、正交试验优化复合酶提取柚皮多糖工艺

正交试验结果由表1可知，影响柚皮多糖得率的各因素主次次序为由表 1可知：按极差的大小顺序是 B＞C＞A＞D，B为主要因素，C 次之，A 再次之，D 是次要因素。由极差分析各因素的最佳试验组合为A₂B₃C₃D₂，实际组合为A₁B₂C₂D_2，浸提得率为9.49%。，通过验证，确定最佳组合为A₂B₃C₃D₂，即酶用量1. 5%、酶解时间120 min、料液比1∶25、酶解温度50℃，浸提得率为10.39%。

表1 正交试验结果

试验号	A酶用量(%)	B酶解时间(min)	C料液比(g/mL)	D酶解温度(℃)	多糖提取率(%)
						1	1	60	15	45	5.64
2	1	90	20	50	9.49
						3	1	120	25	55	8.3
4	1.5	60	20	55	7.45
						5	1.5	90	25	45	9.25
6	1.5	120	15	50	8.9
						7	2	60	25	50	8.2
8	2	90	15	55	7.24
						9	2	120	20	40	9.0
K₁	7.420	7.097	7.260	7.963
						K₂	8.533	8.270	8.258	8.473
K₃	8.147	8.733	8.585	7.667
						R	1.113	1.636	1.323	0.810

6、不同分级的柚皮粗多糖含量的变化

乙醇通过降低多糖水溶液的介电常数，增加溶质分子的静电作用力，多糖发生聚合析出，另外乙醇减少多糖与水的作用，使多糖脱水而相互聚集沉淀。由表2可知，一定浓度的乙醇对应沉淀一定量的多糖，采用复合酶提取，不同浓度的乙醇分级后，不同级份多糖含量有差异，各为a粗多糖为5.6 g/100g柚粉，b粗多糖为1.9 g/100g柚粉，c粗多糖为1.8 g/100g柚粉。其中不同分级的柚皮粗多糖纯度也不同，a粗多糖纯度和b粗多糖纯度没有显著差异，分别为42.2%、42.8%；c粗多糖纯度为56.2%。孔梦晓等人则采用水提醇沉淀法提取了柚皮多糖，纯化后其平均收率为6.92%，刘国聪等人则采用石油醚回流脱脂，热水提取沙田柚柚皮多糖的方法，测得柚皮水溶性多糖含量是7.28%。他们测定的结果与本次试验的结果存在差异，其原因可能是①柚皮的品种、成分含量等不同，其含糖量会有所差异。

表2 不同分级的柚皮粗多糖含量的变化

Figure 2013104492316100002DEST_PATH_IMAGE001

标注：a粗多糖（50%乙醇分级）；b粗多糖（70%乙醇分级）；c粗多糖（90%乙醇分级）

7、不同分级的柚皮多糖分子量差异

7.1 a粗多糖分子量变化

从色谱图5和表3可以看出，a粗多糖淋洗时间在9~15min, 出现两个谱峰。说明有两部分多糖。利用随机的Breeze软件计算得：a粗多糖的峰①的重均分子量Mw为24100Da，数均分子量Mn为21300Da，峰位分子量Mp28540 Da，分子量分布宽度（Mw/Mn）为1.13；a粗多糖的峰②的分子量很小，是峰①的大约10倍左右，峰②重均分子量Mw为2180Da，数均分子量Mn为2060Da，峰位分子量Mp2650 Da，分子量分布宽度（Mw/Mn）为1.06。说明50%乙醇沉淀多糖主要是大分子量多糖。分子量分布宽度的数值比1越大，其分子量分布越宽，多分散性程度越大。

7.2 b粗多糖分子量变化

从色谱图6和表3得知，b粗多糖淋洗时间在11～15min,出现两个谱峰，说明有两部分多糖。利用随机的Breeze软件计算得：b粗多糖的峰②的分子量很小，是峰①的大约1/10倍左右，分子量分别为重均分子量Mw为1920Da，数均分子量Mn为2030Da，峰位分子量Mp2390 Da，分子量分布宽度（Mw/Mn）为1.05.。b粗多糖的峰①的重均分子量Mw为11700Da，数均分子量Mn为11200Da，峰位分子量Mp13540 Da，分子量分布宽度（Mw/Mn）为1.04。

7.3 c粗多糖分子量变化

从色谱图7和表3得知，c粗多糖在色谱柱上出现一个谱峰，说明有一部分多糖。淋洗时间在13～15min，利用随机的Breeze软件计算得：c粗多糖的峰①的重均分子量Mw为2130Da，数均分子量Mn为1890Da，峰位分子量Mp2540 Da，分子量分布宽度（Mw/Mn）为1.12。

不同分级的柚皮多糖分子量表征如图5-7，由图可以看出，不同溶剂分级的柚皮多糖经过凝胶渗透色谱柱淋洗时间不同，粗多糖(a)淋洗时间最低为9min, 最高在15min。淋洗时间长短表明这三种粗多糖分子量有一定的差异，当其流经凝胶色谱柱较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。

不同分级的多糖分子量呈现趋势为c粗多糖的分子量最小，a粗多糖分子量最大，且在粗多糖a，b中出现了和c一个级的分子量，可能是因为不同分子量多糖的沉淀不仅与乙醇浓度有关，还与乙醇加入的顺序有关。如先加乙醇后加料分子量较大，先加料后加乙醇则分子量较小。

表3粗多糖(a、b、c)凝胶色谱表征

Figure 2013104492316100002DEST_PATH_IMAGE002

本实验采用先加料后加乙醇的方法，随着乙醇的加入，多糖分子表面出现乙醇浓度差，当沉淀大分子多糖时，则有小分子多糖混在大分子多糖里。

由于植物多糖的来源广泛，不同种的植物多糖的结构，分子构成及分子量各不相同，生物活性也不同。在提取多糖过程中，利用适量的酶可提高提取率，加速多糖的释放。同时，使用酶法可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，有利于多糖的纯化。本文采用复合酶提取、有机溶剂分级沉淀法制备柚皮多糖，得出优化工艺为：酶用量1. 0%、酶解时间90 min、料液比1∶20、酶解温度50℃，多糖得率为9.32%。不同分级的柚皮粗多糖含量和纯度各不同，不同分级的多糖分子量测定表明：乙醇浓度越低，沉淀多糖的分子量越大，不同分级的多糖分子量呈现趋势为粗多糖(c)的分子量最小，粗多糖(a)分子量最大，且在粗多糖a，b中出现了和c一个级的分子量，可能是因为不同分子量多糖的沉淀不仅与乙醇浓度有关，还与乙醇加入的顺序有关。

实施例3 a多糖、b多糖和c多糖在烟草保润方面的应用

一、不同分级的柚皮多糖自身保润性的测定

分别以30%乙醇和去离子水作为溶剂，在室温条件下，取浓度为1.5%的a粗多糖、b粗多糖、c粗多糖样液各2g，取0.2%丙二醇、1.5%丙二醇各2g作为对照组，分别放置于表面皿中，共8组，在室温下，每隔1h，将样品取出后称重，按下式计算其水分散失率：水分散失率（%）=（M₁-M₂）/M₃×100。

(式中：M₁为放置前样品总重量；M₂为放置不同时间后样品总重量；M₃为样品净重)

具体效果见图由图8、图9可知，在一定条件下，不同分级的柚皮多糖自身水分散失率有显著差别，采用不同溶剂也会影响它们自身水分散失变化。无论选择30%乙醇或者去离子水作为溶剂，都是1.5%丙二醇的自身保润性最好，a粗多糖的自身保润性最差；当30%乙醇作为溶剂时，b粗多糖的自身保润性明显高于c粗多糖，且c粗多糖﹥b粗多糖﹥0.2%丙二醇；当去离子水作为溶剂时，c粗多糖、b粗多糖、0.2%丙二醇的自身保润性非常接近，但c粗多糖﹥0.2%丙二醇﹥b粗多糖。不同的多糖溶液中，除含有多聚糖以外，还含有蛋白质、色素等大分子物质，影响了糖类分子与水分子间的缔合；保润剂吸湿、(分子间所形成的氢键) 的大小，该作用力越大，对水分的结合力越强。

二、不同分级柚皮多糖对载体的保润性能测试

（1）平衡载体样品含水率：称取载体样品2g，将其置于表面皿中，置于环境湿度为（50±5）%、温度为（25±2）℃的恒温恒湿箱中平衡含水率24 h，平衡后的载体样品含水率为12.5%；

（2）多糖浓度配制：取干燥的a粗多糖、b粗多糖、c粗多糖，分别采用去离子水和30%乙醇作为溶剂，将它们配制为浓度为1.5%的柚皮多糖样液；

（3）喷加料液。取2g平衡含水率后的载体样品放置于表面皿中，分别喷入浓度为1.5%柚皮多糖样液，0.2%丙二醇、1.5%丙二醇各1 g，并用玻璃棒混合均匀。将样品分别放入恒温干燥箱内，分别控制温度为28℃，每隔1h测量1次重量，记录其含水率变化情况；

测试结果：

1. 不同浓度的柚皮多糖对载体保润性的影响

如图10所示，以去离子水作为溶剂，随着时间的增长，各样液的水分散失率均逐步上升，且变化速度越来越缓慢，最后基本保持稳定状态。前2h内，各样液的变化趋势均呈快速上升，其中，浓度为2.0%的样液变化最慢，0.5%的样液变化最快；在3h内，各样液的上升速度稍微减慢；在5h后，各样液的水分散失率趋于平衡点，表明载体内部水分的吸湿特性达到平衡点。1.5%的柚皮多糖样液为载体的最优保润浓度。

2. 不同溶剂对柚皮a粗多糖保润性的影响

由图11可见，在4h内，a粗多糖在水溶条件下的水分散失率明显低于醇溶条件下，且水分散失速度随时间的延长逐渐减缓；在4h后，a粗多糖样液在不同体系中水分散失率越来越接近，它们分别趋于平稳状态，基本保持在46.7%～48.0%，但在水溶条件的a粗多糖样液比醇溶条件下水分散失率略低1%。在4h内，水溶条件下的a粗多糖水分散失速度明显低于醇溶条件下的a粗多糖和0.2%丙二醇；但在4h后，它们的水分散失速度发生变化，0.2%丙二醇﹥a粗多糖（水溶）﹥a粗多糖（醇溶）。1.5%丙二醇的水分散失率很缓慢，在3h后，水分散失率维持在34.6%～34.9%的范围内波动，水分散失变化极其缓慢，几乎呈直线趋势。因此，在一定条件下，a粗多糖在水溶条件下对同品种载体的保润性高于醇溶条件下。不同溶剂的柚皮多糖保润特性差异可能是因为载体的物理和化学特性，从物理组织结构上看，载体是具有大量毛细管的多孔体。孔多则表面积大，表面能高，故载体是一个热力学不稳定体系。为了降低其表面能，就必然会自发产生吸附现象，因此，载体有很强的吸附能力。不同的溶剂在载体表面的渗透和蒸发效果不同。

3. 不同溶剂对柚皮b粗多糖保润性的影响

根据图12可知，当温度为28℃时，在4h内，b粗多糖在醇溶条件下的水分散失率显著高于水溶条件下，且b粗多糖（醇溶）﹥0.2%丙二醇﹥b粗多糖（水溶），在4h后，它们的水分散失率越来越接近，最终都维持在47.1%～48.0%，水分变化均呈稳定趋势。在3h内，1.5%丙二醇的水分散失速度较为缓慢；在3h后，它的水分散失率保持在34.6%～34.9%内，基本呈直线现象。所以，在一定条件下，b粗多糖在水溶条件下对同品种载体的保润性高于醇溶条件下。

4.不同溶剂对柚皮c粗多糖保润性的影响

如图13，在28℃时，在4h内，c粗多糖在醇溶条件下的水分散失率略低于水溶条件下；然而，在4h后，它们的水分散失率几乎保持一致，控制在47.1%～47.8%范围内波动。在2h内，0.2%丙二醇和醇溶条件下c粗多糖的水分散失率非常接近；在2h后，0.2%丙二醇的水分散失率稍微低于醇溶条件下c粗多糖。1.5%丙二醇的水分散失率始终低于其它样液，变化较为缓慢，最后呈稳定状态。所以，在一定条件下，c粗多糖在水溶条件和醇溶条件下保润性差别不显著。

结合图11、图12、图13分析可知，在一定条件下，当选择不同溶剂时，柚皮多糖对同品种载体的保润效果有所差别，水溶的柚皮多糖样液的保润性明显高于醇溶的柚皮多糖样液。多糖是大分子物质，对溶剂有一定的选择性，在不同的溶剂体系中呈现不同的相变，不同的溶剂体系对载体的亲和力和渗透性不同，导致在载体上的水分散失曲线不同。

Claims

1. 一种蜜柚柚皮多糖的提取分级方法，其特征在于，包括以下几步，

2. 根据权利要求1所述的提取分级方法，其特征在于，所述的纤维素酶用量为0.5-5.0%，果胶酶用量为1.0-3.5%，所述的酶解时间为1-2.5小时，水和柚皮的重量比为10~35：1，酶解的温度为45-60℃。

3. 根据权利要求1所述的提取分级方法，其特征在于，所述的蜜柚为梅州金柚、沙田柚。

4. 一种蜜柚柚皮a粗多糖，其特征在于，经Waters凝胶渗透色谱分析得，所述的a粗多糖的峰①的重均分子量为24100Da，数均分子量为21300Da，峰位分子量为28540 Da，分子量分布宽度为1.13。

5. 根据权利要求4所述的蜜柚柚皮a粗多糖，其特征在于，所述的a粗多糖的峰②的重均分子量为2180Da，数均分子量为2060Da，峰位分子量为2650 Da，分子量分布宽度为1.06。

6. 一种蜜柚柚皮b粗多糖，其特征在于，经Waters凝胶渗透色谱分析得，所述的b粗多糖的峰①的重均分子量为11700Da，数均分子量为11200Da，峰位分子量为13540Da，分子量分布宽度为1.04。

7. 根据权利要求6所述的蜜柚柚皮b粗多糖，其特征在于，所述的b多糖的峰②的重均分子量为1920Da，数均分子量为2030Da，峰位分子量为2390 Da，分子量分布宽度为1.05。

8. 一种蜜柚柚皮c粗多糖，其特征在于，经Waters凝胶渗透色谱分析得，所述的c多糖的峰①的重均分子量为2130Da，数均分子量为1890Da，峰位分子量为2540Da，分子量分布宽度为1.12。

9. 一种根据权利要求1所述的制备方法获得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在保润方面的应用。

10. 一种根据权利要求1所述的制备方法获得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在烟草保润方面的应用。