CN103486975A - 生物膜厚度光纤倏逝波传感器及其生物膜传感器系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物膜厚度光纤倏逝波传感器,采用由传感臂和参考臂组成的双探针结构形成;传感臂由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽制成,参考臂由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽并在凹槽内设置聚四氟乙烯滤膜制成。同时,本发明还公开了一种生物膜传感器系统。本发明实现光生物反应器内生物膜厚度在线、原位、准确的测量,建立了传感器测量原理的理论模型,为工业中膜式反应器的过程优化控制,提高光生物制氢效率和推动光生物制氢工程化的发展都具有一定的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种光纤传感器及其系统,尤其涉及一种生物膜厚度光纤倏逝波传感器及其生物膜传感器系统。
背景技术
生物膜厚度是联系反应器流体力学特性和生化反应动力学特性的关键参数。Lamotta提出了临界生物膜厚的概念,当生物膜厚度超过临界生物膜厚度时,生物膜的活性会减弱。Schorer研究表明,生物膜厚度随着营养底物、时间和空间的改变而发生变化。生物膜厚度检测的方法有离线检测法和在线检测法,离线检测方法有:生物量干重法、原子力显微镜法、激光共聚焦显微镜法等。干重法操作过程复杂,测量误差较大。原子力显微镜法和激光共聚焦显微镜法测量法精度较高,但只限于观察微小反应器内生物膜厚度的变化情况;如果对于体积较大的生物膜反应器,必须不断地从反应器中采集样品,在采样过程中极易带进杂菌而感染反应器,采用离线方法的另一个缺点是不易实施自动化控制。
在线检测方法有:中子反射法、椭圆光度法、表面等离子体共振法、双偏振干涉法、电容法、微电极法、光纤倏逝场吸收法等。前三种方法主要应用于分子结构、分子间相互作用和生物膜超微结构的定量分析,精度高,但很难实现反应器内生物膜空间分布的测量。电容法和微电极法能实现生物膜厚度在线原位测量,并且能测量mm级的生物膜,但是在膜式反应器内安装存在困难,且易受电磁干扰。光纤倏逝场吸收法为最有前途的方法;光纤传感器体积小、耐腐蚀、安装方便,能实现反应器内生物量浓度的在线原位测量,最大测膜厚度为2 mm;但是当生物膜厚度从0~2 mm时,传感器输出光强的改变量仅为275 μw,灵敏度低,同时在测量过程中并未考虑底物和产物浓度变化对传感器测量的影响,因此传感器测量结果的重复性低。因此,进一步提高光纤传感器灵敏度,消除底物和产物浓度变化对测量结果造成的影响,对实现反应器内生物膜生长过程的在线、原位、准确的测量很有必要。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足,为了消除微生物转化过程底物、产物浓度及外界光照强度的变化对传感器测量结果带来的影响,本发明提供了一种提高反应器内生物膜生长过程的在线、原位、准确的测量精度的生物膜厚度光纤倏逝波传感器。
本发明还提供一种提高反应器内生物膜生长过程的在线、原位、准确的测量精度的生物膜传感器系统。
为了解决上述技术问题,本发明采用了如下技术方案:
生物膜厚度光纤倏逝波传感器,该传感器采用由传感臂和参考臂组成的双探针结构形成;所述传感臂由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽制成,所述参考臂由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽并在凹槽内设置聚四氟乙烯滤膜制成。
同时,本发明提供的一种生物膜传感器系统,包括光生物反应器、反应器光源、LED光源、蠕动泵、恒温水浴、培养基储液瓶、气体收集瓶、探测头、光功率计、显微镜和光分路器;
所述光生物反应器包括固体基质上板、固体基质下板、传感臂和参考臂;所述固体基质上板和固体基质下板组合成一通明盒体,所述传感臂由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽制成,所述参考臂由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽并在凹槽内设置聚四氟乙烯滤膜制成;所述传感臂和参考臂分别设置在固体基质下板上的凹槽内,所述倏逝波传感臂和参考臂的未被腐蚀的一侧面贴近凹槽;在固体基质上板上设有入液口和出液口;
所述培养基储液瓶设置在恒温水浴中,所述蠕动泵的进口通过管路与培养基储液瓶内连通,所述蠕动泵的出口通过管路与入液口连通;所述出液口通过管路分别与气体收集瓶和培养基储液瓶连接,在靠近气体收集瓶的管路上设置开关阀Ⅰ,在靠近培养基储液瓶的管路上设置开关阀Ⅱ;所述反应器光源通过光纤与光分路器连接,所述光分路器输出三路光,其中两路分别与传感臂和参考臂的一端连接,传感臂和参考臂的另一端与探测头连接,第三路通过光纤直接与探测头连接,探测头与光功率计连接,所述LED光源发出的光与通明盒体对应,所述显微镜的镜头位于固体基质上板的正上方。
作为本发明的一种优选方案,生物膜传感器系统还包括温度测量仪和温度传感器,所述固体基质上板上设有温度传感器安装孔,所述温度传感器安装在温度传感器安装孔内并与温度测量仪连接。
作为本发明的另一种优选方案,所述气体收集瓶通过铁架台固定。
作为本发明的又一种优选方案,所述气体收集瓶上设有气体采样口。
作为本发明的一种改进方案,所述光生物反应器设置在载物台上。
本发明的有益效果是:为了实现光生物反应器内生物膜厚度在线、原位、准确的测量,设计了在线分离测量生物膜厚的传感器及反应器内生物膜厚度测量系统,建立了传感器测量原理的理论模型。实验研究了传感器的光谱传输特性,温度响应特性,参考臂对外界环境介质浓度变化的响应速度;根据反应器操作条件的不同,在线测量了培养基持续供给下反应器内生物膜厚度和培养基间断供给下反应器内生物膜厚度,采用显微镜实时监测了生物膜厚度的变化情况,并对传感器关于生物膜厚度的测量结果进行了标定。该方法为观察反应器内生物膜的生长环境条件、反应机理提供更有力的手段,能为工业中膜式反应器的过程优化控制,提高光生物制氢效率和推动光生物制氢工程化的发展都具有一定的意义。
附图说明
图1为生物膜厚度光纤倏逝波传感器在固体基质上安装的结构示意图;
图2为传感臂的结构示意图;
图3为传感臂的横截面示意图;
图4为参考臂的结构示意图;
图5为溶液浓度在PTFE滤膜内的分布示意图;
图6为生物膜传感器系统的结构示意图;
图7为传感器输出光强的变化量和生物膜厚度与培养时间的关系曲线;
图8为参数K与物膜厚度x间的关系曲线。
附图中: 1—传感臂; 2—参考臂; 3—反应器光源; 4—LED光源; 5—蠕动泵; 6—恒温水浴; 7—培养基储液瓶; 8—气体收集瓶; 9—探测头; 10—光功率计; 11—显微镜; 12—光分路器; 13—固体基质上板; 14—固体基质下板; 15—凹槽; 16—开关阀Ⅰ; 17—开关阀Ⅱ; 18—温度测量仪; 19—温度传感器; 20—铁架台; 21—气体采样口; 22—载物台; 23—计算机; 24—温度传感器; 25—纤芯; 26—包层; 27—涂覆层; 28—聚四氟乙烯滤膜; 29—固体基质; 30—有机玻璃胶; 31—多模石英光纤。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
如图1所示,生物膜厚度光纤倏逝波传感器,该传感器采用由传感臂1和参考臂2组成的双探针结构形成。传感臂1由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽制成,参考臂2由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽并在凹槽内设置聚四氟乙烯滤膜制成。
其中,传感臂1用于探测生物膜厚度及外界液相环境变化信息,包裹有微生物滤膜的参考臂2只用于探测液相环境信息。其次,参考臂2用于补偿外界光照条件变化对传感器测量结果带来的影响。传感器用光纤为多模石英光纤,从北京北玻科技产业中心购买。光纤纤芯25直径(D1)为400±2% μm,包层26直径(D1)为440±2% μm,光纤外径涂敷层27直径为480±3% μm,温度范围为-190~380 ℃,透过光谱范围为400~2500 nm,数值孔径(NA)为0.5。在制作光纤传感单元时,首先,将光纤进行侧边腐蚀,光纤腐蚀深度(H)介于40~100 μm之间,腐蚀区长度(L)为50 mm。腐蚀后的多模石英光纤作为传感臂1,腐蚀后的光纤结构如图2、3所示。将多模石英光纤侧边腐蚀的目的是使光纤中更多的模式进入环境介质(生物膜),同时增加光束在纤芯中的衰减全反射次数,增加生物膜对隐失场的吸收,提高传感器的灵敏度。为消除底物和产物浓度变化对传感器测量结果带来的影响,制作了参考臂,参考臂的结构如图4所示,图中28为聚四氟乙烯滤膜。微生物虑膜为聚四氟乙烯,滤孔直径为0.25 μm,滤膜厚度为500 μm。滤膜的作用是,将微生物与光纤分离,让液相中小于0.25 μm的物质通过滤膜并与光纤表面产生的倏逝场作用,从而对液相环境的变化(底物和产物的变化)信息做出响应。
为实现生物膜光生物反应器内生物膜厚度的在线测量,将制作好的传感臂1和参考臂2安装在生物膜光生物反应器内用于生物膜生长的载体表面,传感臂1在固体基质29表面的安装示意图如图1所示。在安装光纤传感单元前,首先,在固体基质29表面刻上约为0.5 mm的深、0.5 mm宽的凹槽15。然后,在凹槽15上涂上一层透明有机玻璃胶30,将未被腐蚀的多模石英光纤31(传感臂1和参考臂2)侧面贴近凹槽15,粘附在导光散射柱上。
传感器测量原理及方法:
在光纤传感器测量系统中,反应器光源3发出的光由光分路器12分为三路,其中两路用于连接传感臂1和参考臂2,另一路光纤直接与光功率计10相接,用于补偿光源光强和环境光强变化对测量结果带来的影响。其中,对于传感臂1,光纤经过生物膜吸收后,输入和输出光强之间满足:
上式(1)中, 和分别为传感臂中光纤输入端的光强和外界环境光强,为生物膜对倏逝波的吸收系数,为光纤感应区(腐蚀区)的长度,为反应器内生物菌悬液对外界环境光的吸收系数,x为生物膜厚度,d为环境光从反应器壁入射到光纤表面所经历的光程。其中,倏逝波衰减系数的计算表达式为:
上式(2)中各参数分别表示:为生物膜内微生物细胞的容积吸收系数,为生物膜内液相混合物质的容积吸收系数,λ为光入射到光纤输入端处的自由空间波长,n 1为生物膜的折射率,n 2为生物膜内液相混合物质的折射率,为光束入射到纤芯与生物膜分界面的界面入射夹角,为纤芯半径,n r为腐蚀后光纤在半径为处的折射率,为纤芯与生物膜分界面全反射临界角,为偏斜角。从式(2)可以看出当时,达到最大;时,最小。考虑传感臂的最低灵敏度,因此,有。式(2)经过变形后为:
对于参考臂,光纤经过液相环境中的微生物底物和产物吸收后,输入和输出光强之间满足:
在实验过程中,外界环境光主要来自于生物膜光生物反应器系统中的LED光源,该LED发出的光源为微生物细胞的特征吸收光源。当LED发出的光束经过生物反应器后,会被微生物细胞产生强烈的吸收,到达光纤表面的光束的能量比较小,大概在4 nW左右,而由光纤光源耦合进入光纤的光强为250 nW左右,因此,可以忽略外界环境光对传感器测量过程的影响。因此,式(1)和式(2)可以简化为:
由式(3)、式(5)和式(6)可以获得传感臂与参考臂输出光强之比与生物膜的变化信息:
式(7)中为常参数。从上式中可以看出,参数K只与生物膜容积系数和折射率有关,与液相环境信息无关。此外,R. Philip-Chandy等通过模拟各种水循环系统中的微生物膜的形成过程,证实了微生物膜厚度从0 mm生长到2 mm的过程中,折射率从1.330增大到1.355。可见,生物膜厚度与折射率之间有一一对应关系,且只要获得生物膜折射率就可以知晓生物膜的厚度。因此,可以通过计算获得参数,便可以获得生物膜折射率,从而获得生物膜厚度的变化信息。
参考臂响应速率:当传感器参考臂表面封装上微生物滤膜后,微生物滤膜会将光纤与外界环境介质隔离开,因此,当把封装有微生物滤膜的参考臂放入到液相环境中,液相环境中的小分子物质会通过滤膜微孔扩散到光纤表面,同时光纤表面附近的物质也会扩散到外界环境中。由菲克第二定律可知,该扩散过程可以描述为:
式(8)中,c为溶液浓度,D为扩散系数,t为扩散时间。溶液浓度在滤膜内的分布的示意图,如图5所示。
如果,将包裹有微生物滤膜的光纤看成圆柱型,则在柱坐标系下,式(8)可表述为:
式(9)的边界条件为:
式(10)中,C o和C e分别表示溶液在不同位置处的浓度。因此,当传感臂浸入到溶液中时,如果溶液浓度高于滤膜中的溶液的浓度时,溶液中的物质(如葡萄糖分子)将扩散进入滤膜,直到达到平衡。在这种情况下,式(9)的解为:
如果,溶液的浓度低于滤膜中的浓度时,光纤表面附近的物质将通过滤膜扩散进入外界溶液,直到达到新的平衡,在这种情况下,方程(9)的解为:
此外,本文还对封装有微生物滤膜的参考臂对外界溶液浓度变化时的响应时间进行了实验研究。实验条件为:500 mL浓度为30 g/L的葡萄糖溶液,500 mL蒸馏水溶液,溶液温度为30 ℃。步骤为:首先将传感臂浸入到葡萄糖溶液,待输出光强无变化后,立即将传感臂抽出,并浸入到蒸馏水中,待传感器输出光强再一次无变化后,又立即将传感臂从蒸馏水中抽出,浸入到葡萄糖溶液中,并重复上述实验过程。
生物膜传感器系统的结构如图6所示,生物膜传感器系统包括光生物反应器、反应器光源3、LED光源4、蠕动泵5、恒温水浴6、培养基储液瓶7、气体收集瓶8、探测头9、光功率计10、显微镜11、光分路器12、温度测量仪18和温度传感器19。
光生物反应器设置在载物台22上,光生物反应器包括固体基质上板13、固体基质下板14、传感臂1和参考臂2。固体基质上板13和固体基质下板14组合成一平板式通明盒体,透明盒体的尺寸为125 mm×80 mm×5 mm,工作容积为100 ml。传感臂1由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽制成,参考臂2由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽并在凹槽内设置聚四氟乙烯滤膜制成。传感臂1和参考臂2分别设置在固体基质下板14上的凹槽15内,传感臂1和参考臂2的未被腐蚀的一侧面贴近凹槽15,在固体基质上板13上设有入液口和出液口。固体基质上板13上设有温度传感器安装孔,温度传感器19安装在温度传感器安装孔内并与温度测量仪18连接。
培养基储液瓶7设置在恒温水浴6中,在恒温水浴6中设置温度传感器24,通过该温度传感器24观察恒温水浴6的温度,以便于使恒温水浴6处于恒温状态。蠕动泵5的进口通过管路与培养基储液瓶7内连通,蠕动泵5的出口通过管路与入液口连通。出液口通过管路分别与气体收集瓶8和培养基储液瓶7连接,在靠近气体收集瓶8的管路上设置开关阀Ⅰ16,在靠近培养基储液瓶7的管路上设置开关阀Ⅱ17。气体收集瓶8通过铁架台20固定,气体收集瓶8上设有气体采样口21。反应器光源3波长范围为200~2000 nm光源(DH-2000,海洋光学,美国),反应器光源3通过光纤与光分路器12连接,光分路器12输出三路光,其中两路分别与传感臂1和参考臂2的一端连接,传感臂1和参考臂2的另一端与探测头9连接,第三路通过光纤直接与探测头9连接,探测头9与光功率计10连接,光功率计的可探光谱范围为200~1100 nm,可探功率范围为100 pW到 0.2 W,不确定度为1%~4%(UV 0.2,Newport Corporation, 美国)。LED光源4发出的光与通明盒体对应,LED光源为黄光(波长范围为590 nm),发光强度为4000 lx。显微镜11的镜头位于固体基质上板13的正上方,显微镜11与计算机23连接,显微镜为奥林巴斯IX81倒置荧光显微镜,为实现为生物膜厚度的标定,倒置显微镜对光纤表面的生物膜厚度进行了实时监控,采用相差测量的方式对生物膜厚度进行定量标定。
在生物膜传感器系统启动前,反应器系统采用甲醛灭菌15分钟,然后采用灭菌过的蒸馏水冲洗干净。该生物膜传感器系统在使用过程中,液相流速为228 ml/h,葡萄糖碳源浓度为10 g/L,液相进口温度为30℃。
培养基连续供给下传感器的响应特性:培养基连续供给是指将接种好的菌液由蠕动泵以228 ml/h的流速充满反应器,并静置24 h后,再重新通入新鲜培养基时,采用连续供给的方式。在整个过程中,反应器进口液相温度由恒温水浴控制在30℃。虽然液相入口温度恒定,但是由于微生物细胞代谢产热和环境温度的变化,同样造成了反应器内液相环境的实际温度在29~34 ℃范围内变化。此外,根据传感器温度响应特性研究结果,当温度在25~40 ℃变化时,可忽略温度对传感器测量结果带来的影响。因此,不考虑温度变化对传感器测量结果带来的影响。传感器的传感臂、参考臂和显微镜的对光合细菌PSB CQK-01菌株生物膜生长过程的测量数据如图7所示。
从图中可以看出,在微生物培养初期(<25 h),传感臂1和参考臂2都出现了先增加后减小的趋势。因为随着微生物菌悬液的通入,光纤外部环境的折射率增大,减小了光纤表面凹陷内介质与光纤自身材料之间的折射率差,提高了光纤对光束的传输能力;传感器输出光强变化量减小,静止时,并未通入新鲜培养基,底物被微生物细胞降解,用于微生物细胞生长,因此底物浓度降低,从而增大了光纤表面凹陷内介质与光纤自身材料之间的折射率差,降低了光纤对光束的传输能力。随后随着新鲜培养基的加入,传感器的传感臂的输出信号随着生物膜的培养时间先增大后减小;因为,新鲜培养基的加入,底物浓度增大,微生物细胞大量繁殖,造成产物浓度也增大,底物和产物混合溶液的浓度增大,因此传感臂输出信号增大;同时,随着新鲜培养基的充分供给,生物膜细胞进一步地生长、繁殖(生物膜厚度增加到102 μm),光纤表面生物膜覆盖率增大,且生物膜也越变得致密,增大了底物的传质阻力,因此光纤表面底物浓度降低,同时,光纤表面致密的微生物细胞会对光纤表面发出的光产生强烈的吸收,因此,传感器输出信号减小。
而传感器的参考臂输出信号随着培养时间先增大后减小,最后趋于恒定。参考臂输出信号增大同样是因为底物和产物浓度增大造成;输出信号减小是因为微生物细胞附着在微生物滤膜表面,增大了底物和产物的传质阻力,因此传感器光纤表面底物浓度降低,输出信号减小;最终,输出信号保持稳定是因为在生物膜成熟后,微生物细胞的代谢能力保持稳定,即反应器内液相环境的浓度保持不变,同时,底物和产物在生物膜和滤膜内部的扩散达到平衡,因此,参考臂输出信号最终保持不变。
生物膜厚度随着培养时间先增大最后趋于稳定,最大生物膜厚度维持在122 μm左右。此外,为寻求传感器输出信号与生物膜厚度之间的函数关系,对传感器的传感臂和参考臂输出信号进行数据处理,获得参数K与生物膜厚度x之间的关系曲线图,如图8所示。
从曲线图8可以看出,当生物膜厚度在0~120 μm之间时,传感器输出信号K随着生物膜厚度的增大而减小,且与生物膜厚度x之间具有线性关系,K=-0.0368x+5.9656(R 2=0.9017)。当生物膜厚度大于120 μm时,传感器输出信号K急剧减小。当反应器光源的入射波长、光纤灵敏区半径、光纤折射率、光束在光纤输入端的入射角和光合细菌的容积吸收系数恒定时,传感器输出信号K只与生物膜的折射率有关。随着生物膜折射率随着生物膜厚度的增大而增大,因此,传感器输出信号K随着生物膜厚度的增大而减小。当生物膜厚度超过120 μm时,光纤表面生物膜受底物限制,生物膜内微生物细胞变小,生物膜空隙率也减小,折射率增大,因此,传感器输出信号K将迅速减小,此时,传感器的输出信号不能真实的反应生物膜厚度变化信息。因此,在培养基连续供给下,生物膜厚度传感器的测量范围为0~120 μm。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.生物膜厚度光纤倏逝波传感器,其特征在于:该传感器采用由传感臂(1)和参考臂(2)组成的双探针结构形成;所述传感臂(1)由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽制成,所述参考臂(2)由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽并在凹槽内设置聚四氟乙烯滤膜制成。
2.生物膜传感器系统,其特征在于:包括光生物反应器、反应器光源(3)、LED光源(4)、蠕动泵(5)、恒温水浴(6)、培养基储液瓶(7)、气体收集瓶(8)、探测头(9)、光功率计(10)、显微镜(11)和光分路器(12);
所述光生物反应器包括固体基质上板(13)、固体基质下板(14)、传感臂(1)和参考臂(2);所述固体基质上板(13)和固体基质下板(14)组合成一通明盒体,所述传感臂(1)由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽制成,所述参考臂(2)由多模石英光纤在其一侧腐蚀一段凹槽并在凹槽内设置聚四氟乙烯滤膜制成;所述传感臂(1)和参考臂(2)分别设置在固体基质下板(14)上的凹槽(15)内,所述倏逝波传感臂(1)和参考臂(2)的未被腐蚀的一侧面贴近凹槽(15);在固体基质上板(13)上设有入液口和出液口;
所述培养基储液瓶(7)设置在恒温水浴(6)中,所述蠕动泵(5)的进口通过管路与培养基储液瓶(7)内连通,所述蠕动泵(5)的出口通过管路与入液口连通;所述出液口通过管路分别与气体收集瓶(8)和培养基储液瓶(7)连接,在靠近气体收集瓶(8)的管路上设置开关阀Ⅰ(16),在靠近培养基储液瓶(7)的管路上设置开关阀Ⅱ(17);所述反应器光源(3)通过光纤与光分路器(12)连接,所述光分路器(12)输出三路光,其中两路分别与传感臂(1)和参考臂(2)的一端连接,传感臂(1)和参考臂(2)的另一端与探测头(9)连接,第三路通过光纤直接与探测头(9)连接,探测头(9)与光功率计(10)连接,所述LED光源(4)发出的光与通明盒体对应,所述显微镜(11)的镜头位于固体基质上板(13)的正上方。
3.根据权利要求2所述的生物膜传感器系统,其特征在于:还包括温度测量仪(18)和温度传感器(19),所述固体基质上板(13)上设有温度传感器安装孔,所述温度传感器(19)安装在温度传感器安装孔内并与温度测量仪(18)连接。
4.根据权利要求2所述的生物膜传感器系统,其特征在于:所述气体收集瓶(8)通过铁架台(20)固定。
5.根据权利要求2所述的生物膜传感器系统,其特征在于:所述气体收集瓶(8)上设有气体采样口(21)。
6.根据权利要求2所述的生物膜传感器系统,其特征在于:所述光生物反应器设置在载物台(22)上。
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- 2013-10-16 CN CN201310483836.7A patent/CN103486975B/zh active Active
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