CN103480003A

CN103480003A - 一种引发强效cd4+ t细胞免疫反应的新型hiv疫苗

Info

Publication number: CN103480003A
Application number: CN201310419864.2A
Authority: CN
Inventors: 孙彩军; 陈凌; 靳怡
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2013-09-13
Filing date: 2013-09-13
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-09-13
Also published as: CN103480003B

Abstract

本发明公开了一种引发强效CD4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗，将LC3b的基因与HIV抗原基因融合，进而将该融合基因克隆到疫苗载体中构建出新的疫苗。根据动物实验数据可以预见，相比于其他技术的HIV疫苗，使用本发明中的方法设计的HIV疫苗可以诱发更为强烈的，更为广谱以及更加多功能性的T淋巴细胞，尤其是多功能的CD4+T细胞反应，该方法还可以诱发强烈的B细胞反应。本发明技术可以普遍应用于预防和治疗艾滋病。

Description

一种引发强效CD4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗

技术领域

本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种引发强效CD4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗。

背景技术

自1984年发现艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS）至今，30年中，在艾滋病的治疗与预防方面，取得了极大的进步。然后，艾滋病仍然是全球威胁人民健康的最严重的疾病之一。截至2012年底，全球有约3400万的人感染艾滋病，累计死亡人数超过3000万。

目前为止，还未见有效的HIV疫苗应用于临床。一直以来，HIV诱发的特异性的细胞免疫反应，尤其是CD8+ T细胞免疫反应被认为是主要控制HIV病毒复制。因此，很多HIV疫苗的设计都是基于此点，诱发更强烈的CD8+ T 细胞反应以降低病毒载量。然而STE，Phambili，HVTN505等临床试验的失败表明：仅靠诱发强的CD8+ T 细胞反应来预防或者控制HIV是远远不够的。在经历了数次的临床失败后，近年来，对于HIV疫苗的CD4+ T淋巴细胞反应逐渐受到关注，或许诱发强烈，多功能性的CD4+ T淋巴细胞免疫反应是HIV疫苗发展的另一个方向。

均衡的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞免疫反应或许可以更好的控制HIV。 STEP，Phambili，HVNT505失败的原因之一很有可能就是基于5型腺病毒（Ad5）载体的HIV疫苗诱发了强的CD8+ T细胞免疫反应而相对弱的CD4+ T细胞反应。在泰国进行的一项HIV疫苗三期临床试验（RV144）有效的预防了HIV病毒，这是首次在临床水平证实HIV疫苗具有保护性。RV144试验中所诱发的CD4+ T细胞反应主要是针对于HIV-1 env的V2区，而且高水平的针对V1V2区的抗体很有可能能够有效的抑制或抵抗HIV-1病毒的感染。RV144试验表明诱发强的HIV特异性的CD4+ T细胞免疫反应对HIV疫苗的效果的发挥有重要的作用。

在哺乳动物中，LC3蛋白有3种形式：LC3a，LC3b，LC3c。可合成微管相关蛋白1轻链（microtuble associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3b，LC3b ）有2种形式，LC3b-I和LC3b-II。LC3-I游离于细胞质中，和磷脂酰乙醇胺(PE)结合，形成LC3b-II。LC3b-II是唯一的已知的可以特异性的定位在自噬体膜上的蛋白。当发生自噬的时候，在胞质中，游离的LC3b-I就会转化为LC3b-II，LC3b-II共价结合与自噬体的膜上，从而形成自噬体完整的膜结构。LC3b-II也是自噬体发生的Marker。有研究报道，将流感蛋白MP1与LC3b融合从而通过自噬途径把MP1递呈至CD4 T细胞识别，提高CD4+ T细胞免疫反应。但是，未有文献报导这种递呈作用具有普遍性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HIV疫苗。

本发明所采取的技术方案是：

一种HIV疫苗，疫苗含有HIV目的抗原基因与LC3基因的融合基因，HIV目的抗原基因选自HIV gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、vpx、rev。

作为本发明的进一步改进，LC3基因为LC3b基因。

作为本发明的进一步改进，疫苗的载体为质粒或病毒。

作为本发明的进一步改进，疫苗的载体为质粒pVAX载体或腺病毒AD5载体。

作为本发明的进一步改进，将HIV目的抗原基因与LC3基因融合，使表达出的融合蛋白中，HIV目的抗原与LC3蛋白的N端融合。

本发明的有益效果是：

动物模型实验数据显示，通过融合LC3b到SIVgag蛋白，可以诱发更加强烈，广谱，多功能性的CD4+ T淋巴细胞反应。并且，这种方法是安全可行的。本发明的疫苗可以普遍用于预防和治疗艾滋病。

附图说明

图1是携带SIVgag-LC3b的DNA载体和Ad5载体的构建；图1A是携带有的LC3b，SIVgag，SIVgag-LC3b的示意图，图1B是用western-blot方法检测重组pVAX载体蛋白表达水平的检测，分别使用Anti-SIVgag和Anti-LC3b抗体；图1C是用western-blot的方法检测重组腺病毒蛋白水平的检测；

图2是靶向SIVgag到自噬体的细胞定位图；

图3是靶向SIVgag到溶酶体（图3A）和MIICs的细胞定位图（图3B）；

图4是ELISOPT检测疫苗诱发的IFN-γ分泌水平；图4A是免疫策略；图4B是DNA疫苗初免后（4周），ELISPOT检测IFN-γ分泌水平；图4C是腺病毒加强后（6周），ELISPOT检测IFN-γ分泌水平；

图5是多色流式技术（ICS）检测Gag肽刺激CD4+ T细胞分泌细胞因子的结果；图5A是设定阳性细胞阈值的策略图；图5B是DNA疫苗初免后（4周），ICS检测Gag肽刺激CD4+ T细胞分泌细胞因子的结果；图5C为腺病毒加强（8周），ICS检测Gag肽刺激CD4+ T细胞分泌细胞因子的结果；

图6是小鼠免疫6周后，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测SIV特异性抗体分泌水平。

具体实施方式

下面结合实验，进一步说明本发明。

下列实验中未提及的具体实验方法，通常按照现有常规实验方法进行。

鉴于现有技术中缺乏HIV的实验模型，以下实验中，使用SIV实验模型对疫苗的效果进行评价。

一、疫苗的构建

基因的获得：从NCBI数据库中得到LC3b基因序列，通过全基因合成得到LC3b基因。LC3b的基因序列如SEQ ID NO：1所示，SIVgag的基因序列SEQ ID NO：2所示；携带有SIVgag的 pVAX载体以及Ad5-SIVgag重组腺病毒由本实验室保存。

疫苗的构建

质粒载体外源元件的插入顺序如如图1 A所示。SIVgag-LC3b融合基因表达出的融合蛋白中，SIVgag蛋白与LC3蛋白的N端融合。

按照常规的方法将合成的LC3b基因构建到pVAX 质粒载体上，即pVAX-LC3b。通过酶切，连接的方法将LC3b和SIVgag共同构建于pVAX载体上，即 pVAX-SIVgag-LC3b图1B 是用Western-blot方法检测重组pVAX载体蛋白表达水平的检测。pVAX-LC3b，pVAX-SIVgag-LC3b均的到正确表达。SIVgag在融合了LC3b后，条带上移，表达结果符合预期大小。

重组腺病毒的构建，扩增，纯化与鉴定

按照常规的重组腺病毒构建方法将LC3b和SIVgag-LC3b构建到腺病毒载体中，其中的腺病毒载体为缺失了E1和E3区域的人五型腺病毒，然后拯救得到携带目的基因的重组腺病毒，少量扩增后进行表达和基因组酶切鉴定，接着在Trex293细胞中大量扩增，并采用氯化铯梯度密度离心进行纯化，对纯化的病毒再次鉴定正确后测定其感染滴度TCID₅₀和物理颗粒浓度，然后分装冻存备用（相关方法的具体操作步骤可参见CN101219221A）。图1C是用western-blot方法检测重组腺病毒蛋白表达水平的检测结果图；Ad5-SIVgag可表达p55和p27，而Ad5-SIVgag-LC3b表达的条带大小为71Ka和43Ka，表明融合蛋白表达正确。无论用Anti-SIVgag，还是Anti-LC3b抗体均得到相同的结果。并且与DNA疫苗表达结果一致。

二、靶向 SIVgag 到自噬体，溶酶体， MIICs 的检测

1. 实验材料

1.1细胞

稳定表达GFP-LC3b的Hela细胞系，Hela细胞系，小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系。

1.2抗体

一抗：Anti-MHCII（品牌：Abcam；货号：ab64528），Anti-LAMPII（品牌：Abcam；货号：ab37024），Anti-SIVgag（美国国立健康研究所艾滋病研究和参考试剂项目（NIH AIDS Research & Reference Reagent Program）提供）。

二抗：Alexa Fluro 488标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（品牌：碧云天；货号：A0428），Cy3-标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（品牌：碧云天；货号：A0521），Alexa Fluro 488标记山羊抗兔IgG（H+L）（品牌：碧云天；货号：A0423），Cy3-标记山羊抗大鼠IgG（H+L）（品牌：碧云天；货号：A0507）。

其他：DAPI（品牌：碧云天；货号：C1002）。

实验操作

2.1实验步骤

1）用4%多聚甲醛（Paraformaldehyde）固定细胞10min；

2）弃固定液0.2%吐温20（TWEEN-20）透膜10min；

3）弃透膜液，PBS洗3遍，每遍5min；

4）1%牛血清白蛋白封闭1h；

5）弃封闭液，一抗体孵育2h；

6）弃一抗，PBS洗3遍，每遍5min；

7）相应二抗孵育1h；

8）弃二抗，PBS洗3遍，每遍5min；

9）DAPI染核3min；

10）镜下观察。

2.2检测系统

使用激光共聚焦显微镜（LEICA DMI6000B）观察细胞。

实验结果

在载体构建正确后，在细胞水平检测SIVgag是否被LC3b靶向到自噬体，并最终被MHCII递呈至CD4+ T细胞识别。

3.1靶向SIVgag到自噬体

转染pVAX-SIVgag，pVAX-SIVgag-LC3b到稳定表达GFP-LC3b的Hela细胞系。转染36h后，加入氯喹（CQ）,并设不加CQ组做对照。转染48h后，将细胞如上述实验步骤处理，在激光共聚焦显微镜下观察。如图2所示，在融合了LC3b后，SIVgag在胞质中聚集成点，并且可与GFP-LC3b共定位，说明LC3b靶向SIVgag到自噬体。而SIVgag在胞质中是弥散的分布的，不能聚集成点，无法与GFP-LC3b共定位。

3.2靶向SIVgag到溶酶体和MIICs

转染pVAX-SIVgag，pVAX-SIVgag-LC3b到Hela细胞，具体操作如上述实验步骤。如图3A所示，融合蛋白可以成点并与LAMPII共定位，证明SIVgag 在溶酶体/自噬溶酶体中存在。而SIVgag不可成点，弥散的分布于细胞质中，也无法与LAMPII共定位。

鼠巨噬细胞RAW264.7感染Ad5-SIVgag，Ad5-SIVgag-LC3b腺病毒，感染36h后加入氯喹（CQ）,并设不加CQ组做对照。剩余步骤如上述实验步骤。如图3B所示，融合蛋白可以成点并与MHCII共定位，表明SIVgag被运送至MIICs中。而SIVgag弥散与细胞质中，无法与MHCII定位。

三、疫苗在小鼠模型中的免疫原性

在证实LC3b能够靶向SIVgag到自噬体，并通过自噬这条途径将SIVgag最终有效的递呈至CD4+ T淋巴细胞后。进一步研究融合了LC3b的SIVgag是否能够在机体内发挥作用而有效的提高CD4+ T淋巴细胞反应。

1．实验材料

1.1流式抗体

所用单克隆抗体，抗鼠anti-CD3-PerCP, anti-CD4-FITC and anti-CD8-APC (BD Biosciences) anti-IFN-γ-PE, anti-TNF-α-PE-cy7, anti-IL-2-APC-cy7 (BD Pharmingen)购自BD公司。

1.2 SIVgag抗原多肽

SIVgag多肽由美国国立健康研究所艾滋病研究和参考试剂项目（NIH AIDS Research & Reference Reagent Program）提供，大部分肽由15个氨基酸组成，两两之间有11个氨基酸重叠，纯度>80%。用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成0.4mg/ml/肽的储存液，分装后-70℃保存。

1.3其他试剂

ELISPOT 板(品牌：Millipore；货号：MSIPS4510)购自达科为生物科技有限公司，SIVgag蛋白购自苏州杰恩生物技术有限公司，TMB/E底物（货号：ES001）购自美国Chemicon公司。BCIP/NBT底物（品牌：Pierce；货号：34042）购自广州吉泰生物科技有限公司。链霉素偶联的碱性磷酸酶（品牌：BD PharMingen，货号：554065）购自基因有限公司。

2、实验方法

2.1实验动物和免疫策略

每组8只6-8龄雌性C57BL/6小鼠。DNA疫苗免疫剂量为50μg/100μL/只；腺病毒疫苗免疫剂量为1×10⁹vp/只/100µL，分别在小鼠两侧的股四头肌各注射50µL。共免疫4次，间隔2周。免疫策略如图4A所示。免疫2次DNA疫苗后（即4周），每组随机取4只，处死，进行免疫检测。剩余4只继续注射腺病毒疫苗。

2.2 多色流式技术检测多功能 T 细胞

1）分离好的PBMC细胞计数后调整至2×10⁶/ml，加入到96孔培养板,每孔200μL；培养基为R10；

2）在上述细胞悬液中加入特异性抗原肽，阴性对照孔加入相应浓度的DMSO，阳性对照加入佛波酯（PMA）（20ng/ml）+离子霉素（1000ng/ml）；

3）37 ℃, 5％CO₂培养1-2h；

4）加入布雷菲德菌素（BFA）（10μg/ml）混匀；

5）37 ℃, 5％ CO₂培养16h；

6）吹打均匀细胞，转移至流式管中（12×75mm 聚苯乙烯管）；加入1ml 流式洗液；混匀后300g室温离心10分钟；

7）弃上清；分别加入细胞表明标记抗体，如anti-CD3-PerCP, anti-CD4-FITC and anti-CD8-APC，振荡2－3秒；

8）室温避光放置25－30分钟；

9）加入3ml FACS 洗液；混匀后300g室温离心10分钟；

10）重复洗涤一次；

11）振荡均匀细胞，然后加入250µl 细胞固定/通透液（cytofix/cytoperm，品牌：BD；货号：554722），混匀；

12）4℃，避光反应20min；

13）加入1ml 1×细胞通透/洗涤液（perm/wash，品牌：BD Biosciences；货号：554723；产品为10倍，用之前用无菌蒸馏水稀释至1倍），400g，离心8min；弃上清；

14）重复一次；

15）弃上清，加入anti-IFN-γ-PE, anti-TNF-α-PE-cy7, anti-IL-2-APC-cy7（各10μL抗体），混匀；

16）4℃避光30－60分钟；

17）加入1ml 1×细胞通透/洗涤液（perm/wash），400g，离心8min；

18）弃上清，加入1ml 流式洗液；混匀后400g室温离心10分钟；

19）吸走大部分上清，约留300μl；振荡混匀后上机；

20）在FACSAria流式细胞仪上检测，用Cell Quest软件获取数据，然后用Modfit 软件分析。

2.3 IFN-γ酶联免疫斑点技术

第一天：

取一管包被抗体（抗鼠IFN-γ 抗体对其中包含有这个抗体，品牌：BD，PharMingen；克隆号为R4-6A2）用无菌PBS（pH7.2-7.4）1:100稀释，100μl/孔加入到96孔 PVDF膜板，4℃包被过夜。

第二天：

1）甩去液体，用无菌PBS洗涤3次，每孔加入200μl R10完全培养基，37℃封闭 2小时；

2）封闭期间分离PBMC；采用95%稀释的淋巴细胞分离液（商品名为opti-prep）分离淋巴细胞；

3）弃去封闭液，每孔加入100μl PBMC；

4）实验中设阳性对照组（ConA组），特异肽，空白对照（DMSO）；在37℃ 5%CO2培养箱中孵育；

第三天：

5） 24h后，弃去细胞悬液，用无菌PBST 220μl/well洗涤6次；

6）甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干；

7）用含5％FBS的PBST按1:400稀释检测抗体（生物素标记的抗鼠IFN-γ 抗体），100μl/well，4℃过夜；

第四天：

8）用无菌PBST 220μl/孔洗涤4次；

9）甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干；

10）配置链霉素偶联的碱性磷酸酶：用含5％FBS的PBST按1:2500稀释链霉素偶联的碱性磷酸酶，100μl/孔，37℃，2小时；

11）处理BCIP/NBT底物（Pierce, Cat：34042）,37℃温浴30min；

12）用无菌PBST 220μl/孔洗涤5次，甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干；

13）加入BCIP/NBT底物，100μl/孔，避光反应7min；

14）弃去底物，用水洗涤2次。风干读板。

2.4 ELISA检测SIVgag特异性结合抗体

1）用SIVgag蛋白包板，浓度为1μg/ml，过夜；

2）弃包被蛋白， PBST洗3遍，每次5min；

3）4%的脱脂奶粉封闭1h；

4）4%的脱脂奶粉2倍比稀释待检测的小鼠血清，每孔100μL，37℃，2小时；

5）弃血清，PBST洗3遍，每次5min；

6）辣根过氧化物标记山羊抗小鼠1：5000稀释，每孔100μL，37℃，1小时；

7）弃上清，PBST洗3遍，每次5min；

8）加入TMB/E显色，每孔100μL，室温避光10min；

9）加入1mol/L硫酸终止反应；

10）读板：使用Synergy™ HT Multi-Mode Plate Reader (BioTek Instruments, Inc., Vermont, USA)在450nm吸光值下读板。

3. 实验结果

3.1 SIVgag-LC3b 融合蛋白可以诱发更强的抗原特异性的细胞免疫反应

比较了SIVgag和SIVgag-LC3b在小鼠体内的免疫源性，ELISPOT检测IFN-γ的分泌情况。如图4B所示，在DNA疫苗初后，即免疫4周以后，免疫SIVgag-LC3b组诱发的更强的免疫反应，与免疫SIVgag组比较，产生的斑点是其2.5倍（59/23），差异极显著（p=0.0006）。在用腺病毒加强免疫后，即免疫6周以后，针对SIVgag特异性的免疫应答显著增强，免疫SIVgag-LC3b组平均产生749个斑点（百万个PBMC细胞），而免疫SIVgag组平均产生420个斑点，差异极显著（p=0.0019）。无论是单独使用DNA疫苗免疫还是在腺病毒疫苗加强后，免疫SIVgag-LC3b组都要比免疫SIVgag组免疫反应高出1倍左右。

融合蛋白诱发更强更多功能性的 CD4+ T 淋巴细胞免疫反应

ELISPOT检测的是总IFN-γ的量，进一步检测CD4+ T，CD8+ T细胞抗原特异性的免疫反应。图5B是只免疫DNA疫苗所诱发的CD4+ T细胞反应，免疫SIVgag-LC3b组CD4+ T分泌IFN-γ，TNF-α，IL-2的细胞远远高于免疫SIVgag组，约为2-3倍左右；分泌细胞因子IFN-γ/ TNF-α，IFN-γ/ IL-2，IFN-γ/ TNF-α/ IL-2的多功能性CD4+ T细胞的也均高于SIVgag组，多功能性CD4+ T细胞的增多对于HIV疫苗来说是非常重要的。在两次腺病毒加强免疫反应后，如图5C所示，这种差距进一步被拉大，免疫SIVgag-LC3b组CD4+ T细胞分泌的IFN-γ，TNF-α，IL-2比免疫SIVgag组增强了将近10倍左右。更为有意义的是，多功能性CD4+ T细胞，尤其是同时分泌3种细胞因子的多功能CD4+ T细胞增多非常明显。从图5D，5E可以看出，无论是单独注射DNA疫苗，还是腺病毒疫苗加强，免疫SIVgag-LC3b组分泌单细胞因子的CD4+ T细胞以及多功能性CD4+ T都更为均衡。

融合蛋白可以诱发出更强的 SIVgag 特异的结合抗体

由于单独的DNA疫苗所诱发的免疫方面整体是比较弱的，因此只检测了第一次腺病毒加强后的小鼠血清中的抗体水平。如图6所示，免疫SIVgag-LC3b组，SIVgag特异性的结合抗体显著（p=0.01）高于免疫SIVgag组。

根据上述实验结果，可以预见，当使用HIV目的抗原基因，如HIV gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、vpx、rev，特别是同源性最高的HIV gag替换SIV gag基因时，制备得到的HIV疫苗可以表达出HIVgag-LC3b融合蛋白，进而诱发更强的抗原特异性的细胞免疫反应，更强更多功能性的CD4+ T淋巴细胞免疫反应。

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种引发强效CD4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 378

<212> DNA

<213> 鼠

<400> 1

atgccgtccg agaagacctt caagcagcgc cggagctttg aacaaagagt ggaagatgtc 60

cggctcatcc gggagcagca ccccaccaag atcccagtga ttatagagcg atacaagggg 120

gagaagcagc tgcccgtcct ggacaagacc aagttcctgg tgcctgacca cgtgaacatg 180

agcgagctca tcaagataat cagacggcgc ttgcagctca atgctaacca agccttcttc 240

ctcctggtga atgggcacag catggtgagt gtgtccactc ccatctccga agtgtacgag 300

agtgagagag atgaagacgg cttcctgtac atggtttatg cctcgcagga gacattcggg 360

acagcaatgg ctgtgtaa 378

<210> 2

<211> 1565

<212> DNA

<213> 猴免疫缺损病毒（Simian Immunodeficiency Virus）

<400> 2

cgaagcttac catgggcgtg aggaactctg tgctgtctgg caagaaggct gatgagctgg 60

agaagatcag gctgaggccc aatggcaaga agaagtacat gctgaagcat gtggtgtggg 120

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cagaggaggc caagcagatt gtgcagaggc acctggtggt ggagacaggc accacagaga 360

ccatgcccaa gacctccagg cccacagccc cctcctctgg cagggggggc aactaccctg 420

tgcagcagat tgggggcaac tatgtgcacc tgcccctgtc ccccaggacc ctgaatgcct 480

gggtgaagct gattgaggag aagaagtttg gggctgaggt ggtgcctggc ttccaggccc 540

tgtctgaggg ctgcaccccc tatgacatca accagatgct gaactgtgtg ggggaccacc 600

aggctgctat gcagatcatc agggacatca tcaatgagga ggctgctgac tgggacctgc 660

agcaccccca gcctgccccc cagcagggcc agctgaggga gccctctggc tctgacattg 720

ctggcaccac ctcctctgtg gatgagcaga tccagtggat gtacaggcag cagaacccca 780

tccctgtggg caacatctac aggaggtgga tccagctggg cctgcagaag tgtgtgagga 840

tgtacaaccc caccaacatc ctggatgtga agcagggccc caaggagccc ttccagtcct 900

acgtggacag gttctacaag tccctgaggg ctgagcagac agatgctgct gtgaagaact 960

ggatgaccca gaccctgctg atccagaatg ccaaccctga ctgcaagctg gtgctgaagg 1020

gcctgggggt gaaccccacc ctggaggaga tgctgacagc ctgccagggg gtggggggcc 1080

ctggccagaa ggccaggctg atggctgagg ccctgaagga ggccctggcc cctgtgccca 1140

tcccctttgc tgctgcccag cagaggggcc ccaggaagcc catcaagtgc tggaactgtg 1200

gcaaggaggg ccactctgcc aggcagtgca gggcccccag gaggcagggc tgctggaagt 1260

gtggcaagat ggaccatgtg atggccaagt gccctgacag gcaggctggc ttcctgggcc 1320

tgggcccctg gggcaagaag cccaggaact tccccatggc ccaggtgcac cagggcctga 1380

tgcccacagc cccccctgag gaccctgctg tggacctgct gaagaactac atgcagctgg 1440

gcaagcagca gagggagaag cagagggagt ccagggagaa gccctacaag gaggtgacag 1500

aggacctgct gcacctgaac tccctgtttg ggggggacca gtaaagtaaa gcccgggtct 1560

agagg 1565

Claims

1.一种HIV疫苗，其特征在于：所述疫苗含有HIV目的抗原基因与LC3基因的融合基因，HIV目的抗原基因选自HIV gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、vpx、rev。

2.根据权利要求1所述的一种HIV疫苗，其特征在于：LC3基因为LC3b基因。

3.根据权利要求1或2所述的一种HIV疫苗，其特征在于：疫苗的载体为质粒或病毒。

4.根据权利要求3所述的一种HIV疫苗，其特征在于：疫苗的载体为质粒pVAX载体或腺病毒AD5载体。

5.根据权利要求1或2所述的一种HIV疫苗，其特征在于：将HIV目的抗原基因与LC3基因融合，使表达出的融合蛋白中，HIV目的抗原与LC3蛋白的N端融合。