CN103468597A

CN103468597A - 一种产碱性纤维素酶的铜绿假单胞菌

Info

Publication number: CN103468597A
Application number: CN2012103821716A
Authority: CN
Inventors: 芦志龙; 陈东; 张穗生; 陆琦; 黄日波
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2012-10-11
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2032-10-11
Also published as: CN103468597B

Abstract

本发明涉及了一株能够产纤维素酶的铜绿假单胞菌菌株PKC-001。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010294，保藏日期为2010年11月8日。据外观形态、生化反应和16S rDNA序列分析鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。本发明所提供的铜绿假单胞菌菌株具有如下特点：1、能够产生纤维素酶；2、所产的纤维素酶在酸性和碱性条件下均具有CMC酶活力，酸性条件下的最适作用pH为5.0，碱性条件下的最适作用pH为8.6，应用前景广阔。

Description

一种产碱性纤维素酶的铜绿假单胞菌

技术领域

本发明属于生物技术和工程领域，特别涉及从自然界中纤维素丰富的环境中筛选、分离、纯化到一株能产生纤维素酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

技术背景

由植物(包括光合自养微生物)通过光合作用形成的有机碳化合物，除成型木材外，统称为植物生物质(biomass)。木质纤维(lignocellulose)是构成植物生物质的主要成分，也是目前公认的地球上资源量最大的可再生有机化合物资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素三大类组分构成，同时还可能含有少量的果胶、几丁质、硅酸盐等成分。纤维素是木质纤维中含量最高的组分，通常占总重量的35-45％，为一类由葡萄糖分子通过β-1，4糖苷键连接形成的线状多聚葡萄糖。这一结构与通过α-1，4糖苷键连接形成葡聚糖分子的淀粉类物质不同，因此不受淀粉水解酶类的水解。

不过，由于纤维素的构成单元为葡萄糖，挖掘在温和条件下将其水解的生物酶制剂，无论是对该资源的开发，还是对纤维素加工产业(纺织、造纸等)的技术改进，都具有重要的意义。经多年的研究发现，按作用的最适pH条件划分，纤维素水解酶通常可分为酸性纤维素酶和碱性纤维素酶。

酸性纤维素酶指作用的最佳pH条件在酸性范围的一类纤维素水解酶，目前发现的主要由一些丝状真菌，如木霉、根霉等微生物产生，通常含有三种酶活力组分：1、内切葡聚糖酶(endoglucanase)，即内切-β-1，4葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)，简称内切酶(EG或BGL)；2、外切葡聚糖酶，包括两类酶，一是β-1，4-D-葡萄糖-葡萄糖水解酶(EC 3.2.1.74)，也称纤维糊精酶。二是β-1，4-D-葡聚糖-纤维二糖水解酶，又称外切-β-1，4-葡聚糖酶(exo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.91)或纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)，简称外切酶；3、β-1，4-葡萄糖苷酶(β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21)或β-葡萄糖苷-葡萄糖水解酶，简称β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，β-G)或纤维二糖酶(cellobiase，CB)等。这类纤维素酶通常能够将纤维素完全水解成游离的葡萄糖分子，因此也称为纤维素水解完全酶，现主要用于纤维素资源开发研究、饲料工业，以及纺织工业对棉料的表面处理。

碱性纤维素酶则指在碱性条件下能够催化裂解纤维素分子的一类水解酶，最早在上世纪 70年代由日本科学家在嗜碱性的芽孢杆菌中发现。目前的研究表明，该类纤维素酶一般只有纤维素内切酶，即内切-β-1，4葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4，简称内切酶，EG或BGL)的活性，活力用羧甲基纤维素(CMC)为底物测定，因此，也称为羧甲基纤维素酶(CMCase)。其活性通常以CMC活性单位表示。由于碱性纤维素酶的作用pH在碱性范围内，与纺织物洗涤条件比较一致，能够在温和条件下作用于污渍附着的位点，却不会对衣物造成损害，所以，该酶类产品目前主要用于洗涤工业，为加酶洗涤产品的必需原料。至今为止，能够产生碱性纤维素酶的微生物多为细菌菌株，包括芽孢梭菌属、纤维单胞菌属、纤维弧菌属、混合纤维弧菌、芽孢杆菌属等的一些菌种，以及牛黄瘤胃梭菌、白色瘤胃球菌、溶纤维菌，热纤梭菌、解纤维梭菌、粪碱纤维单胞菌等菌种，国外该类酶的工业化生产主要以芽孢杆菌属的菌株(如Bacillus sp.KSM-635)为发酵菌种。国内的研究受制于缺乏碱性纤维素酶的高产菌株，鲜有大规模的发酵生产，挖掘新的微生物产纤维素酶菌株仍极为必要。

发明内容

本发明提供一株产生纤维素酶的微生物新菌株，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PKC-001。该菌株所产生的纤维素酶既有酸性纤维素酶的活力，也有碱性纤维素酶的活力，是一种新型的纤维素酶产酶菌株。该菌株是发明人用微生物学手段从造纸厂的废弃纸浆中分离选育得到，已于2010年11月8日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2010294。

该菌株为短杆状，1.5μm×0.5μm，单生鞭毛，运动活跃。在平板培养基上显示为扁平、边缘锯齿的圆形菌落，色泽光亮。

该菌株的最佳生长条件为：最适培养温度为37℃，高至42℃还可以生长；最适pH8.0，在7.5-12的碱性范围内均可生长，而在酸性条件下生长极慢。液体培养时接种量5％，转速为200rpm。培养8h左右进入对数期，32h后进入衰退期。

生化鉴定结果为：革兰氏染色阴性，凝胶液化阳性，绿脓菌素阳性。

该菌株具有表1所示的16s rDNA序列。序列分析显示该株与铜绿假单胞菌具有99％的同源性。

该菌株能够产生在酸性和碱性条件下均具有CMC活力的纤维素水解酶。所产酶的最适pH在酸性条件下为5.0，在碱性条件下8.6。

该菌株的最大产纤维素水解酶发酵时间是37℃，200rpm下摇瓶培养约60h。

本发明的特点和技术进步

1.新的纤维素酶产酶菌株

本发明首先发现和证实了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌株能够产生纤维素水解酶，这至今未见报道。

2.菌株能产生在酸性和碱性条件下均有活力的纤维素酶

至今所报道的微生物菌株大多只能产生酸性或碱性纤维素酶，本发明所提供的菌株能够产生在酸性和碱性条件下均具有活力的纤维素酶，对此至今尚未见报道。

附图说明

附图1：CCTCC No：M2010294铜绿假单胞菌PKC-001菌株的生长曲线。注培养基含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，121℃灭菌20min，用预先灭菌的10％(W/V)Na₂CO₃溶液调pH至8.0～9.0。培养条件：37℃，200rpm摇瓶培养；

附图2：CCTCC No：M2010294铜绿假单胞菌PKC-001菌株所产纤维素酶的最适作用pH。菌株用培养基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，121℃灭菌20min，用预先灭菌的10％(W/V)Na₂CO₃溶液调pH至8.0～9.0)在37℃，200rpm下摇瓶培养64小时，接种量5％，然后取发酵菌液按QB2583-2003的方法测定纤维素酶的CMC活力。测定温度为42℃。以1min水解CMC-Na底物产生1umol的葡萄糖残基为1个酶活单位；

附图3：CCTCC No：M2010294铜绿假单胞菌PKC-001菌株所产纤维素酶的最适作用温度。菌株用培养基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，121℃灭菌20min，用预先灭菌的10％(W/V)Na₂CO₃溶液调pH至8.0～9.0)在37℃，200rpm下培养64小时，接种量5％，取发酵菌液测定不同温度下的CMC酶活力和蛋白质含量。CMC酶活力按QB2583-2003的方法测定，pH为8.5，蛋白质含量用Braford方法测定，以1min水解CMC-Na底物产生1umol的葡萄糖残基为1个酶活单位；

附图4：CCTCC No：M2010294铜绿假单胞菌PKC-001菌株所产纤维素酶的时间曲线。注：菌株用培养基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，121℃灭菌20min，用预先灭菌的10％(W/V)Na₂CO₃溶液调pH至8.0～9.0)在37℃，200rpm 下摇瓶培养，接种量5％，定时取发酵菌液测定纤维素酶活力和蛋白含量。CMC酶活力按QB2583-2003的方法测定，pH为8.5，蛋白质含量用Braford方法测定，以1min水解CMC-Na底物产生1umol的葡萄糖残基为1个酶活单位；

附图5：CCTCC No：M2010294铜绿假单胞菌PKC-001菌株对外分泌蛋白的时间曲线。注：菌株用培养基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，121℃灭菌20min，用预先灭菌的10％(W/V)Na₂CO₃溶液调pH至8.0～9.0)在37℃，200rpm下摇瓶培养，接种量5％，定时取发酵菌液用Braford方法测定蛋白含量。

具体实施方式

1、菌株分离选育过程

分三步进行，采样、初筛、复筛和纯化。

1.1采样

从广西壮族自治区南宁市的造纸厂采集废弃纸浆；

1.2初筛

从采集的废纸浆中随机抽取约1g样品，浮于10ml无菌水中，充分振摇，静止30分钟，让残渣下沉，取上清液稀释10⁵倍，涂布接种琼脂平板初筛培养基(含蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，CMC-Na 10g/L，刚果红0.03g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，用预先灭菌的10％(W/V)Na₂CO₃溶液调pH至8.0～9.0)，37℃培养72h。挑取透明水解圈较大的菌落作进一步筛选。

1.3复筛和纯化

将初筛得到的菌落划线接种琼脂平板复筛培养基(除蛋白胨含量减少为5g/L，MgSO₄·7H₂O的含量增加为2g/L外，其余与上述初筛培养基相同)，37℃培养72h，挑选透明水解圈大且清晰、稳定的菌株，反复划线接种纯化5次。然后挑单菌落接种液体发酵培养基(同复筛培养基，不加刚果红和琼脂)，于37℃，200rpm下摇瓶培养24h，取发酵液测定碱性纤维素酶的活力，筛选得到1株产碱性纤维素酶的高产菌株，命名为PKC-001。

2、菌株的分类鉴定

2.1形态鉴定

将筛选得到的PKC-001菌株接种液体菌株培养基(同上述液体复筛培养基，不加CMC-Na和刚果红)，37℃，200rpm下摇瓶培养16h，显微镜下观察菌体的外观特征，用测微尺测量菌体细胞的大小。显示菌体细胞为短杆状，大小1.5μm×0.5μm，单生鞭毛，运动活跃。此外，菌体在筛选平板培养基上显示为扁平、边缘锯齿的圆形菌落，色泽光亮。

2.1生化鉴定

参照国标GB7918.4-1987，对PKC-001菌株进行凝胶化反应和绿脓菌素检验。

1)凝胶化检测：先将筛选得到的PKC-001菌株用上述液体菌株培养基在37℃，200rpm下培养16h，再转接一次，得到活化菌株。然后按国标GB7918.4-1987的方法取菌株培液穿刺接种明胶培养基(含牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，明胶120g/L，加热溶解，调pH至7.4，115℃灭菌20min，分装制成高层培养基)，37℃下培养24h，取出放入冰箱内30min。结果呈阳性反应，培养基被液化；

2)绿脓菌素检测：筛选得到的PKC-001菌株按上述活化，接种绿脓菌素检测培养基[含蛋白胨20g/L，氯化镁1.4g/L，硫酸钾10g/L，琼脂18g/L，甘油(化学纯)10g/L，加热溶解，调pH至7.4，115℃灭菌20min，制成斜面]，37℃培养24小时，向培养物加入3～5ml氯仿，待氯仿呈蓝色时，将氯仿转移到另一试管，加入1ml浓度为1N的盐酸，振摇2min。结果上层盐酸呈红紫色，表明反应呈阳性。

2.3分子鉴定

将PKC-001菌株同上活化后接种液态菌株培养基(同上)，接种量5％，37℃，200rpm下培养16h至对数期，菌株达到2×10⁸/ml以上。取培养液2ml，15000rpm×10min离心，弃上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次，收集菌体细胞，用液氮冷冻研磨破碎，用酚-氯仿法提取菌体的基因组DNA。以该DNA为模板，采用通用引物：BSF8/20：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(正向)；BSR1492/21：ACGGCTACCTTGTTACGACTT(反向)，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增菌体的16SrDNA序列，50ul的反应体系含PCR缓冲液5ul，正、反向引物各1uM，Mg²⁺2.5mM，各dNTP0.02mM，TaqDNA聚合酶1.25U。反应条件为：95℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，30cycles；最后72℃，10min。反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测、分离PCR产物，使用TaKaRa AgaroseGel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)试剂盒切胶回收扩增的目的片段，将目的片段连接到pMD-18T载体，将带有目的片段的pMD-18T载体通过转化E.coli DH5α菌株进行扩增后，测定载体上目的片段的序列，得到该菌株1501bp的16S rDNA序列。将序列在NCBI网站的Genbank核酸数据库进行同源序列比对搜索(Nucleitide-NucleitideBLAST)，结果表明，该菌株16SrDNA与Pseudomonas aeruginosa strain DQ1菌株的16s rDNA序列(GU269267.1)，Pseudomonas aeruginosa strain AS2菌株的16s rDNA序列(GU447228.1)具有99％的序列同源性(PKC-001的16SrDNA序列见附表)。

综合上述结果，鉴定所选育得到的产纤维素酶菌株PKC-001为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

3、菌株及其所产纤维素酶的特性

3.1菌株的生长特性

将PKC-001菌株接种液态菌株培养基(同上)，接种量5％，在不同条件下观察菌株的生长情况。结果表明，菌株的最适培养温度为37℃，高至42℃还可以生长；生长最适pH为8.0，在pH7.5-12的碱性范围内均可生长，而在酸性条件下生长极慢。200rpm摇床培养时，37℃下培养8h左右进入对数期，32h后进入衰退期(附图1)。

3.2菌株所产纤维素酶的最适作用pH

将PKC-001菌株按上述方法活化后接种产酶发酵培养基(同上述复筛培养基，不加刚果红和琼脂成分)，接种量5％，在37℃，200rpm下摇瓶培养64h，取菌液12000rpm离心10min，取上清在pH为6、7、8、8.5、9、10、11、12、13的缓冲条件下测定纤维素酶的活力，反应温度42℃，以1min水解CMC-Na底物产生1umol的葡萄糖残基为1个酶活单位。结果表明：PKC-001菌株所产的纤维素酶在酸性和碱性条件下均具有活力。酸性纤维素酶的最适pH为5.0，在pH4-6的范围内显示酶活力。碱性纤维素酶活力的最适pH为8.6，在pH7-11的范围内保持部分酶活(附图2)。

3.3菌株所产纤维素酶的最适作用温度

同上将将PKC-001菌株接种产酶发酵培养基(同上)，接种量5％，在37℃，200rpm下摇瓶培养64h，取菌液12000rpm离心10min，在pH8.6的条件下，以CMC-Na为底物，按国标GB(2583-2005)的方法测定菌株所产碱性纤维素酶在30、35、40、47.5、50、55、60℃的活性，结果表明在50℃下酶活力最高，反应温度从30℃上升至50℃，酶活力逐步上升，温度超过50℃后，酶活力迅速下降，温度为60℃的酶活力只有最高酶活的0.6％(附图3)。

3.4菌株的产酶时间

将PKC-001菌株同上活化后接种产酶发酵培养基(同上述复筛培养基，不加刚果红和琼脂)，接种量5％，于37℃下200rpm摇瓶培养，按国标QB2583-2003的方法，以CMC-Na为底物，在pH8.5的条件下测定发酵液的CMC酶活力，观察菌株的产酶情况，用Braford方法测定发酵液的蛋白浓度，观察菌株向外分泌蛋白的情况，结果表明该菌株在培养启动时即开始对外分泌蛋白，培养24h蛋白产量达到最高，此后发酵液的蛋白浓度基本保持不变。产酶方面，培养10h，菌株进入对数期后开始产生纤维素酶，培养24h后大量产酶，在培养66h发酵液的碱性纤维素酶活力达到最大值，随后迅速降低，培养到100h发酵液的酶活几乎为零(附图4、5)。

Claims

1.一种能产纤维素酶的微生物菌株，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，菌株号：PCK-001，真空冷冻保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo：M2010294，保藏日期：2010年11月8日。

2.权利要求1所述的能产纤维素酶的铜绿假单胞菌菌株，其特征为具有铜绿假单胞菌的典型特征，菌体细胞为短杆状，大小1.5μm×0.5μm，单生鞭毛，运动活跃，菌体在琼脂平板培养基上显示为扁平、边缘锯齿的圆形菌落，色泽光亮。其16srDNA序列具有所附序列所示的1501bp序列，Genbank核酸数据库所列的Pseudomonas aeruginosa strain DQ1菌株的16s rDNA序列(GU269267.1)，Pseudomonas aeruginosa strain AS2菌株的16s rDNA序列(GU447228.1)具有99％的序列同源性。

3.权利要求1所述的铜绿假单胞菌菌株，其特征在于最大产纤维素水解酶发酵条件是37℃，200rpm下摇瓶培养约60h。

4.权利要求1所述的菌株，其特征在于所发酵产生的碱性纤维素酶，最适反应温度为50℃，在30℃-55℃范围内保持35％以上的酶活。

5.权利要求1所述的铜绿假单胞菌菌株，其特征在于能够产生在酸性和碱性条件下均具有CMC活力的纤维素水解酶。所产酶的最适pH在酸性条件下为5.0，在碱性条件下为8.6。